尹玉偉，代 靜，茆安婷，馬世宏，郭曦堯，張林波，李月紅

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長春130118；2.內(nèi)蒙古烏蘭察布市獸醫(yī)監(jiān)察所,內(nèi)蒙古 烏蘭察布012000)

1987 年,Ishino[1]等人在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一個串聯(lián)間隔重復(fù)序列,但這些序列的生物學(xué)意義尚不清楚。隨后,Mojica[2]等人發(fā)現(xiàn)了類型的重復(fù)序列,即規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列。2002 年,Jansed[3]等將其命名為CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)。到2012 年科學(xué)家開發(fā)利用CRISPR[4],使其成為生物醫(yī)學(xué)史上第一種可高效、精確、程序化的修改細(xì)胞基因組包括人類基因組的工具。CRISPR 存在于90%的古細(xì)菌及40%的細(xì)菌中[5]。CRISPR/Cas9 是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期選擇壓力中形成的一種適應(yīng)性免疫防御,可用來有效抵御病毒及外源DNA 的入侵。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以識別出外源DNA,并將它們剪斷,沉默外源基因的表達(dá),利用細(xì)胞的非同源性末端(Non-homologous end joining,NHEJ)連接或同源重組(Homologous recombination,HR)修復(fù)機制對斷裂的DNA 進(jìn)行插入缺失、修復(fù)、替換[6]。這與真核生物中RNA 干擾(RNAi)原理是相似的[7]。2012年和2015 年,CRISPR 基因組編輯技術(shù)連續(xù)被Science 公布為十大突破[8]。本文將從CRISPR/Cas9的結(jié)構(gòu),特點和在斑馬魚中的研究闡述。

1 CRISPR/Cas 的分類

CRISPR 序列由眾多短而保守的重復(fù)序列區(qū)(Repeat)、間隔區(qū)(Spacer)和前導(dǎo)區(qū)(Leader)組成。重復(fù)序列區(qū)含有部分回文序列,可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),這段序列一般存在1 ～3 個堿基差異,這種差異被稱為退化重復(fù)(DR)[9]。重復(fù)序列被間隔序列隔開,間隔序列一般沒有相似或相同的序列,間隔區(qū)可以識別被細(xì)菌俘獲的外源DNA 序列,這相當(dāng)于動物的二次免疫,當(dāng)這些外源遺傳物質(zhì)再次入侵時,CRISPR/Cas 系統(tǒng)就會予以精確剪切。上游的前導(dǎo)區(qū)是一段富含AT 的序列,是CRISPR 系統(tǒng)的啟動子所在區(qū)。另外,CRISPR 系統(tǒng)還有一個重要的多態(tài)性的家族基因,該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用。因此,該基因被命名為CRISPR 關(guān)聯(lián)基因(CRISPR associated,Cas)。Cas 蛋白一般位于CRISPR 位點下游,或者分散在基因組的其他地方。目前為止,已有40 多種伴隨CRISPR位點的Cas 蛋白被鑒定[10]。Makarova[11]等根據(jù)其Cas 蛋白類別和作用的不同,將CRISPR/Cas 系統(tǒng)分為I 型,Ⅱ型,Ⅲ型,Ⅳ型和Ⅴ型,Shmakov[12]等人發(fā)現(xiàn)了CRISPR 系統(tǒng)Ⅴ型的另外兩個亞型及Ⅵ型新系統(tǒng)。CRISPR 的Ⅱ型因其蛋白單一,結(jié)構(gòu)簡單被廣泛應(yīng)用于基因工程,即CRISPR/Cas9。中插彩版圖1 為目前發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas 系統(tǒng)。

2 CRISPR/Cas9 的結(jié)構(gòu)和作用原理

CRISPR/Cas9 它包含Cas9,pre-crRNA(pre-CRISPRderived RNA),tracrRNA(Trans-activating crRNA)[14],pre-crRNA 是由整個CRISPR 序列轉(zhuǎn)錄而成的大型RNA 分子,在Ⅱ型系統(tǒng)中pre-crRNA 的加工由Cas9 單獨參與。Cas9 含有在氨基末端的RuvC 和蛋白質(zhì)中部的HNH2 個獨特的活性位點,在crRNA成熟和雙鏈DNA 剪切中發(fā)揮作用。此外,precrRNA 轉(zhuǎn)錄的同時,與其重復(fù)序列互補的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA,tracrRNA)也轉(zhuǎn)錄出來,并且激發(fā)Cas9 和雙鏈RNA 特異性RNaseⅢ核酸酶對pre-crRNA 進(jìn)行加工。 加工成熟后,crRNA、tracrRNA 和Cas9 組成復(fù)合體,識別并結(jié)合于crRNA 互補的序列,然后解開DNA 雙鏈,形成R-loop,使crRNA 與互補鏈雜交,另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài),然后由Cas9 中的HNH 活性位點剪切crRNA 的互補DNA 鏈,RuvC 活性位點剪切非互補鏈[15],最終引入DNA 雙鏈斷裂(DSB),進(jìn)而實現(xiàn)基因的敲除和插入[16](見中插彩版圖2)。其中crRNA 含有能夠識別20 bp 靶向互補序。

3 CRISPR/Cas9 在斑馬魚中的研究

CRISPR/Cas 系統(tǒng)基因編輯技術(shù)已經(jīng)是生物領(lǐng)域中熱門研究。該技術(shù)已經(jīng)廣泛用于小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅等多種模式動物的研究,包括基因功能研究、基因治療、疾病模型研制等[18]。斑馬魚因其繁殖周期短并與人類的器官高度相似等特點成為重要的模式生物,斑馬魚已經(jīng)成為大量的人類疾病研究模型。而相比于小鼠等模式生物,斑馬魚具有它們所不具有的特點[19],斑馬魚的胚胎在顯微鏡下觀察是透明的,可以看到各個器官和血管的發(fā)育；體外受精,試驗周期短。早在1930 年,斑馬魚就成為生物醫(yī)學(xué)研究的一個經(jīng)典的發(fā)育和胚胎模型[2]。

干擾素γ 誘導(dǎo)蛋白30(ifi30)參與機體病毒免疫、腫瘤免疫,曹頂臣[21]等通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除了斑馬魚ifi30 基因后胚胎死亡,證明ifi30 基因是胚胎發(fā)育過程中不可缺少的蛋白。劉菁[22]等通過CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除了斑馬魚faf1 基因,faf1 基因參與早期胚胎的神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移分化,通過顯微注射敲除該基因后斑馬魚的色素沉積延遲及尾部肌節(jié)部位出現(xiàn)“結(jié)節(jié)樣”變化。黃紅輝[23]等敲除了斑馬魚atp1a1a.1,atp1a1a.2, atp1a1a.3,atp1a1a.4,atp1a1a.5,pkd2,aqp3a,bmper,is12a 和tbx2a10 個前腎表達(dá)基因,經(jīng)過三代的篩選發(fā)現(xiàn)只有atp1a1a.2 和pkd2 致斑馬魚胚胎發(fā)育缺陷。dync1h1 基因是細(xì)胞質(zhì)動力蛋白復(fù)合體的核心結(jié)構(gòu),而細(xì)胞質(zhì)動力蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用,錢亭[24]等敲除了斑馬魚dync1h1 基因,導(dǎo)致斑馬魚脊髓腫脹,脊髓神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目顯著減少,背部血管存在發(fā)育畸形,并于受精后5 ～6 d 死亡。造血干細(xì)胞是一群具有高度的自我復(fù)制及多項分化潛能的最原始的造血細(xì)胞。hoxb4 基因在造血干細(xì)胞有重要的調(diào)控作用,袁夢[25]等通過上調(diào)和下調(diào)hoxb4 基因發(fā)現(xiàn)hoxb4 基因上調(diào)后導(dǎo)致原始造血干細(xì)胞數(shù)量增加；抑制hoxb4 基因可看到心包增大、心腔壁變薄及血細(xì)胞減少。

基因敲入(Knockin,K I)技術(shù)是指利用隨機整合、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、同源重組等方式將外源功能基因插入到基因組中,使其在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的基因編輯技術(shù)。研究人員[26]已經(jīng)利用CRISPR 系統(tǒng)通過非同源重組方式將Gal4 和EGFP 插入斑馬魚中,在此基礎(chǔ)上,杜久林[27]團(tuán)隊設(shè)計了內(nèi)含子靶向介導(dǎo)和同源重組(HR)高效獨立的替換方法,通過非同源重組方式和CRISPR/Cas9 將內(nèi)含子靶向基因敲入斑馬魚中而不破壞目標(biāo)性內(nèi)源基因,相比于HR,利用非同源性末端接合(Non-homologous end joining,NHEJ)在斑馬魚中實現(xiàn)非HR 基因敲入有兩個優(yōu)勢。第一,在斑馬魚早期發(fā)育中NHEJ 比HR 的活性至少高10 倍。第二,不同于HR,NHEJ 不需要親本斑馬魚基因組序列與靶向供體之間具有精確的同源性,避免了對親本斑馬魚耗時的篩選和基因分型。

4 CRISPR 展望

近兩年CRISPR 技術(shù)迅速發(fā)展,隨著CRISPR 系統(tǒng)和相關(guān)蛋白的研究越來越多,不斷的完善和優(yōu)化,推動人類疾病和動物模型的研究。CRISPR 系統(tǒng)相對于之前的鋅指核酸酶和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶基因編輯技術(shù)操作簡單,周期短,應(yīng)用范圍大。但是CRISPR 技術(shù)存在著脫靶的問題,研究人員也在解決這一問題,如在設(shè)計sgRNA 時增加幾個核苷酸可以減少錯配率[28],較長的PAM 序列可以減少脫靶問題的發(fā)生[29]。

斑馬魚廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)的研究,結(jié)合斑馬魚幼時全身透明的特點,基因組編輯技術(shù)在斑馬魚中將會提供更多更好的研究思路。