張秋楠, 喻娟娟,2, 秦 智, 戴紹軍*

(1.上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234;2.東北林業(yè)大學(xué) 鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心,黑龍江 哈爾濱 150040)

0 引 言

一氧化氮(NO)參與植物種子萌發(fā)、根生長、氣孔運動、開花等多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié),在植物脅迫應(yīng)答過程中也具有重要作用[1].NO通過參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)S-亞硝基化、金屬亞硝基化和酪氨酸硝化等過程影響蛋白質(zhì)的功能.其中,蛋白質(zhì)S-亞硝基化是NO與蛋白質(zhì)半胱氨酸(Cys)殘基共價連接形成S-亞硝基硫醇(-SNO)的過程.蛋白質(zhì)S-亞硝基化會影響其結(jié)構(gòu)、活性、亞細(xì)胞定位,以及與其他蛋白質(zhì)相互作用等[2].

線粒體在依賴S-亞硝基化的NO信號通路中起關(guān)鍵作用.線粒體是腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成的重要場所,并參與凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo).線粒體中含有大量的硫醇和過渡金屬,為-SNO的生成提供了場所.此外,在線粒體豐富的膜系統(tǒng)中容易積累親脂性分子,如NO,因此成為植物中NO作用的主要靶細(xì)胞器.例如,NO可與復(fù)合物IV(細(xì)胞色素c氧化酶)的雙核CuB/血紅素a3位點結(jié)合,從而抑制該酶的活性[3].

迄今為止,研究者們應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、酸橙(Citrusaurantium)、芥菜(Brassicajuncea)和落地生根(Kalanchoepinnata)的葉片和幼苗應(yīng)答各種脅迫(如S-亞硝基谷胱甘肽(GSNO,細(xì)胞內(nèi)NO的主要存在形式)、H2O2、低溫、鹽和干旱脅迫)的S-亞硝基化蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析[4-13].其中,多種植物線粒體S-亞硝基化蛋白質(zhì)參與調(diào)控光呼吸、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、活性氧分子(ROS)穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)加工與周轉(zhuǎn),以及物質(zhì)代謝等過程.

1 S-亞硝基化調(diào)節(jié)光呼吸相關(guān)酶的活性

NO可通過調(diào)控線粒體光呼吸相關(guān)酶的活性來調(diào)節(jié)光呼吸代謝.在線粒體中,二分子甘氨酸(Gly)在甘氨酸脫羧酶復(fù)合體(GDC)和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)作用下生成絲氨酸(Ser).這一步可分為2個反應(yīng):一分子Gly可被GDC脫羧生成N5,N10-亞甲基四氫葉酸(m-THF),釋放CO2和NH3;另一分子Gly在SHMT作用下,與m-THF反應(yīng)生成Ser.GDC由含硫辛酰胺輔基的H蛋白,含磷酸吡哆醛輔基的P蛋白,含四氫葉酸的T蛋白和L蛋白組成.蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明:GDC-H蛋白在用物質(zhì)的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO[10]處理過的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中,發(fā)生S-亞硝基化修飾,并且在4 ℃下處理過的擬南芥葉片中亞硝基化程度增加(圖1)[12].PALMIERI等[3]發(fā)現(xiàn)在用物質(zhì)的量濃度為1 mmol·L-1GSNO處理過的擬南芥葉片中,GDC-H1、GDC-P1和GDC-P2這3個亞基都被鑒定為S-亞硝基化靶蛋白.此外,研究表明氧化還原劑可調(diào)節(jié)植物葉片和離體線粒體中的GDC活性,也證實NO可抑制GDC活性,并且該過程與GDC脫羧亞基的幾個Cys殘基的S-亞硝基化和谷胱甘肽化密切相關(guān).此外,GDC活性的抑制與擬南芥應(yīng)答細(xì)菌激發(fā)子超敏蛋白的相關(guān)反應(yīng)直接相關(guān),并且這種抑制能夠激活氧化還原應(yīng)答機制,從而引發(fā)線粒體紊亂和細(xì)胞死亡[3].該結(jié)果表明線粒體中的NO和ROS之間存在相互關(guān)聯(lián),并且在植物應(yīng)答脅迫過程中發(fā)揮重要作用.

在用物質(zhì)的量濃度為1 mmol·L-1GSNO處理過的擬南芥葉片中,SHMT也發(fā)生了S-亞硝基化修飾[3].由此可知,NO可通過調(diào)節(jié)GDC和SHMT的S-亞硝基化水平來影響Gly轉(zhuǎn)化為Ser的過程,進(jìn)而影響光呼吸代謝.

圖1 S-亞硝基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示的植物線粒體NO信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò).縮寫:CBS,胱硫醚β-合酶;Cpn,分子伴侶;DLDH,二氫硫辛酰胺脫氫酶;GDC,甘氨酸脫羧酶;GDH,谷氨酸脫氫酶;Hsp,熱激蛋白;IPMDH,3-異丙基蘋果酸脫水酶;MDH,蘋果酸脫氫酶;Mn-SOD,錳超氧化物歧化酶;Prx,過氧化物氧化還原酶;SDH,琥珀酸脫氫酶;SHMT,絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶;SUCA2,琥珀酰-CoA合成酶

2 S-亞硝基化修飾調(diào)控三羧酸循環(huán)

線粒體中的三羧酸循環(huán)能為植物生長發(fā)育和逆境應(yīng)答提供能量.在此過程中,草酰乙酸(OAA)與乙酰CoA結(jié)合,在一系列酶的催化作用下重新生成OAA,并釋放CO2和還原當(dāng)量(圖1).順烏頭酸酶(ACO)可催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕?蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),擬南芥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的ACO在經(jīng)物質(zhì)的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO處理后發(fā)生S-亞硝基化修飾[10].ACO是動物體內(nèi)主要的NO靶蛋白,動物細(xì)胞質(zhì)ACO可作為關(guān)鍵的氧化還原傳感器,還可被NO轉(zhuǎn)化為一種mRNA結(jié)合蛋白.與動物ACO類似,煙草(Nicotianatabacum)ACO的酶活性也可被NO所抑制,并且煙草細(xì)胞質(zhì)ACO(NtACO1)也可以通過IRP-1參與mRNA的結(jié)合,這說明植物與動物體內(nèi)的NO調(diào)控ACO功能的機制很相似[14].

琥珀酰-CoA合成酶(SUCA)能催化琥珀酰-CoA和琥珀酸的可逆反應(yīng),是三羧酸循環(huán)中唯一的底物磷酸化反應(yīng).琥珀酸脫氫酶(SDH)能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸.在NO過剩突變體(noe1)水稻植株中發(fā)現(xiàn),SUCA2發(fā)生亞硝基化修飾[9];在干旱處理4 d的敏感基因型小麥中,SDH的亞硝基化水平增加[7].

線粒體蘋果酸脫氫酶(MDH)能催化L-蘋果酸脫氫變成OAA,這也是三羧酸循環(huán)中的重要步驟.在GSNO處理的擬南芥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中,MDH發(fā)生S-亞硝基化修飾[3,10];在noe1水稻植株中,MDH的S-亞硝基化程度也增加[9].NO供體可抑制MDH的活性[11].這表明:NO導(dǎo)致MDH發(fā)生S-亞硝基化,從而抑制MDH的活性.由此可見,三羧酸循環(huán)相關(guān)酶的S-亞硝基化可能影響相關(guān)反應(yīng)中間物的生成,從而調(diào)控能量代謝以應(yīng)答逆境.

3 S-亞硝基化影響氧化磷酸化過程

植物細(xì)胞代謝時所脫下來的氫可由線粒體呼吸鏈傳遞并釋放能量,同時偶聯(lián)驅(qū)動ATP合成酶生成ATP,為植物生長發(fā)育提供能量.線粒體氧化呼吸鏈中的鐵硫蛋白和NAD(P)H泛醌氧化還原酶分別在水稻noe1突變體和干旱處理4 d的小麥中發(fā)生S-亞硝基化修飾.在用物質(zhì)的量濃度為1 mmol·L-1的GSNO處理后的擬南芥葉片[3]和低溫處理4 h的擬南芥幼苗中[12],線粒體ATP合成酶α亞基的S-亞硝基化程度增加;在干旱處理4 d的小麥植株[7]和低溫處理4 h的擬南芥幼苗中[12],ATP合成酶β亞基的亞硝基化水平也上升.此外,植物線粒體ATP合成酶α和β亞基在硫氧還蛋白(Trx)互作蛋白質(zhì)組學(xué)研究中都被鑒定為Trx靶蛋白[15].這表明:線粒體ATP合成酶的功能受其亞基的氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié).

4 S-亞硝基化調(diào)控ROS穩(wěn)態(tài)

植物線粒體中的錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)酶和Trx/過氧化物氧化還原酶(Prx)系統(tǒng)相關(guān)酶等對于維持ROS穩(wěn)態(tài)具有重要作用.SOD是植物細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,可催化超氧陰離子自由基(O2?-)歧化生成過氧化氫(H2O2),從而有效降低細(xì)胞內(nèi)O2?-過量積累所造成的傷害.Mn-SOD是一種活性中心含錳金屬輔基的SOD,在保護(hù)線粒體免受O2?-損傷的過程中發(fā)揮重要作用.在經(jīng)NO供體硝普鈉(SNP)預(yù)處理后再經(jīng)物質(zhì)的量濃度為150 mmol·L-1的NaCl處理16 d的酸橙葉片中,Mn-SOD的亞硝基化水平增加[16].

Prx是一種巰基依賴性非血紅素過氧化物酶,可解毒多種不同類型的過氧化物(如H2O2),對線粒體內(nèi)的氧化還原平衡穩(wěn)態(tài)起重要作用.研究發(fā)現(xiàn):在用物質(zhì)的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO處理后的擬南芥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中,線粒體Prx IIF發(fā)生S-亞硝基化修飾[10].與此類似,在丁香假單胞菌(Pseudomonassyringaepv.tomato,PST)侵染擬南芥時,葉綠體Prx IIE的S-亞硝基化水平上升[13].此外,Prx IIE具有ONOO-還原酶活性,其Cys121的體外S-亞硝基化可導(dǎo)致該酶活性喪失.Prx IIE的S-亞硝基化可導(dǎo)致蛋白質(zhì)酪氨酸硝化的增加,這表明Prx IIE在控制植物ONOO-內(nèi)源水平的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17].

5 S-亞硝基化調(diào)控蛋白質(zhì)加工與周轉(zhuǎn)

維持蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象,防止錯誤折疊蛋白質(zhì)的聚集,對于植物在逆境脅迫條件下的存活至關(guān)重要.分子伴侶(Cpn)和熱激蛋白(Hsp)有利于穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜系統(tǒng),促進(jìn)蛋白質(zhì)的重新折疊,并防止蛋白質(zhì)的聚集[18].蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)多種Cpn和Hsp的S-亞硝基化水平在脅迫條件下發(fā)生變化.在經(jīng)物質(zhì)的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO處理后的擬南芥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中,Cpn10和Hsp60發(fā)生S-亞硝基化修飾[10].此外,在GSNO處理的落地生根(Kalanchoepinnata)葉片中,Hsp90的亞硝基化水平增加[5].這表明S-亞硝基化可能通過調(diào)節(jié)Cpn和Hsp的結(jié)構(gòu)與功能應(yīng)答逆境脅迫.

6 S-亞硝基化影響多種物質(zhì)代謝

植物線粒體的谷氨酸脫氫酶(GDH)催化α-酮戊二酸與NH4+合成谷氨酸,這是除谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶循環(huán)途徑之外的另一種NH4+同化途徑.植物逆境應(yīng)答與衰老過程中,體內(nèi)容易積累過量的NH4+,GDH可在緩解植物NH4+中毒過程中發(fā)揮作用.在用物質(zhì)的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO處理后的擬南芥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中,GDH2的S-亞硝基化水平增加[10].此外,在Pst侵染24 h的耐性基因型(PtoR)番茄(Solanumlycopersicum)中,GDH的氧化水平升高[19].GDH也被鑒定為Trx和谷氧還蛋白(Grx)靶蛋白[15,20].這些意味著NO可能通過調(diào)控GDH的氧化還原狀態(tài),調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的NH4+穩(wěn)態(tài).

3-異丙基蘋果酸脫水酶(IPMDH)可催化亮氨酸生物合成中的氧化脫羧步驟和硫代葡萄糖苷的甲硫氨酸鏈延長.水稻noe1突變體中IPMDH2的S-亞硝基化程度增加.IPMDH已被報道為氧化還原調(diào)節(jié)酶,番茄抗性品種和油菜保衛(wèi)細(xì)胞中的IPMDH1,以及擬南芥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的IPMDH2在應(yīng)答Pst、茉莉酸甲酯和H2O2處理時氧化水平分別上升[19,21].油菜和擬南芥中IPMDH1的活性受氧化劑(如H2O2和CuCl2)和還原劑(如二硫蘇糖醇(DTT)和Trxm)的調(diào)節(jié),且還原型IPMDH1的活性更高[21].這表明:IPMDH的功能可能受氧化還原系統(tǒng)的調(diào)節(jié).

二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLDH)屬于黃素蛋白氧化還原家族,是組成線粒體基質(zhì)中的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、支鏈氨基酸-脫氫酶復(fù)合物,以及GDC的必需組成成分.研究發(fā)現(xiàn):在GSNO處理的擬南芥[3]和馬鈴薯(Solanumtuberosum)葉片中[8],以及應(yīng)答NaCl脅迫的擬南芥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞[6]和低溫處理的擬南芥幼苗中[12],DLDH1和DLDH2的S-亞硝基化水平均上升.這表明NO通過調(diào)節(jié)DLDH的S-亞硝基化水平影響其功能.

胱硫醚β-合酶(CBS)參與轉(zhuǎn)硫代謝,可催化絲氨酸和同型半胱氨酸合成胱硫醚.在用物質(zhì)的量濃度為250 mmol·L-1的GSNO處理后的擬南芥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中,CBS發(fā)生S-亞硝基化修飾[10].這表明NO可通過調(diào)節(jié)代謝過程關(guān)鍵酶的S-亞硝基化水平,從而影響代謝物的生物合成過程.

7 結(jié) 語

蛋白質(zhì)S-亞硝基化修飾在植物線粒體中發(fā)揮了重要作用.蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了植物線粒體中多種S-亞硝基化蛋白,它們參與線粒體中光呼吸、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、ROS穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)加工與周轉(zhuǎn),以及物質(zhì)代謝等過程(圖1).這表明NO可通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的S-亞硝基化水平調(diào)控多種信號與代謝途徑.今后,隨著蛋白質(zhì)S-亞硝基化鑒定技術(shù)的發(fā)展,可以開展S-亞硝基化蛋白的定量分析,為理解植物體內(nèi)NO調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供更有價值的信息.