盧 楓 楊 勇 鄢建勤 鐘 濤 鄒望遠(yuǎn) 郭曲練

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院麻醉科，長沙 410078）

慢性神經(jīng)病理性疼痛不僅損害人的生理機能，而且影響人的心理情緒。各種研究表明，慢性疼痛經(jīng)常引起與情緒相關(guān)的異常行為，如焦慮、抑郁[1]。而孕期較重的應(yīng)激會使子代出現(xiàn)適應(yīng)不良的行為改變[2]。另外母親對子代的影響除了與孕期生理狀況相關(guān)外，還與出生后對子代的照顧行為有密切聯(lián)系[3]。出生后良好的母愛行為會對子代的行為產(chǎn)生有益的影響，而出生后受到虐待和忽視的子代成年后易出現(xiàn)焦慮等精神障礙和多病等軀體疾患[4]。我們的前期研究也表明,患有慢性神經(jīng)病理性疼痛的母鼠因母愛行為的改變，其子代會產(chǎn)生焦慮抑郁等負(fù)面情緒[5]。

既往研究發(fā)現(xiàn)孕期母親的應(yīng)激造成子代神經(jīng)發(fā)育和行為改變與母親下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸的活化有關(guān)[6]。而且母鼠的母愛行為與下丘腦視上核的催產(chǎn)素(oxytocin, OT)表達(dá)相關(guān)，各種原因造成的母愛行為減退大多直接或間接與OT表達(dá)下降有關(guān)[7]。

因此，本文推測患有神經(jīng)病理性疼痛的母鼠可能會對內(nèi)分泌系統(tǒng)造成嚴(yán)重的影響，不僅影響胎鼠的發(fā)育，還會影響母愛關(guān)懷行為[8]，從而使子代在疼痛感知和情緒反應(yīng)方面均出現(xiàn)障礙。但是，迄今為止鮮有神經(jīng)病理性疼痛在代間影響的報道。因此本研究將神經(jīng)病理性疼痛大鼠進(jìn)行分組配對交換喂養(yǎng)，觀察其子鼠青年期的基礎(chǔ)痛閾、炎性痛和應(yīng)激狀況與正常子鼠之間是否存在差異，從而探討神經(jīng)病理性疼痛的代間影響。

方 法

1.實驗動物

健康成年SD大鼠，體重200～250 g，由中南大學(xué)動物學(xué)部提供且通過動物倫理學(xué)部審批（審批號201707898）。在清潔環(huán)境中飼養(yǎng)，每大籠裝同性別大鼠3只，受孕成功后單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度控制在20～23℃，提供12 hD/12 hL光照，自由攝食飲水，無強光和噪音刺激。實驗過程中采取一切措施盡量減少動物的痛苦和恐懼。

2.儀器設(shè)備和試劑

7370熱痛儀來自意大利UGO公司；2390電子VonFrey測痛儀來自美國IITC公司；多功能酶標(biāo)儀來自美國thermo-fisher公司；甲醛試劑購自慶北碚化學(xué)試劑廠；大鼠CRH ELISA試劑盒和COR ELISA試劑盒購自美國RB公司。

3.實驗分組

健康成年SD大鼠48只，體重200～250 g，雌雄各半。雌雄大鼠采用隨機數(shù)字表法各隨機取12只，參照Bennett文獻(xiàn)[9]介紹的方法，采用坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷 (CCI) 法制備神經(jīng)病理性疼痛模型。于模型制備后10 d，大鼠進(jìn)行配對。將大鼠隨機分為四組：CCI雄性（C1組，n= 12）、CCI雌性（C2組，n= 12）、假手術(shù)雄性（S1組，n= 12）、假手術(shù)雌性（S2組，n= 12）。以左坐骨神經(jīng)結(jié)扎為基礎(chǔ)，建立神經(jīng)病理性疼痛的CCI模型。假手術(shù)組僅暴露出左后肢坐骨神經(jīng)，但不結(jié)扎。四組大鼠在模型制作后10 d按照C1C2組和S1S2組配對，每只母鼠確定受孕后單籠飼養(yǎng)，在其分娩后即刻將C2組和S2組所生的F1代采用隨機數(shù)字表法各分為2小組，即共分為：FC2組和FC2’組、FS2組和FS2’。其中FS2’組與FC2’組F1代子鼠在出生后即互換喂養(yǎng)，F(xiàn)C2組和FS2組仍由原母鼠喂養(yǎng)。所有F1代子鼠由選定的母親喂養(yǎng)至21 d后斷奶，單獨飼養(yǎng)至30 d時進(jìn)行實驗[10]。

4.親代大鼠母愛行為檢測

本研究采用雙盲法檢測母鼠分娩后的回收與舔仔行為比較各組母鼠的母愛行為差異。事先計算好懷孕大鼠的預(yù)產(chǎn)期，在估計的預(yù)產(chǎn)期日內(nèi)將孕鼠置于透明玻璃觀察籠中，用監(jiān)控系統(tǒng)全程監(jiān)視大鼠分娩過程，待大鼠分娩結(jié)束后，操作者戴薄膜手套將母鼠與仔鼠分開，1 h后將四只仔鼠放在透明玻璃觀察籠的四個角落，然后將母鼠放入，攝錄機記錄1 h，觀察并記錄母鼠自放入后至開始回收仔鼠的時間（回收潛伏期），以及從回收開始至將全部四只仔鼠收集結(jié)束的時間（回收總時間）；觀察并記錄母鼠自放入籠中至開始舔舐第一只幼仔的時間（舔仔潛伏期），以及整個舔仔過程的總時間（舔仔總時間），取每只大鼠的相應(yīng)時間平均值進(jìn)行比較。

圖1 實驗方案的組織設(shè)計Fig.1 The organization design of the experimental scheme

5.機械痛閾(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT) 和熱痛閾(paw withdrawal thermal latency,PWTL)

采用2390型電子Von Frey機械痛閾測定儀（UGO公司，意大利）測定子鼠機械痛閾。將子鼠放入帶有金屬網(wǎng)眼的支撐墊上，周圍覆蓋20 cm×20 cm的透明玻璃罩，適應(yīng)環(huán)境10 min后，將探針直接垂直勻速作用于左后足掌面正中皮膚，并逐漸加壓，記錄誘發(fā)子鼠縮足反應(yīng)時的壓力(g)。每只大鼠足掌反復(fù)測量5次，每次間隔5 min，取平均值為機械痛閾。

采用7370型紅外熱痛閾測定儀（IITC公司，美國）測定子鼠熱痛閾。將子鼠放入厚約3 mm的透熱玻璃板上，頂端開口20 cm×20 cm的透明玻璃罩封閉，待適應(yīng)10 min后進(jìn)行測定。紅外光源正對左后足底，記錄誘發(fā)子鼠縮足反應(yīng)的時間(s)。每只大鼠足掌反復(fù)測量5次，每次間隔5 min，取平均值為熱痛閾。

6.福爾馬林炎性痛

按照Dubuisson等[11]方法進(jìn)行福爾馬林炎性痛模型制作，所有F1代子鼠均在左后足底注射30 μl 的3%甲醛，依據(jù)Davidson等的方法在注射后1 h內(nèi)對兩相反應(yīng)進(jìn)行評分，每5 min 一次。計算大鼠痛級均 數(shù) (pain intensity rating, PIR)：PIR = (T1+2×T2+3×T3) /5×60，其中T1、T2、T3分別代表出現(xiàn)1級、2級和3級反應(yīng)的總時間。

7.血清CRH，COR測定

所有子鼠在行為學(xué)實驗結(jié)束后均腹腔注射水合氯醛900 mg/kg，深麻醉下打開胸腔，蚊氏鉗輕輕夾起心臟，用2.5 ml無菌注射器從右心耳處刺入，緩慢抽取2.0 ml 血液，注入促凝管中，室溫靜置30 min。3 000轉(zhuǎn)/min離心20 min，然后小心吸出上清，轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)備用。嚴(yán)格按照CRH、COR ELISA試劑盒（RB公司，美國）的說明書進(jìn)行操作，檢測血清中CRH、COR。

8.免疫組織化學(xué)檢測視上核催產(chǎn)素表達(dá)

冰凍切片取子鼠下丘腦視上核區(qū)腦片，將過氧化氫處理后的腦片在PBS中震蕩清洗，10 min × 3次；5%小牛血清，室溫孵育2 h；兔抗鼠OT(1:2 000)單克隆抗體，4℃冰箱內(nèi)過夜；PBS溶液，10 min × 3次；羊抗兔二抗(1:50)，室溫孵育2 h；PBS溶液內(nèi)進(jìn)行漂洗，5 min×3次；連續(xù)貼片，在無塵通風(fēng)的干燥環(huán)境內(nèi)放置6 h，使其充分晾干；50%、75%，90%，95%、100%脫水，每次3 min；二甲苯瓶透明，封片；顯微成像系統(tǒng)中選擇視上核的位置進(jìn)行拍片。統(tǒng)計每只大鼠6張腦片中視上核陽性細(xì)胞的總數(shù)，取均值代表每只大鼠腦片的細(xì)胞數(shù)，最后取每組大鼠陽性細(xì)胞數(shù)的均數(shù)進(jìn)行比較。

9.統(tǒng)計學(xué)分析

所有計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩組間的比較采用LSD和SNK-q檢驗，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.親代母鼠母愛行為比較

與假手術(shù)組母鼠喂養(yǎng)的FS2組或FC2’組相比，神經(jīng)病理性疼痛組母鼠喂養(yǎng)的FC2組或FS2’組回收潛伏期、回收總時間和舔仔潛伏期時間延長，舔仔總時間縮短（P＜ 0.05或0.01）。FC2組與FS2’組、FS2組與FC2’組母鼠回收潛伏期、回收總時間、舔仔潛伏期和舔仔總時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05，見表1）。

表1 四組親代母鼠回收仔時間和舔仔時間比較(±SD)Table 1 Comparison of the time of gather and lick behaviors among all the mother rats (±SD)

表1 四組親代母鼠回收仔時間和舔仔時間比較(±SD)Table 1 Comparison of the time of gather and lick behaviors among all the mother rats (±SD)

*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，與 FS2 相比，compared with FS2；#P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01，與 FC2’組相比，compared with FC2’.

舔仔總時間(s)The total time in licking(s)FC2 246.2±42.3*# 412.8±46.4*# 332.5±26.4*# 311.5±30.7**##FS2’ 233.9±36.4*# 453.5±38.9*# 300.8±22.7**# 296.3±33.4**##FS2 153.7±29.5 322.5±30.6 69.4±10.8 638.5±32.2 FC2’ 144.8±38.6 308.6±33.5 86.7±12.5 608.9±37.6組別Group回收潛伏期(s)Gathering incubation period（s)回收總時間(s)The total time in gathering(s)舔仔潛伏期(s)Licking incubation period(s)

2.子代基礎(chǔ)痛閾

四組F1代子鼠機械痛閾和熱痛閾結(jié)果相似，無論是在自己生母的喂養(yǎng)下還是交換母鼠喂養(yǎng)下，四組子鼠的基礎(chǔ)痛閾均相似，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（見表2）。

表2 四組子鼠機械痛閾和熱痛閾比較(±SD)Table 2 comparison of mechanical and thermal pain threshold among four groups of F1 rats (±SD)

表2 四組子鼠機械痛閾和熱痛閾比較(±SD)Table 2 comparison of mechanical and thermal pain threshold among four groups of F1 rats (±SD)

組別Group熱痛閾 (s)Thermal pain threshold (s)FC2 20.9±4.0 11.8±2.0 FS2’ 20.1±6.0 11.2±2.0 FS2 20.0±5.0 11.1±2.5 FC2’ 21.2±4.0 12.0±2.2機械痛閾 (g)Mechanical pain threshold (g)

3.子代福爾馬林實驗

所有F1代子鼠左后足注射福爾馬林后均出現(xiàn)典型的Ⅰ相、靜息期和Ⅱ相反應(yīng)，在Ⅰ相時所有子代大鼠痛級均數(shù)（PIR）兩兩之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異，而在Ⅱ相時養(yǎng)母為神經(jīng)病理性疼痛的FC2、FS2’組子鼠PIR明顯高于養(yǎng)母為假手術(shù)組大鼠的FS2、FC2’組（P＜ 0.05 或P＜ 0.01）；而相同養(yǎng)母的子鼠之間PIR無差異（見表3）。

表3 四組F1代子鼠左后足注射福爾馬林后PIR評分(±SD)Table 3 Four groups of F1 rats were injected with the PIR after the left hind foot injection of formalin (±SD)

表3 四組F1代子鼠左后足注射福爾馬林后PIR評分(±SD)Table 3 Four groups of F1 rats were injected with the PIR after the left hind foot injection of formalin (±SD)

*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 與 FS2 組比較，compared with FS2；#P ＜ 0.05，與 FC2’組比較，compaered with FC2’.

Ⅱ相II phase reaction FC2 2.11±0.17 28.73±0.45**#FS2’ 2.15±0.24 26.56±0.38*#FS2 1.95±0.31 20.96±0.3 FC2’ 2.03±0.26 21.65±0.22組別Group I相反應(yīng)I phase reaction

4.子代血清應(yīng)激激素CRH和COR含量檢測

四組子鼠血清中應(yīng)激激素CRH和COR含量差異明顯，養(yǎng)母為神經(jīng)病理性疼痛的FC2、FS2’兩組子鼠激素含量明顯高于養(yǎng)母為假手術(shù)組的FS2、FC2’組子鼠(P＜ 0.05)。而相同養(yǎng)母的子鼠之間激素含量無差異（見表4）。

表4 四組F1代大鼠由各自母親喂養(yǎng)30 d后血清中CRH、COR的比較(±SD)Table 4 The comparison of CRH and COR in the blood of the four groups of F1 rats who were raised by their mothers (±SD)

表4 四組F1代大鼠由各自母親喂養(yǎng)30 d后血清中CRH、COR的比較(±SD)Table 4 The comparison of CRH and COR in the blood of the four groups of F1 rats who were raised by their mothers (±SD)

*P ＜ 0.05，與相同指標(biāo)的FS2組比較，compared with group FS2；#P ＜ 0.05，與相同指標(biāo)的FC2’組比較，compared with group FC2’.

組別Group CRH (pg/ml) COR (ng/ml)FC2 36.42±3.79*# 107.53±5.21*#FS2’ 37.53±4.31*# 104.38±4.69*#FS2 26.05±3.81 85.22±4.17 FC2’ 28.43±2.96 87.66±3.98

5.子代下丘腦視上核OT的表達(dá)

四組子鼠下丘腦視上核OT的表達(dá)也有明顯差異，神經(jīng)病理性疼痛母鼠喂養(yǎng)的子代其視上核OT表達(dá)明顯低于假手術(shù)組母鼠喂養(yǎng)的子代，即FC2和FS2’組表達(dá)量低于FC2’和FS2組（P＜ 0.05，見圖2，僅顯示右側(cè)視上核，左側(cè)結(jié)果相似）。

圖2 四組F1代子鼠右側(cè)下丘腦視上核OT表達(dá)（×200）四組F1代子鼠在各自母鼠或交換喂養(yǎng)30 d后，右側(cè)下丘腦視上核OT的表達(dá)，其中棕色為OT陽性細(xì)胞（左側(cè)結(jié)果相似）。柱狀圖為各組陽性細(xì)胞數(shù)比較。*P ＜ 0.05，與 FS2 組相比；#P ＜ 0.05，與 FC2’組相比Fig.2 The right hypothalamic nucleus oxytocin expressed in four group of F1 rats (×200)After four groups of F1 rats are feed by their mother or crossed feed in 30 d, the expression of OT in right hypothalamus supraoptic nucleus, the brown is OT positive cells (the left side results are similar).The graph shows the number of positive cells in each group.

討 論

以往的研究表明：機體通常對于危及生命的不利刺激通過大腦的處理作為應(yīng)激對待，根據(jù)威脅的特點調(diào)節(jié)機體在行為和生理上做出反應(yīng)，產(chǎn)生戰(zhàn)斗、逃跑、絕望和對傷害進(jìn)行調(diào)節(jié)的改變。同時會調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的的活動狀態(tài)，從而使機體對傷害或使大腦對應(yīng)激源發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)。慢性疼痛會造成一種病理性應(yīng)激，使上述三個系統(tǒng)之間發(fā)生復(fù)雜而廣泛的相互作用，從而持續(xù)擾亂免疫系統(tǒng)，激活神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致大量應(yīng)激激素的釋放和細(xì)胞因子譜發(fā)生明顯改變[12,13]。

機體對應(yīng)激反應(yīng)首先與下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的激活相關(guān)[14]。該軸激活時下丘腦釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)并使腎上腺釋放皮質(zhì)醇(COR)。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然母鼠發(fā)生神經(jīng)病理性疼痛喂養(yǎng)的子鼠其基礎(chǔ)痛閾無明顯差異，但其循環(huán)系統(tǒng)中HPA軸的產(chǎn)物CRH和COR濃度明顯高于母鼠為假手術(shù)組喂養(yǎng)的子鼠。有研究表明孕期處于應(yīng)激狀態(tài)的母鼠其子代循環(huán)中糖皮質(zhì)激素的水平較高，糖皮質(zhì)激素可以從乳汁中分泌，而當(dāng)子鼠由神經(jīng)病性疼痛母鼠喂養(yǎng)時，其接受應(yīng)激狀態(tài)母鼠的高糖皮質(zhì)激素乳汁可能致其體內(nèi)糖皮質(zhì)激素水平上升，而糖皮質(zhì)激素受體則發(fā)生下調(diào)[15]。這表明神經(jīng)病理性疼痛母鼠喂養(yǎng)的子鼠其HPA軸處于持續(xù)激活狀態(tài)，即這些子鼠一直處于慢性應(yīng)激狀態(tài)。這種應(yīng)激狀態(tài)可能嚴(yán)重影響了子鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)，這種影響在正常情況下可能并不改變子鼠對生理性疼痛的感知，但在傷害性刺激發(fā)生后可能促使這三個相互關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)調(diào)節(jié)失衡。這也從甲醛炎性痛實驗結(jié)果中可以看出，I相痛級均數(shù)(PIR)各組無統(tǒng)計學(xué)差異，而在II相遲發(fā)傷害性疼痛反應(yīng)評分中，神經(jīng)病理性疼痛母鼠喂養(yǎng)的子鼠PIR明顯高于正常母鼠喂養(yǎng)的子鼠，表明神經(jīng)病理性疼痛母鼠喂養(yǎng)的子鼠中樞敏化增強，對外界新發(fā)疼痛的感知也強于正常母鼠喂養(yǎng)的子鼠，從而可能使得本不會持續(xù)化的急性疼痛轉(zhuǎn)變?yōu)槁蕴弁础?/p>

既往研究發(fā)現(xiàn)，動物的母愛行為與其下丘腦視前區(qū)催產(chǎn)素及催產(chǎn)素受體(OTR)表達(dá)相關(guān)[16]。而有研究表明腦內(nèi)相關(guān)核團(tuán)的OT 參與了痛行為調(diào)制的復(fù)雜過程，引起痛行為反應(yīng)的閾值增加[17]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過神經(jīng)病理性疼痛母鼠喂養(yǎng)的子鼠，無論其生母是否發(fā)生神經(jīng)病理性疼痛，這些子鼠青年期視前區(qū)催產(chǎn)素的表達(dá)均明顯低于正常母鼠喂養(yǎng)的子鼠。因此，親代神經(jīng)病理性疼痛對子代情感及疼痛感知的影響可能獨立于孕期的遺傳因素，而與母愛行為本身有關(guān)；子代痛行為的改變與其視上核催產(chǎn)素的表達(dá)下調(diào)相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過神經(jīng)病理性疼痛母鼠喂養(yǎng)的子鼠，無論其母親是否發(fā)生神經(jīng)病理性疼痛，這些子鼠青年期視前區(qū)OT的表達(dá)均明顯低于正常母鼠喂養(yǎng)的子鼠，但其具體調(diào)控機制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。綜上所述，神經(jīng)病理性疼痛大鼠的母愛行為雖然對子鼠基礎(chǔ)痛域無明顯影響，但會增強子鼠對新發(fā)生疼痛的感知，這些行為改變可能與子鼠HPA軸應(yīng)激激素的升高及下丘腦催產(chǎn)素表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。