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      基于ERK-Calpain2通路探討黃連素對(duì)冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響*

      2019-01-18 09:27:34曹雪明
      天津中醫(yī)藥 2019年1期
      關(guān)鍵詞:心肌細(xì)胞心肌抗體

      朱 娜,曹雪明

      (1.河南省人民醫(yī)院健康管理科,鄭州 450000;2.河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科,鄭州 450000)

      冠心?。–HD)近年來(lái)發(fā)病率逐年上升且日趨年輕化,它最直接的影響就是心肌缺血從而導(dǎo)致心臟的供氧減少,不能支持心臟正常工作,甚至導(dǎo)致部分心肌細(xì)胞凋亡[1-2]。研究報(bào)道,黃連素(BBR)可能通過(guò)促進(jìn)抗氧化核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后的凋亡發(fā)揮顯著的抑制作用[3]。BBR可抑制細(xì)胞與調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2途徑減輕大氣細(xì)顆粒物對(duì)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的損傷凋亡[4]。這些提示黃連素對(duì)包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡具有抑制作用。但BBR在抑制心肌細(xì)胞凋亡中的機(jī)制還不完善。因此,本研究通過(guò)建立CHD大鼠模型,觀察BBR對(duì)模型動(dòng)物心肌凋亡的作用,探討其作用機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠30只,體質(zhì)量(200±20)g,常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):No.201722172。

      1.2 試劑 BBR(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),腦垂體后葉素(南京新百藥業(yè)有限公司),含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Caspase-12、鈣蛋白酶(Calpain)2、鈣蛋白酶抑制蛋白(Capastatin)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)抗體及羊抗兔和羊抗鼠IgG-HRP二抗(美國(guó)CST公司),GAPDH抗體(Bioworld公司),RIPA裂解液、BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司),PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒及引物(大連TaKaRa公司),一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海Beyotime公司)。

      1.3 主要儀器 PIPETMANL微量可調(diào)加樣器,法國(guó)Gilson公司;Allegra 64R Centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),美國(guó)Beckman Coulter公司;CKX41倒置顯微鏡,日本Olympus公司;MiniVE電泳設(shè)備,美國(guó)GE公司;ABI Prism 7300型熒光定量PCR儀,美國(guó)ABI公司。

      1.4 動(dòng)物模型的建立及分組給藥 參考文獻(xiàn)[5]方法每日給予高脂食物連續(xù)喂養(yǎng)6周,間隔24 h腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg,連續(xù)3次,建立CHD大鼠模型,并測(cè)定模型鼠心臟ST段變化,與正常鼠相比,心臟ST段變化明顯升高的模型鼠為造模成功。將模型動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究實(shí)驗(yàn)組予以80 mg/(kg·d)BBR灌胃;對(duì)照組每日予以等體積的雙蒸水灌胃。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)以正常SD大鼠設(shè)立空白組,予以等體積的雙蒸水灌胃。每組10只動(dòng)物,治療周期為12周。

      1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)法檢測(cè)心肌細(xì)胞中GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA水平變化含量 采用大鼠的心肌組織,按照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行RNA提取、純化、RT反應(yīng)和qPCR反應(yīng)并計(jì)算分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

      1.6 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況 參考文獻(xiàn)[7]將收集好的心肌組織石蠟包埋、切片、蘇木素染核,將切面放入Tris-HCl(含3%牛血清白蛋白和20%牛血清)中15~25℃浸泡,后經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)浸泡潤(rùn)洗2次,晾干,在切片上滴加50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液,37℃孵育 1.5 h,PBS洗 3遍,稍微放干在倒置顯微鏡下觀察組織細(xì)胞凋亡情況,計(jì)算凋亡率,隨機(jī)選取5個(gè)非重疊400倍鏡視野,計(jì)錄凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù),心肌細(xì)胞凋亡率=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

      1.7 蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)分析各組大鼠相對(duì)蛋白表達(dá)量 大鼠的心肌組織參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行蛋白提取、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜,及封閉。按需求加入 Caspase-12 抗體(1∶1 000)、CHOP 抗體(1∶2 000)、GRP78 抗體 (1∶2 000)、Calpain2 抗體 (1∶1 000)、Capastatin抗體(1∶1 000)及 GAPDH(內(nèi)參)抗體 4℃溫育過(guò)夜。次日,TBST洗膜3次,再加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫雜交1 h,PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色,用Syngene Imaging System進(jìn)行成像,用Image J對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

      1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Prism 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差s)表示。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較,方差齊時(shí)采用LSD法,方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3 法,P<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 各組動(dòng)物TUNEL染色結(jié)果 心肌TUNEL染色后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均發(fā)現(xiàn)了不同程度的深棕色凋亡細(xì)胞,見(jiàn)圖1。與空白組相比,對(duì)照組細(xì)胞凋亡明顯,凋亡率(27.8±3.1)顯著增加(P<0.01);與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡(18.7±2.2)顯著減少(P<0.01)。

      圖1 各組大鼠心肌TUNEL染色(×200)Fig.1 Myocardial TUNEL staining of rats in each group(×200)

      2.2 各組動(dòng)物Caspase-12、Caspase-3蛋白表達(dá)變化 與空白組相比,Caspase-12和Caspase-3蛋白均明顯上調(diào)(P<0.01),而與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組上述蛋白均有不同程度下調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)圖2A和表1。

      圖2 各組大鼠心肌Caspase-12、Caspase-3、GRP78和CHOP相對(duì)蛋白表達(dá)水平Fig.2 Elative protein expression levels of Caspase-12,Caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group

      表1 各組大鼠心肌Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-3、GRP78 和 CHOP 相對(duì)蛋白表達(dá)水平(Tab.1 Relative protein expression levels of Cleavedcaspase-12,leaved-caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group(%

      表1 各組大鼠心肌Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-3、GRP78 和 CHOP 相對(duì)蛋白表達(dá)水平(Tab.1 Relative protein expression levels of Cleavedcaspase-12,leaved-caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group(%

      注:與空白組比較,*P<0.01;與對(duì)照組比較,#P<0.01。

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      2.3 各組動(dòng)物GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA水平變化 與空白組相比,對(duì)照組GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA 表達(dá)明顯升高(P<0.01),而與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)。見(jiàn)圖 3。

      圖3 各組大鼠心肌GRP78、CHOP和calpain2 mRNA表達(dá)水平Fig.3 Relative mRNA expression levels of GRP78,CHOP and Calpain2 in myocardium of rats in each group

      2.4 各組動(dòng)物GRP78、CHOP蛋白表達(dá)變化 與空白組相比,對(duì)照組GRP78和CHOP蛋白均明顯上調(diào)(P<0.01);與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組上述蛋白均有不同程度下調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)圖 2B 和表 2。

      表2 各組大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相對(duì)蛋白表達(dá)水平(Tab.2 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group(%

      表2 各組大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相對(duì)蛋白表達(dá)水平(Tab.2 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group(%

      注:與空白組比較,*P<0.01;與對(duì)照組比較,#P<0.01。

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      2.5 各組動(dòng)物p-ERK、Calpain2和Capastatin蛋白表達(dá)變化 與空白組相比,對(duì)照組p-ERK和Calpain2 蛋白均明顯上調(diào)(P<0.01),Capastatin 蛋白表達(dá)下降;而與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組p-ERK和Calpain2蛋白表達(dá)下調(diào),Capastatin蛋白表達(dá)升高(P<0.01),見(jiàn)圖 4 和表 2。

      3 討論

      內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是凋亡的主要途徑之一,短期的ERS會(huì)導(dǎo)致抗凋亡的GRP78表達(dá)上調(diào),而長(zhǎng)期ERS會(huì)促進(jìn)CAAT/CHOP以及胱天蛋白酶12剪切體(Cleaved-caspase-12)表達(dá)升高[9]。本研究發(fā)現(xiàn),CHD模型大鼠心肌Cleaved caspase-12、GRP78和CHOP表達(dá)升高,同時(shí)凋亡的執(zhí)行者Caspase-3剪切體(Cleaved caspase-3)增加。提示,模型動(dòng)物心肌出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡。研究表明,Calpain2為Caspase-12的上游信號(hào)分子[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型大鼠Calpain2表達(dá)上調(diào),而Calpastatin表達(dá)下調(diào),提示Calpain2的表達(dá)和活性增強(qiáng)。近期研究發(fā)現(xiàn),砷誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡伴隨著Calpain2的激活和ERK的磷酸化增強(qiáng)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)模型動(dòng)物p-ERK升高,Chen等[12]報(bào)道ERK為Calpain的上游信號(hào)靶點(diǎn),p-ERK表達(dá)升高能提高Calpain活性,這些提示CHD大鼠心肌細(xì)胞可能通過(guò)ERK-Calpain2信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡。

      圖4 各組大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相對(duì)蛋白表達(dá)水平Fig.4 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group

      本研究實(shí)驗(yàn)組以BBR灌胃治療后發(fā)現(xiàn),模型動(dòng)物心肌ERS標(biāo)志物Cleaved caspase-12、GRP78和CHOP表達(dá)下降,凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)減弱。提示BBR能抑制CHD大鼠心肌發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡,而進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心肌Calpain2表達(dá)下調(diào),Calpastatin上調(diào),p-ERK蛋白下調(diào),提示ERK-Calpain2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱。

      綜上所述,BBR能抑制CHD大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡,該作用可能與抑制ERKCalpain2信號(hào)通路有關(guān)。

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