氟西汀對(duì)抑郁大鼠治療的作用機(jī)制*

侯杰 沈忠飛 郭燕君 張小芬

(嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314000)

抑郁癥臨床表現(xiàn)為情緒消沉，興趣減退，悲觀絕望，思維遲緩和意志活動(dòng)減退，多合并其它疾病，且易反復(fù)發(fā)作[1]。導(dǎo)致其社會(huì)功能、職業(yè)功能下降，給患者家庭、社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，所以抑郁癥的治療一直是全世界關(guān)注的重點(diǎn)。

雖然抑郁癥的治療方法很多，近幾年抑郁癥治療的熱點(diǎn)，主要是定向作用于海馬神經(jīng)元突觸重塑[2]，而突觸重塑與SYP和PSD-95的關(guān)系密切。研究表明，氟西汀治療抑郁癥時(shí)，突觸重塑關(guān)鍵蛋白SYP和PSD-95有明顯變化[3]，但其具體機(jī)制尚不明確。但抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。為了對(duì)抑郁癥的發(fā)病機(jī)制有初步的認(rèn)識(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用慢性溫和性不可預(yù)知應(yīng)激刺激加孤養(yǎng)法建立大鼠抑郁模型[4]，在建立大鼠抑郁模型成功的基礎(chǔ)上，對(duì)抑郁癥大鼠進(jìn)行氟西汀治療，結(jié)果顯示：經(jīng)過28天CUMS干預(yù)后大鼠在體重、糖水消耗、曠場(chǎng)試驗(yàn)的活動(dòng)次數(shù)比正常組明顯減少，糞便顆數(shù)明顯增多，中段停留時(shí)間和總路程明顯少于正常組，表明大鼠興趣喪失、快感缺失等，氟西汀治療后這些癥狀均明顯改變，表明已經(jīng)成功造模。

然后再通過HE染色及蛋白印記實(shí)驗(yàn)和RT-PCR檢測(cè)氟西汀治療后大鼠海馬突觸可塑性關(guān)鍵蛋白SYP和PSD-95蛋白及mRNA的表達(dá)情況，以探討氟西汀對(duì)抑郁發(fā)生的信號(hào)通路調(diào)控作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物和藥物

健康雄性SD大鼠30只，體重180～220 g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鹽酸氟西汀(Fluoxetine)分散片(美國(guó)禮來公司，中國(guó)蘇州制藥有限公司分裝)。30只清潔級(jí)雄性健康 SD大鼠按體重隨機(jī)分為3組，每組10只：正常組；模型組：CUMS刺激；氟西汀組：氟西汀10 mg·kg-1，1次/d，連續(xù)28 d，按體重給藥灌胃；對(duì)照組和模型組給予生理鹽水灌胃。

1.1.2 試劑與儀器

兔抗鼠SYP、PSD-95多克隆抗體(Proteintech，美國(guó))；兔抗鼠β-actin、山羊抗兔二抗(北京中杉金橋)；總RNA小量制備試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物)；2× Easy TaqPCR SuperMix，TransScript TM Green Two Step qRT-PCR SuperMix，Trans DNA Marker I(北京全式金生物)；動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè)和分析系統(tǒng)SuperMaze-XR-XM101(上海欣軟信息科技)。

1.2 方法

1.2.1 CUMS大鼠模型建立

健康成年雄性清潔級(jí)SD，適應(yīng)性單籠飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常組和模型組，每組10只。正常組大鼠每天抓取一次，除外不做任何特殊處理。模型組給予慢性溫和性不可預(yù)知性刺激，刺激包括9種：潮濕墊料24 h，行為限制2 h，禁食24 h，禁水24 h，4℃冰水強(qiáng)迫游泳5 min，晝夜顛倒24 h，噪聲干擾12 h，懸尾30 min，足底電擊5 s(30 v)。每日隨機(jī)抽取一種不連續(xù)出現(xiàn)的同種刺激，使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，持續(xù)28 d，建立大鼠抑郁模型。

1.2.2 行為學(xué)測(cè)定及動(dòng)物取材

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open field test，OFT)和糖水消耗試驗(yàn)(Sucrose preference test，SPT)[5]的具體操作步驟如下。OFT：造模前1 d以及造模后第7、14、21、28 d分別置大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱的中央格，觀察5 min內(nèi)的活動(dòng)情況。觀察指標(biāo)：爬行總穿格數(shù)、中央格停留時(shí)間、糞便顆數(shù)和直立次數(shù)等。其中爬行總穿格數(shù)反映大鼠肢體活動(dòng)性，中央格停留時(shí)間及糞便顆數(shù)反映大鼠的焦慮水平，直立次數(shù)反應(yīng)大鼠的探索能力。SPT：試驗(yàn)前，在隔噪音、安靜的房間內(nèi)，訓(xùn)練動(dòng)物適應(yīng)含糖飲水，每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶，第一個(gè)24 h，兩瓶均裝有1%蔗糖水，隨后的24 h，一個(gè)瓶裝1%蔗糖水，一個(gè)瓶裝純水。23 h的禁食禁水后，進(jìn)行動(dòng)物的基礎(chǔ)糖水/純水消耗試驗(yàn)，同時(shí)給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水：一瓶1%蔗糖水，一瓶純水。60 min后，取走兩瓶并稱重。計(jì)算動(dòng)物的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗、糖水偏愛(糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%)。大鼠麻醉斷頭，冰上取腦分離海馬，液氮保存后于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 組織學(xué)檢測(cè)

取海馬組織，制作冰凍切片，HE染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)目改變。

1.2.4Western blot檢測(cè)CUMS大鼠海馬中SYP和PSD-95蛋白的表達(dá)水平

取大鼠新鮮海馬組織，常規(guī)提取組織蛋白。配置SDS-PAGE凝膠濃度12%，蛋白樣品處理上樣電泳(先100 v，20 min；再180 v，40 min)，轉(zhuǎn)膜(100 v，120 min)，5% 脫脂牛奶封閉1 h，孵一抗(SYP 1∶500、PSD-95 1∶500和β-actin抗體1∶1000，4℃過夜)，TBST洗一抗(5 min·次-1，3次)，孵二抗(羊抗兔，37℃，2 h)，TBST洗二抗(5 min·次-1，4次)，ECL試劑盒曝光顯色。

1.2.5RT-PCR 檢測(cè)CUMS大鼠海馬中SYP和PSD-95mRNA的表達(dá)

取大鼠海馬，按RNA提取試劑盒說明提取海馬總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。據(jù)NCBI Genebank中大鼠基因序列設(shè)計(jì)引物如下表：

表3 PCR引物序列

PCR反應(yīng)體系：模版1 μL，2xPCRmix 5 μL，上下游引物各0.5μL，雙蒸水3 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，PSD-95 65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min ；95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，SYP 51℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min ；95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，β-actin 50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，產(chǎn)物4℃保存。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體重，曠場(chǎng)試驗(yàn)和糖水消耗的比較

與正常組比較，模型組大鼠體重、糖水消耗、曠場(chǎng)試驗(yàn)的活動(dòng)次數(shù)比正常組明顯減少，糞便顆數(shù)明顯增多，中段停留時(shí)間和總路程明顯少于正常組。與模型組相比，氟西汀組大鼠體重、糖水消耗、曠場(chǎng)試驗(yàn)的活動(dòng)次數(shù)比正常組明顯增加，糞便顆數(shù)明顯減少，中段停留時(shí)間和總路程明顯多于模型組(P<0.05)，見表1。與對(duì)照組比較，模型組所有時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)評(píng)分升高(P<0.05)。與模型組比較，氟西汀組各時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)評(píng)分降低(P<0.05)，見表2。

表1 氟西汀對(duì)CUMS大鼠體重、曠場(chǎng)試驗(yàn)和糖水消耗的影響

注：與正常組相比，△P<0.05；與模型組相比，○P<0.05。

表2 各時(shí)間點(diǎn)3組行為學(xué)評(píng)分比較(分，

注：與模型組相比，△P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組相比，○P<0.01。

2.2 海馬神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)目比較

正常組大鼠海馬神經(jīng)錐體細(xì)胞層數(shù)多且厚，神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊、緊密，結(jié)構(gòu)清晰，染色均勻，核大而圓，胞漿內(nèi)富含尼氏體，細(xì)胞間分界清楚(如圖1A箭頭所示)；模型組大鼠海馬錐體細(xì)胞層變薄，胞體腫脹，核固縮，神經(jīng)元排列紊亂、疏松，斷裂明顯，間隙擴(kuò)大，胞漿尼氏體較對(duì)照組明顯減少，甚至有大量神經(jīng)元缺失、壞死(如圖1B箭頭所示)；氟西汀組大鼠海馬錐體細(xì)胞形態(tài)、神經(jīng)元缺失和胞漿尼氏體減少程度均相對(duì)較輕，與正常對(duì)照組大鼠海馬錐體細(xì)胞無明顯變化(如圖1C箭頭所示)。

圖1 HE染色各組海馬神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)目比較(×100)注： A正常組；B模型組；C氟西汀箭頭所指為典型細(xì)胞。

2.3 Western blot檢測(cè)CUMS大鼠海馬中SYP和PSD-95蛋白表達(dá)水平

結(jié)果顯示，CUMS大鼠海馬中PSD-95蛋白表達(dá)比正常組大鼠顯著增多(P<0.01)；氟西汀可明顯降低海馬中PSD-95蛋白的表達(dá)(P<0.01)。與正常組相比，模型組大鼠海馬中SYP蛋白表達(dá)比正常組明顯減低(P<0.01)；氟西汀組大鼠海馬中SYP蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.01)見圖4。

圖2 氟西汀對(duì)CUMS大鼠海馬中SYP和PSD-95蛋白表達(dá)的影響注：1：正常組；2：實(shí)驗(yàn)組；3：氟西汀10 mg·kg-1。A-PSD-95代表性Western blotting圖；B-PSD-95蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C-SYP代表性Western blotting圖；D-SYP蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2.4 RT-PCR檢測(cè)CUMS大鼠海馬中SYP和PSD-95 mRNA表達(dá)水平

與正常組相比，模型組大鼠海馬PSD-95 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.0l)；SYP mRNA表達(dá)較正常組顯著降低(P<0.O1)；氟西汀作用后能夠逆轉(zhuǎn)CUMS大鼠海馬中PSD-95和SYP mRNA的表達(dá)，見圖3。

圖3 氟西汀對(duì)CUMS大鼠海馬中SYP和PSD-95 mRNA表達(dá)的影響注：1：正常組；2：實(shí)驗(yàn)組；3：氟西汀10 mg·kg-1。A-PSD-95 mRNA、SYP mRNA代表性RT-PCR圖；B-PSD-95 mRNA表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C-SYP mRNA表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

3 討論

抑郁癥是全球范圍內(nèi)的常見疾病，WHO官方發(fā)布全球抑郁癥患者已達(dá)3.22億人，2005年至2015年間患者數(shù)量增加了18.4%。抑郁癥是世界范圍內(nèi)的首要致殘?jiān)?，也是?dǎo)致全球總體疾病負(fù)擔(dān)的重大因素。抑郁癥發(fā)病與CUMS密切相關(guān)[6]，CUMS可以造成人及大鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷和可再生能力降低，即海馬神經(jīng)元突觸重塑。其次，氟西汀在治療抑郁癥時(shí)，常伴有神經(jīng)元突觸重塑相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。表明神經(jīng)元突觸重塑在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中可能起到關(guān)鍵作用[6-8]。

突觸素(Synaptophysin，SYP)是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性調(diào)節(jié)密切相關(guān)的突觸前膜囊泡蛋白[9]。抑郁癥中SYP的表達(dá)異常[10,11]。而且，CUMS和抑郁癥均可表現(xiàn)出海馬神經(jīng)元突觸的萎縮和SYP的表達(dá)下調(diào)，而氟西汀可使SYP的表達(dá)升高[12,13,14]。突觸后致密蛋白-95( PSD-95)是位于谷氨酸能神經(jīng)的突觸后致密蛋白(postsynaptic densities PSDs)家族中的一種膜相關(guān)蛋白，在突觸可塑性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[11,15]。而且，抑郁癥會(huì)表現(xiàn)出PSD-95的表達(dá)異常[16-20]。所以，SYP與PSD-95作為突觸的特異性標(biāo)志物及突觸核心構(gòu)建蛋白，在維持突觸正常功能和可塑性方面具有重要作用的同時(shí)、也是抑郁癥藥物干預(yù)的重要靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠抑郁模型成功的基礎(chǔ)上，對(duì)抑郁癥大鼠進(jìn)行氟西汀治療，結(jié)果顯示：經(jīng)過28天CUMS干預(yù)后大鼠在體重、糖水消耗、曠場(chǎng)試驗(yàn)的活動(dòng)次數(shù)比正常組明顯減少，糞便顆數(shù)明顯增多，中段停留時(shí)間和總路程明顯少于正常組，表明大鼠興趣喪失、快感缺失等，氟西汀治療后這些癥狀均明顯改變。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CUMS大鼠海馬腦區(qū)SYP蛋白及mRNA表達(dá)水平較正常組顯著降低，氟西汀治療后大鼠海馬區(qū)SYP蛋白水平升高。同樣，CUMS大鼠海馬腦區(qū)PSD-95蛋白和mRNA水平表達(dá)升高，氟西汀治療后PSD-95蛋白和mRNA水平表達(dá)降低。所以，我們推測(cè)氟西汀抗大鼠CUMS抑郁作用的機(jī)制，可能是通過調(diào)控PSD-95及SYP的表達(dá)來緩解抑郁癥狀，改變神經(jīng)元突觸重塑，詳細(xì)的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。