曹旭丹，任春梅，和田田，李素華，李 莉

（1．邯鄲市中心醫(yī)院，邯鄲 056001；2．邯鄲市傳染病醫(yī)院，邯鄲 056000）

缺血再灌注損傷嚴重影響著心肌梗死的治療效果，并且還是各種心臟手術(shù)術(shù)后常見并發(fā)癥，是亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。水飛薊賓（SIL）是一種具有抗氧化、促進細胞再生等多種生物活性的水飛薊素[1-2]，既往研究發(fā)現(xiàn)SIL能夠通過抑制氧化應(yīng)激等而對局灶性腦組織缺血再灌注損傷表現(xiàn)出一定的保護作用[3]，本研究采用Langendorff灌流系統(tǒng)，建立大鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型，研究SIL對離體心臟的保護作用并探索其機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用SD大鼠（雄性，SPF級，體質(zhì)量250～300 g，鼠齡8周）購自河北省實驗動物中心，許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫23～25℃、相對濕度 65%～70%，光照周期 12 h∶12 h，手術(shù)前24 h禁食、自由飲水。

1.2 藥物與試劑 水飛薊賓膠囊（天津天士力制藥股份有限公司，藥品規(guī)格：35 mg/粒，批號為20171103），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）試劑盒，蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號為：150518、150324、150602、141225），Na+-ATPase、Ca2+-ATPase，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號為 20170316、20170611、20151613、20150109、20150526、20141218），紅四氮唑（TTC，美國 Sigma公司，批號：M2128），K-H 液（自制）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組、造模與給藥 100只SD大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組、模型組和SIL低[100 mg/（kg·d）]、中[200 mg/（kg·d）]、高[400 mg/（kg·d）]劑量組，各20只；于手術(shù)前2 h灌胃給藥，正常對照組和模型組同步灌胃給予生理鹽水。參照李兵等[4]報道的實驗方法制備Langendorff灌流離體心臟缺血再灌注模型：麻醉后，迅速開胸取心臟，置4℃的K-H液，通過主動脈由Langendorff系統(tǒng)逆灌注含氧K-H液，其中正常對照組持續(xù)以7 mL/min恒速平衡灌注K-H液110 min，模型組和SIL各劑量組依次行7 mL/min恒速平衡灌注K-H液20 min、停灌30 min后恢復(fù)灌注60 min。左心耳處置帶測壓導(dǎo)管的球囊并連接生物信號采集系統(tǒng)，監(jiān)測實時數(shù)據(jù)。

1.3.2 測定心肌酶活性 取心臟冠脈流出液并通過生化分析法測定心肌酶AST、LDH、CK-MB活性。

1.3.3 測定心臟組織梗死面積 各組取5只離體心臟，切片（厚度約2 mm），經(jīng)-20℃凍存20 min后，置于1%TTC溶液中避光孵育20 min，最后通過圖像分析系統(tǒng)測算梗死面積百分率。

1.3.4 組織病理學(xué)檢查 各組取5只離體心臟，多聚甲醛溶液（濃度4%）固定3 d、石蠟包埋、切片、脫蠟水化，然后行常規(guī)HE染色（依次進行乙醇梯度脫蠟、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌、蘇木素染色5 min、0．5%乙醇鹽酸分色、伊紅染色20 s等步驟）后通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察心臟組織病變。

1.3.5 血流動力學(xué)指標監(jiān)測 通過生物信號采集系統(tǒng)監(jiān)測并記錄再灌注60 min后各離體心臟血流動力學(xué)指標，包括心率（HR）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室收縮壓（LVSP）、左室收縮壓最大上升速率（+dP/dtmax）、左室舒張壓最大下降速率（-dP/dtmin）。

1.3.6 測定抗氧化酶活性，MDA含量及Na+-ATP、Ca2+-ATP活性 取每組剩余的10只離體心臟，剪碎、研磨勻漿、經(jīng)3 000 r/min低溫（4℃）離心15 min后取上清液，按照試劑盒步驟處理后通過紫外-可見分光光度計測定抗氧化酶SOD、CAT活性，MDA含量并測定Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)處理 運用軟件SPSS 19．0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組離體心臟冠脈流出液AST、LDH、CK-MB活性 模型組冠脈流出液AST、LDH、CK-MB活性較正常對照組顯著升高（P＜0．01）。而較模型組，經(jīng)SIL中、高劑量預(yù)處理能夠顯著降低離體心臟灌注模型冠脈流出液 AST、LDH、CK-MB 活性（P＜0．05或 P＜0．01）。見表 1。

表1 各組離體心臟冠脈流出液AST、LDH、CK-MB的活性Tab.1 Activity of AST,LDH and CK-MB of coronary effluent from isolated hearts in each groupU/L

表1 各組離體心臟冠脈流出液AST、LDH、CK-MB的活性Tab.1 Activity of AST,LDH and CK-MB of coronary effluent from isolated hearts in each groupU/L

注：與正常對照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

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2.2 各組離體心臟梗死面積百分率 模型組離體心臟梗死面積較正常對照組顯著升高[（42．09±4．97）%比 0%，P＜0．01]；SIL 低、中、高劑量組心臟梗死面積百分率分別為（38．42±5．37）%、（31．83±5．40）%、（25．24±4．90）%，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，SIL 中、高劑量組心臟梗死面積較模型組顯著降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。

2.3 各組離體心臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果 見圖1。正常對照組離體心臟組織形態(tài)和心肌細胞結(jié)構(gòu)均未見異常；較正常對照組，模型組離體心臟組織呈現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變，主要表現(xiàn)為肌原纖維斷裂、心肌細胞排列紊亂且出現(xiàn)空泡變性、胞質(zhì)著色不均、胞核深染等；而較模型組，經(jīng)SIL預(yù)處理能夠明顯改善離體心臟組織病變，以SIL高劑量組上述效果最為顯著。

2.4 各組離體心臟血流動力學(xué)指標 見表2。模型組離體心臟血流動力學(xué)指標HR、LVSP、+dP/dtmax、-dP/dtmin較正常對照組顯著下降且LVEDP顯著升高（P＜0．01）；而較模型組，經(jīng) SIL 中、高劑量預(yù)處理能夠顯著升高離體心臟組織HR、LVDP、+dP/dtmax、-dP/dtmin 并顯著降低 LVEDP（P＜0．05 或 P＜0．01）。

圖1 各組離體心臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE，×400）Fig.1 Outer heart histopathological examination results in each group(HE,×400)

表2 各組離體心臟血流動力學(xué)指標（Tab.2 Hemodynamic index of isolated hearts in each group（

表2 各組離體心臟血流動力學(xué)指標（Tab.2 Hemodynamic index of isolated hearts in each group（

注：與正常對照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

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2.5 各組離體心臟氧化應(yīng)激監(jiān)測 如表3所示，模型組離體心臟組織抗氧化酶SOD、CAT活性較正常對照組顯著降低且MDA含量顯著升高（P＜0．01）；而較模型組，經(jīng)SIL中、高劑量預(yù)處理能夠顯著提高離體心臟組織SOD、CAT活性并降低MDA含量（P＜0．05 或 P＜0．01）。

表3 各組離體心臟氧化應(yīng)激監(jiān)測指標（Tab.3 Oxidative stress monitoring index of isolated hearts in each group

表3 各組離體心臟氧化應(yīng)激監(jiān)測指標（Tab.3 Oxidative stress monitoring index of isolated hearts in each group

注：與正常對照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

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2.6 各組離體心臟組織Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性 模型組離體心臟組織Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性較正常對照組顯著降低（P＜0．01）；而較模型組，經(jīng)SIL中、高劑量預(yù)處理能夠顯著提高離體心臟組織 Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性（P＜0．05 或P＜0．01）。見表 4。

3 討論

水飛薊賓是一種具有多種生物學(xué)作用的水飛薊素[1-2]，本實驗通過Langendorff灌流制備大鼠離體心臟缺血再灌注模型并提前給予SIL進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)SIL預(yù)處理能夠有效降低冠脈流出液心肌酶AST、LDH、CK-MB活性、減小心臟梗死面積、抑制心臟組織病變，提示SIL對離體心臟組織缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

體內(nèi)氧自由基（ROS）過剩是導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激損傷的根本原因，生理狀態(tài)下ROS能夠在抗氧化酶SOD、CAT相繼催化作用下最終被還原生成H2O和，但腦缺血再灌注后，將導(dǎo)致ROS過剩而攻擊細胞膜，使細胞膜主要成分不飽和脂肪酸被氧化破壞，其中MDA為氧化應(yīng)激損傷終產(chǎn)物之一，因此SOD、CAT活性和MDA含量水平分別能夠直接和間接反應(yīng)機體氧化應(yīng)激損傷程度[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SIL預(yù)處理能夠提高離體心臟組織抗氧化酶SOD、CAT活性并降低MDA含量，提示SIL具有降低離體心臟缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷的作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)Na+濃度升高而促進Na+-Ca2+交換，進而導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流而Ca2+超載是心肌缺血再灌注損傷的重要病理機制[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SIL預(yù)處理能夠有效提高離體心臟組織Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性，從而能夠有效緩解心肌細胞內(nèi)Ca2+超載，這可能是SIL抑制離體心臟缺血再灌注損傷的分子機制之一。

綜上所述，SIL對離體心臟缺血再灌注損傷具有一定的抑制作用，其作用機制可能與SIL能夠改善血液流變學(xué)指標、抑制氧化應(yīng)激、提高Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活力有關(guān)。

表4 各組離體心臟組織Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性Tab.4 Activity of Na+-ATPase and Ca2+-ATPase of coronary effluent from isolated hearts in each group

表4 各組離體心臟組織Na+-ATPase、Ca2+-ATPase活性Tab.4 Activity of Na+-ATPase and Ca2+-ATPase of coronary effluent from isolated hearts in each group

注：與正常對照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

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