彭湘蓮 付紅軍 劉微微

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，長(zhǎng)沙 410004)(稻谷及副產(chǎn)物深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室2，長(zhǎng)沙 410004)

山蒼子(Litseacubeba) 別名山雞椒，屬于樟科木姜子屬植物，在我國(guó)廣泛種植，主要分布于湖南、湖北、江西、浙江、福建、云南等地[1]。山蒼子油是從山蒼子果實(shí)或其他組織中提取出來(lái)黃色油狀液體，由于產(chǎn)地地理?xiàng)l件的差異導(dǎo)致其成分會(huì)有所不同。山蒼子油中的活性成分主要有檸檬醛、D-檸檬烯、馬鞭烯、芳樟醇、香葉醇、香茅醇等成分，其中抑菌效果較好的為檸檬醛[2]。

研究表明，山蒼子油具有一定的抑菌活性，其對(duì)大部分的真菌和細(xì)菌具有一定的抑制或滅殺作用[3-4]。余伯良等[5]采用平板法研究山蒼子油對(duì)花生醬的防霉保鮮效果，結(jié)果表明當(dāng)培養(yǎng)基 pH 5.5時(shí)，山蒼子油對(duì)多數(shù)霉菌的最低抑菌濃度為1.77 mg/mL。李文茹等[6]使用了平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行山蒼子精油的抑菌實(shí)驗(yàn)，山蒼子精油對(duì)黑曲霉和繩狀青霉的最低抑菌濃度分別為0.125%和0.25%，山蒼子精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為0.125%。吳均等[7]采用抑菌圈實(shí)驗(yàn)對(duì)山蒼子油的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定。5%的山蒼子油在含有金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基中有抑菌圈生成，而在含有大腸桿菌的培養(yǎng)基中未出現(xiàn)抑菌圈。

目前我國(guó)對(duì)于山蒼子油的用途主要為食用香料，由于其無(wú)毒且有顯著的抑菌效果，使得在食品防腐保鮮領(lǐng)域備受青睞。本實(shí)驗(yàn)選用湘西永順產(chǎn)山蒼子果實(shí)，采用水蒸氣蒸餾法[8]提取山蒼子精油，利用氣相色譜-質(zhì)譜法分析山蒼子精油的化學(xué)成分，選取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉、青霉4種菌種為代表菌種，通過(guò)測(cè)定平板菌落計(jì)數(shù)、最低抑菌濃度、熱處理影響以及pH值影響來(lái)測(cè)定山蒼子精油的抑菌活性，為山蒼子精油的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

新鮮山蒼子果實(shí)(采自湖南省湘西永順土家族苗族自治州)；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂、Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；其他試劑均為分析純。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉、青霉(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Clarcus 600 GC-MS聯(lián)用儀；WK-10B高能性中藥粉碎機(jī)；MJ-54A型高壓蒸汽滅菌鍋；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法提取山蒼子精油

將山蒼子果實(shí)陰干后粉碎后過(guò)20目篩，密封保存于冰箱備用。稱(chēng)取50 g粉末樣品置于1 000 mL圓底燒瓶中，并加500 mL蒸餾水，用電熱套進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取直至無(wú)揮發(fā)油產(chǎn)生，用石油醚收集油層，待石油醚揮發(fā)后稱(chēng)量。按《中國(guó)藥典》2010 版一部附錄 XD 揮發(fā)油測(cè)定法測(cè)定山蒼子干果中山蒼子精油含量，平行測(cè)定 3 次，取平均值，并將山蒼子精油置于冰箱保存，用于后續(xù)GC-MS分析和抑菌活性測(cè)定。

1.2.2 山蒼子精油的成分分析(GC-MS)

采用美國(guó)Perkin Elmer公司Clarcus 600氣質(zhì)聯(lián)用分析儀。GC條件：色譜柱為Elite-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序: 80 ℃保持3 min，5 ℃/min升溫至100 ℃，保持1 min， 10 ℃/min升溫至130 ℃，保持3 min，20 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min； 載氣為高純氦氣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL；分流比50∶1。MS條件：電子轟擊離子源進(jìn)樣方式；電離電壓70 eV；離子源溫度240 ℃；傳輸線溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z35～500。山蒼子精油的GC-MS定量分析采用峰面積歸一化法，化合物定性采用NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)[9]。

1.2.3 菌種的活化及菌懸液的制備

配制適量培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌之后倒于無(wú)菌培養(yǎng)皿之中，待冷卻凝固后，將大腸桿菌接種在結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂平板上，將金黃色葡萄球菌接種在Baird-Parker瓊脂平板上，34 ℃培養(yǎng) 24 h；將白曲霉、青霉2種霉菌轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面中活化，28 ℃培養(yǎng) 48 h。挑取少量菌落于無(wú)菌生理鹽水中，細(xì)菌采用平板計(jì)數(shù)法，霉菌使用顯微鏡直接記數(shù)法測(cè)菌體個(gè)數(shù)，將菌懸液濃度調(diào)至 106～107CFU/mL，備用。

1.2.4 平板菌落計(jì)數(shù)法

1 mL山蒼子精油加10 mL無(wú)菌培養(yǎng)基混勻冷卻，1 mL丙三醇加10 mL無(wú)菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照；冷卻后取200 μL菌懸液涂布于平板培養(yǎng)基上，按1.2.3的條件進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)菌種做3組平行，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.5 最小抑菌濃度的測(cè)定

采用二倍稀釋法，配制一系列梯度濃度的山蒼子精油丙三醇溶液，與熔融的培養(yǎng)基混勻，使得培養(yǎng)基中山蒼子精油的濃度分別為30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0.23、0.11 μL/mL；待培養(yǎng)基凝固后，用移液槍吸取 200 μL菌懸液，均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面[7]。以不長(zhǎng)菌時(shí)的山蒼子精油的體積濃度來(lái)確定山蒼子精油抑菌的最低體積濃度為山蒼子精油的MIC值，以丙三醇-無(wú)菌水作對(duì)照。

1.2.6 熱處理對(duì)山蒼子精油抑菌活性的影響

將山蒼子精油分別于40、60、80、100 ℃下熱處理10 min，取出后立刻置于冰浴中冷卻待用；10 mL含1/2 MIC山蒼子精油濃度的無(wú)菌培養(yǎng)基冷卻待用；待培養(yǎng)基冷卻后，取200 μL菌懸液均勻涂布在平板上，以等量無(wú)菌水涂布作為空白對(duì)照，按1.2.3的條件進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)菌種做3組平行取均值。

1.2.7 pH值對(duì)山蒼子精油抑菌活性的影響

利用磷酸緩沖液來(lái)調(diào)制不同pH值的培養(yǎng)基，pH值梯度濃度分別為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5；山蒼子精油與無(wú)菌培養(yǎng)基混勻使得培養(yǎng)基中山蒼子精油的濃度為1/2 MIC，冷卻后取200 μL菌懸液均勻涂布在平板上，以等量無(wú)菌水涂布作為空白對(duì)照，按1.2.3的條件進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)菌種做3組平行取均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 山蒼子精油的含量

按1.2.1進(jìn)行水蒸氣蒸餾測(cè)得山蒼子干果粉末中山蒼子精油平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.28%。

2.2 山蒼子精油的主要成分

水蒸氣蒸餾法提取得到的山蒼子精油利用GC-MS法進(jìn)行成分分析，其TIC見(jiàn)圖1，主要化學(xué)成分鑒定出23種物質(zhì)詳見(jiàn)表1，其中檸檬醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.07%(橙花醛38.57%；香葉醛35.50%)，高于贛南產(chǎn)山蒼子油的68.43%[10]。

圖1 水蒸氣蒸餾法提取的山蒼子精油的TIC

表1 湘西永順產(chǎn)山蒼子精油的化學(xué)成分

序號(hào)化合物名稱(chēng)分子式質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%1α-蒎烯C10H161.152莰烯C10H160.473檜烯C10H160.414β-蒎烯C10H160.8056-甲基-5庚烯-2酮C8H14O1.146β-月桂烯C10H161.517檸檬烯C10H166.528桉樹(shù)腦C10H18O1.419芳樟醇C10H18O1.76105-甲基-2-異丙烯基-4-己烯醛C10H16O0.2511香茅醛C10H18O2.2012龍腦C10H18O0.0813α-松油醇C10H18O0.63141,3,4-三甲基-3-環(huán)己烯基1-甲醛C10H16O1.2015橙花醇C10H18O0.7016橙花醛C10H16O38.5717香葉醇C10H18O1.0118香葉醛C10H16O35.50193,7-二甲基-2,3-環(huán)氧基-6-辛烯醇C10H18O20.1820β-欖香烯C15H240.32211-石竹烯C15H241.1522α-丁子香烯C15H240.1823氧化石竹烯C15H24O0.32其他2.54

2.3 平板計(jì)數(shù)的結(jié)果與分析

山蒼子精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉和青霉的抑菌活性如表2所示。結(jié)果表明，添加了丙三醇的平板培養(yǎng)基上，4種菌都長(zhǎng)出了菌落，且生長(zhǎng)情況良好；而添加了山蒼子精油的平板培養(yǎng)基上均未有菌落生長(zhǎng)，可見(jiàn)山蒼子精油對(duì)4種菌都表現(xiàn)出了有效的抑制作用。

表2 山蒼子精油的抗菌活性

注：“+”表示平板上有菌落生長(zhǎng)，“—”表示平板上未長(zhǎng)出菌落。

2.4 山蒼子精油最低抑菌濃度的結(jié)果與分析

山蒼子精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉和青霉的最低抑菌濃度(MIC)如表3所示。

山蒼子精油對(duì)霉菌抑菌效果優(yōu)于細(xì)菌。山蒼子精油對(duì)青霉、白曲霉的最小抑菌濃度(MIC)分別為0.47、0.94 μL/mL，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC) 分別為1.88、0.94 μL/mL，對(duì)細(xì)菌的抑菌結(jié)果與吳均等[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有些許差異，可能由于山蒼子精油中檸檬醛含量差異所致。

表3 山蒼子精油對(duì)霉菌和細(xì)菌最低抑菌濃度

注：“+”表示平板上有菌落生長(zhǎng)，“—”表示平板上未長(zhǎng)出菌落。

2.5 熱處理對(duì)山蒼子精油抑菌活性的影響

不同溫度熱處理后的山蒼子精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉、青霉4種菌的抑菌活性如表4所示。

表4 不同溫度處理后山蒼子精油對(duì)實(shí)驗(yàn)菌種菌落數(shù)的影響/個(gè)

從表4可以看出，當(dāng)熱處理溫度在40～60 ℃區(qū)間時(shí)，溫度對(duì)山蒼子精油抗菌活性影響不大，而熱處理溫度在60～100 ℃區(qū)間時(shí)，溫度升高使山蒼子精油中有效抑菌活性物質(zhì)揮發(fā)或發(fā)生裂解，導(dǎo)致山蒼子精油抑菌活性有所下降。

2.6 pH值對(duì)山蒼子精油抑菌活性的影響

不同pH值條件下山蒼子精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉、青霉4種菌的抑菌活性如表5所示。

表5 不同pH值條件下山蒼子精油對(duì)對(duì)實(shí)驗(yàn)菌種菌落數(shù)的影響/個(gè)

由表5可知，在pH值為3.5～7.5的條件下，山蒼子精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響較大，pH值越小山蒼子精油的抑菌效果越好；但對(duì)白曲霉和青霉而言，不同pH值對(duì)山蒼子精油的抑菌活性影響不大，可能是霉菌相對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō)更易在酸性環(huán)境下生存。由此可知當(dāng)pH值在3.5～7.5的范圍內(nèi)， pH值越小山蒼子精油抑菌效果越好，而pH值對(duì)山蒼子精油抑霉菌活性影響不大。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法對(duì)湘西永順產(chǎn)的新鮮山蒼子果實(shí)進(jìn)行提取，其山蒼子精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.28%。利用氣相色譜-質(zhì)譜法分析鑒定出湘西永順產(chǎn)山蒼子精油的主要化學(xué)成分有23種，其中檸檬醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為74.07%(橙花醛：38.57%；香葉醛：35.50%)。山蒼子精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白曲霉、青霉4種菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為1.88、0.94、0.94、0.47 μL/mL。山蒼子精油能抑制細(xì)菌和霉菌的生長(zhǎng)。當(dāng)熱處理溫度在40～100 ℃區(qū)間時(shí)，溫度導(dǎo)致山蒼子精油的抑菌活性有所下降；當(dāng)pH值在3.5～7.5內(nèi)，pH值越小山蒼子精油的抑菌效果越好，而pH值對(duì)山蒼子精油抑霉菌活性的影響不大，具體抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步探討。