陳立柱 劉 嘉

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是胃、十二指腸內(nèi)容物反流入食管，引起食管或其他部位損傷的一種消化系統(tǒng)常見疾病。根據(jù)食管下端病變情況，GERD分為3種類型：食管下端黏膜未破損的非糜爛性反流病(non-erosive reflux disease，NERD)、食管下端存在黏膜破損的反流性食管炎(reflux esophagitis，RE)以及食管下端上皮化生為柱狀的Barrett食管(Barrett's esophagus，BE)[1]。研究表明，近10年來，胃食管反流病的發(fā)病率逐步上升，臨床上的預(yù)防和治療已引起人們的高度關(guān)注[2]。

GERD發(fā)生的原因主要是抗反流防御機制減弱和反流物攻擊食管黏膜，其中抗反流機制的削弱包括下食管括約肌功能失調(diào)、食管清除能力降低和食管黏膜屏障功能下降3種情況[3]。人體進食后，食物的機械性和化學(xué)性刺激導(dǎo)致胃酸分泌增加，引起機體胃酸增高或胃泌素分泌下降。若食管抗反流機制削弱，十二指腸和胃內(nèi)容物極易反流進入食管，刺激、損傷食管黏膜，從而導(dǎo)致GERD的發(fā)生和發(fā)展[4]。GERD癥狀多樣，包括胃灼燒、反酸、胸骨后痛等典型癥狀和咳嗽、咽喉不適、噯氣、哮喘等非典型癥狀或者食管外表現(xiàn)[5]。診斷方法主要依靠質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)試驗，胃鏡、喉鏡、造影，食管反流監(jiān)測，高分辨率測壓等，但上述方法局限性大，大部分屬于侵入性操作，患者依從性欠佳，限制了疾病的及時診斷。因此需要尋找易于接受、非侵入性的檢測方法，提高GERD的檢出率。血液、痰、唾液或反流物檢測有操作簡便、費用低、檢出率高及病人檢查前后無不適反應(yīng)，易于接受等優(yōu)勢，有望成為未來GERD診斷的方向。本研究重點對潛在的新的診斷標(biāo)記物發(fā)展和相關(guān)檢測技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀進行綜述。

1 GERD潛在的診斷標(biāo)記物

1.1 胃蛋白酶原和胃蛋白酶

胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)屬天冬氨酸蛋白酶家族，由375個氨基酸構(gòu)成，本身無活性，胃腔內(nèi)胃酸可將其激活為具有生物活性的胃蛋白酶，進而水解蛋白質(zhì)和多肽。人胃黏膜中包含7組胃蛋白酶同工酶原，其中PGI(PGA)由1～5組分組成，由胃底腺的主細(xì)胞分泌；PGII(PGC)由6～7組分組成，由全胃腺體和十二指腸的Brunnce腺細(xì)胞分泌[6]。PG由高爾基體分泌進入胃腔，然后少量PG通過毛細(xì)血管進入到血液循環(huán)，在血液中穩(wěn)定存在[7]。

GERD患者反流物的成分主要有胃酸、胃蛋白酶、膽汁和胰酶等，其中胃酸和胃蛋白酶對食管黏膜的攻擊作用最為顯著[4，8]。①在GERD的發(fā)病過程中，PG由胃酸激活為有生物活性的胃蛋白酶，兩者反流至食管或咽喉黏膜，導(dǎo)致相應(yīng)部位產(chǎn)生病理性損害，引起GERD癥狀[9]；②反流到食管或咽喉部的胃蛋白酶可長時間滯留于此，當(dāng)再次發(fā)生酸反流時胃蛋白酶可恢復(fù)其活性，從而再次引發(fā)燒灼感癥狀；③國內(nèi)外報道，GERD患者唾液中的PGI濃度超過健康人群，具有顯著性差異，可以作為標(biāo)志物指導(dǎo)GERD的臨床診斷[10]；④研究發(fā)現(xiàn)反流性食管炎、慢性萎縮性胃炎及胃癌患者體內(nèi)血清PG和PGR(胃蛋白酶原比值)的變化顯著，為診斷和評估病情提供重要價值[11]；⑤血清中PG含量聯(lián)合GerdQ評分可作為老年GERD治療后的隨訪指標(biāo)，為患者提供一種敏感、無創(chuàng)的檢查手段[12]；⑥PG作為GERD的敏感性指標(biāo)有一定的局限性，由于唾液的分泌受日間活動量、飲食習(xí)慣等多因素干擾，唾液中PG檢測準(zhǔn)確性不如血清PG，導(dǎo)致其與疾病的相關(guān)性受到影響；⑦血清PG也受年齡、性別、幽門螺桿菌等因素影響，男性明顯高于女性，PGI與PGI/PGII比值在老年組明顯下降，PGII與年齡呈正相關(guān)[13]。故分析其結(jié)果時，均應(yīng)思考上述影響因素。

胃蛋白酶是胃蛋白酶原經(jīng)胃酸活化后形成的一類能夠水解蛋白質(zhì)的消化性蛋白質(zhì)。最初，唾液胃蛋白酶作為診斷GERD的指標(biāo)被提出，隨后被多方報道驗證證實[14]。目前，胃蛋白酶已在多種樣本中檢測到，如喉黏膜、鼻竇黏膜、唾液、中耳滲出液、氣管分泌物以及肺泡黏膜灌洗液等，且已被證實與反流性疾病相關(guān)[15]。胃蛋白酶能準(zhǔn)確反映患者咽喉反流情況，有無創(chuàng)、快速、準(zhǔn)確、操作簡單及客觀性強等優(yōu)點，已被提出作為檢測GERD的新方法。但對采集樣本的時機、胃蛋白測定的方法、濃度的診斷閾值和參考的診斷標(biāo)準(zhǔn)還未達(dá)成統(tǒng)一共識。

1.2 胃泌素

胃泌素(gastrin，GAS)是一種由G細(xì)胞分泌產(chǎn)生的胃腸道激素，具有促進胃腸道分泌，調(diào)節(jié)食管下括約肌張力等功能[16]。人血液循環(huán)中的GAS是由不同長度和不同序列的氨基酸多肽混合物組成，主要包含胃泌素G-34和胃泌素G-17兩種異構(gòu)體[17]。胃泌素G-34主要存在于十二指腸黏膜內(nèi)；而胃泌素G-17占所有有活性胃泌素的80%～90%，主要存在于胃竇黏膜內(nèi)，可反映胃竇G細(xì)胞數(shù)量，與血清PG臨床作用相互補充[18]。研究發(fā)現(xiàn)，胃泌素可調(diào)節(jié)食管下端括約肌收縮，其分泌受胃酸含量控制，因此胃泌素與GERD存在密切關(guān)系，可輔助GERD的診斷治療[19]。

胃泌素在GERD臨床診斷中有一定局限性，血清G-17受幽門螺旋桿菌感染、性別、年齡、G細(xì)胞數(shù)量、胃內(nèi)pH值、糖尿病和惡性貧血等多因素及疾病影響，引起臨床診斷指標(biāo)的異常[20]。

1.3 細(xì)胞因子

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，反流性食管炎并不從食管黏膜表面化學(xué)性損傷開始，而是從黏膜下層的淋巴細(xì)胞開始，逐漸發(fā)展到黏膜表面的損傷[21]。GERD相關(guān)的炎性細(xì)胞包括食管黏膜的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和多型核白細(xì)胞，同時還包括食管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，這些細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性因子，如白細(xì)胞介素-6(interleukin，IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等[22]。

IL-6是由B細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞、T細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生的糖蛋白，能夠誘導(dǎo)B細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞等分化，調(diào)節(jié)機體的免疫防御機制。研究表明，與正常組對比，食管癌患者血清IL-6水平顯著升高，并且隨著食管癌等級的加深，血清IL-6水平呈現(xiàn)增長趨勢，同時研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后恢復(fù)良好IL-6水平明顯降低[23]。研究發(fā)現(xiàn)，BE患者血清和食管組織中IL-6水平較正常組也明顯升高[24]。雖然BE患者缺少炎癥反應(yīng)，但是在BE組織中Th2相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)升高。IL-6作為Th2型免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子，其水平增高激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進BE向腫瘤方向發(fā)展[25]。因此，血清IL-6可作為食管癌診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后判斷的一個有效輔助指標(biāo)。

TNF-α由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠介導(dǎo)機體免疫調(diào)節(jié)功能，參與炎癥反應(yīng)過程，并能夠刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，與反酸時食管黏膜過氧化反應(yīng)密切相關(guān)[26]。研究表明，TNF-α可激活NF-κB途徑，而后者是炎癥和癌癥發(fā)生過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)信號分子，并且研究顯示在反流性食管炎演化為BE過程中TNF-α起到一定作用[27]。

除了多種細(xì)胞因子參與GERD的形成與發(fā)展外，血清血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)也參與GERD的形成。VIP是一種含多個氨基酸殘基的堿基多肽，存在胃腸道內(nèi)的神經(jīng)和內(nèi)分泌細(xì)胞中，能夠促進腸道水和電解質(zhì)分泌，并參與各種細(xì)胞因子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞功能。胃腸道上皮細(xì)胞中存在大量VIP的特異性受體，隨著血液中VIP水平增加，VIP與胃腸道上皮細(xì)胞受體結(jié)合增多，導(dǎo)致食管下括約肌張力下降，從而誘發(fā)GERD[28]。

GERD患者與健康人群相比，血清IL-6、TNF-α、VIP水平顯著升高。不同類型GERD患者中，炎性因子的水平不同，一般EE組最高，BE組次之，NERD組最低，表明糜爛性食管炎(erosive esophagitis，EE)患者食管括約肌受損相比較重，且機體存在明顯炎癥反應(yīng)，治療過程中應(yīng)密切注意，BE及NERD患者常為慢性食管黏膜損傷，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)相對較弱。

1.4 Claudin蛋白家族

緊密連接是維持細(xì)胞粘附的結(jié)構(gòu)之一，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的運動和功能，維持上皮組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Claudin蛋白是組成緊密連接主要的骨架蛋白，與其他蛋白相互作用，維持緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能。Claudin蛋白表達(dá)異常，破壞緊密連接的完整，造成細(xì)胞粘附力下降，損害上皮組織屏障，引發(fā)多種疾病。目前發(fā)現(xiàn)Claudin蛋白家族的表達(dá)具有高度的組織特異性。研究表明Claudin 1、Claudin 3蛋白在食管鱗癌中顯著表達(dá)，而Claudin 4蛋白在食管鱗癌中較健康組無顯著性差異[29]。Claudin 4蛋白的表達(dá)主要聚集在腺體的緊密連接處，在BE和食管腺癌中異常高表達(dá)[30]。由此可見，Claudin蛋白家族有可能成為GERD的理想標(biāo)志物和治療靶點，但Claudin蛋白家族的表達(dá)規(guī)律、表達(dá)異常的應(yīng)用以及與GERD臨床的具體關(guān)聯(lián)需進一步研究。

1.5 膽汁酸

膽汁酸是膽汁中最主要的有機成分，膽汁酸引起食管黏膜損傷與其膜表面去污性相關(guān)。①膽汁酸具有親脂性，可溶解細(xì)胞膜脂質(zhì)，引起細(xì)胞膜破壞，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，能進入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度過高，破壞細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞壞死[31]；②膽汁酸鹽的刺激引起氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、自由基的產(chǎn)生，導(dǎo)致氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)、誘導(dǎo)DNA損傷[32]；③由于眾多基因和后生遺傳的蓄積，造成BE通過化生、不典型增生，最終導(dǎo)致癌變；④與健康人群對比，GERD患者胃液中膽汁酸水平顯著增高，且與胃黏膜損傷程度密切相關(guān)；⑤研究表明，在BE患者的食管中有更高濃度的膽汁酸(可比正常人高出10倍)，發(fā)生膽汁反流的患者比例高于其他組，BE患者中具有毒性的二級膽酸--去氧膽酸水平較其他GERD類型及消化不良患者高[33]。由此，膽汁酸可作為標(biāo)志物，輔助GERD的診斷。

研究表明，膽汁酸的功能受pH值影響，在pH＞6的條件下，膽汁酸呈極性離子態(tài)，不易引起細(xì)胞損傷；在pH=3～5的條件下，膽汁酸呈無極性非離子態(tài)，極易破壞細(xì)胞和產(chǎn)生活性氧成分；在pH值＜3的環(huán)境中，膽汁酸沉淀，不引起食管損傷[34]。因此在治療GERD過程中，需要將pH環(huán)境因素思考在內(nèi)，更加有效的控制GERD癥狀。

1.6 痰及支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)分析

胃食管反流性咳嗽是由于胃酸和其他胃內(nèi)容物反流進入食管，引起的反射性咳嗽，其臨床癥狀主要為咳嗽、反酸、胸骨后灼燒感等，容易被誤診為其他呼吸道疾病。對于原因不明的胃食管反流性咳嗽患者做痰及支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞學(xué)分析，有助于準(zhǔn)確判斷患者病情。采集深部痰或灌洗液，液化后，圖涂片染色，顯微鏡下進行總細(xì)胞計數(shù)和分類。嗜酸性粒細(xì)胞增高，提示存在支氣管哮喘、嗜酸性粒細(xì)胞支氣管炎和過敏性疾??；中性粒細(xì)胞增高提示存在非哮喘性慢性咳嗽、胃食管反流性咳嗽。GRED患者治療前后的痰細(xì)胞進行比較發(fā)現(xiàn)，治療前主要是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，治療后中性粒細(xì)胞明顯減少，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)目升高。該方法學(xué)重復(fù)性好，與氣管黏膜活檢檢測結(jié)果的相關(guān)性較好，有助于病情、治療效果的診斷。

1.7 胃幽門螺旋桿菌

幽門螺旋桿菌(helicobacter pylori，HP)是一種主要存在于胃黏膜組織中的革蘭氏陰性微需氧螺旋形桿菌。HP利用自身的螺旋性特性，寄生于靠近胃黏膜上皮的粘液中，導(dǎo)致胃炎、胃潰瘍、甚至胃癌等疾病。目前，許多研究認(rèn)為HP所致的胃部炎癥及炎癥刺激產(chǎn)生一些可抑制壁細(xì)胞產(chǎn)酸的因子；胃竇部HP感染引起胃泌素升高，提高食管下括約肌(low esophageal sphincte，LES)的壓力，加速胃排空和加快胃竇部的蠕動；HP產(chǎn)生氨和尿素酶，保護細(xì)菌，中和胃酸，從而導(dǎo)致HP感染能夠抑制GERD的發(fā)展[35]。

流行病學(xué)研究提示，HP感染與GERD之間有著相互制約的關(guān)系。在發(fā)達(dá)國家HP的感染率逐步下降，而GERD的發(fā)病率卻不斷上升；GERD患者中的HP感染發(fā)生率較對照組明顯降低[36]。臨床也有胃食管返流病在HP根除后發(fā)生率增加的調(diào)查報告[37]。HP的感染人群遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于胃食管反流人群，并且HP的感染對胃酸分泌的影響存在不確定性(有可能增加、降低和保持不變)，因此通過檢測是否有HP感染可以指導(dǎo)和評估GERD患者的治療效果。對伴有HP感染和GERD發(fā)病的患者，需兼顧除菌和PPI治療。

2 相關(guān)臨床或?qū)嶒炇以\斷方法

PGI、PGII、胃泌素和細(xì)胞因子測定方法有多種，如免疫層析法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法和免疫比濁法等，其中PGI、PGII以免疫比濁法最常用，胃泌素、細(xì)胞因子以免疫層析法為主。

2.1 免疫層析法

免疫層析法是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品(尿液或血清)后，由于毛細(xì)管作用，樣品沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金、免疫酶或熒光物質(zhì)標(biāo)記，可使該區(qū)域顯示一定的顏色或熒光，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。免疫層析成本低，操作簡便快速，不需任何附加設(shè)備，5～10 min即可出結(jié)果，適用于醫(yī)院、衛(wèi)生防疫、診所和家庭等，主要用于定性檢測或半定量檢測。

2.2 化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光法是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測靈敏度高，自動化程度高，少量標(biāo)本時相對簡便。但化學(xué)發(fā)光試劑多為非開放型，試劑價格較高。發(fā)展樣品小型化的化學(xué)發(fā)光儀用于即時檢驗(point of care testing，POCT)監(jiān)測成為一個新的熱點和增長點。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物高效催化作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后顏色變化，通過酶標(biāo)儀對檢測樣品進行定量測定和分析，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線對照計算出PGI含量。ELISA法具有高度的敏感性、特異性，且試劑比較穩(wěn)定，無放射性污染，但存在操作復(fù)雜、耗時較長的缺點。

2.4 免疫比濁法

免疫比濁法是在一定量的抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時間后形成抗原抗體復(fù)合物，用濁度計測量反應(yīng)液體的濁度，并由此推算樣品中的抗原含量。免疫比濁法按測試方法可分為透射比濁法和散射比濁法。透射比濁法主要通過檢測透射光強度測定抗原抗體復(fù)合物所形成的濁度，散射比濁法通過檢測散射光強度測定抗原抗體復(fù)合物所形成的濁度。與透射比濁法相比，散射比濁法能很好地解決鉤狀效應(yīng)(Hook)對測試結(jié)果的影響。由于此方法為均相反應(yīng)，反應(yīng)速度較快，檢測時間短，臨床應(yīng)用的場景比較廣泛，常用于特定蛋白分析儀和全自動生化分析儀，既可以用于POCT檢測，也可以適用于中心實驗室檢測。

3 其他病理分析方法

除上述體外診斷生物標(biāo)記物外，GERD也可通過內(nèi)窺鏡檢測等病理檢測技術(shù)進行輔助診斷。1999年全國反流性食管病研討會制定了胃食管病的內(nèi)鏡診斷標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)鏡分類診斷方法，包括Savary Millerl51、洛杉磯分類標(biāo)準(zhǔn)及日本RE分級標(biāo)準(zhǔn)等，但上述分類方法都有一定缺陷，分級比較籠統(tǒng)，靈敏度等問題亟待解決，以及病理組織分級診斷標(biāo)準(zhǔn)與胃鏡下診斷分級標(biāo)準(zhǔn)存在出入，待進一步研究和統(tǒng)一[38]。在組織病理學(xué)標(biāo)記物上包括細(xì)胞間黏附分子、細(xì)胞間隙增寬等，組織電阻抗光譜法可通過內(nèi)鏡孔道在內(nèi)鏡檢查時快速測量食管黏膜完整性。褚傳蓮等[39]報道，共聚焦激光顯微內(nèi)鏡對非糜爛性反流病微觀變化的診斷價值，可以清晰地觀察到食管黏膜上皮乳頭內(nèi)毛細(xì)血管袢(intraepithelial papillary capillary loops，IPCLs)形態(tài)、管徑的變化及細(xì)胞間隙增寬，是一種新的非糜爛性反流病檢查方法。

4 展望

GERD是一種極易誤診的常見消化道疾病，存在多種非典型癥狀如咳嗽、哮喘、吞咽困難等，診斷存在較大困難。目前常用的檢測手段侵入性強、價格昂貴，且具有一定的誤診率，因此，需要一種簡便、有效及敏感性高的診斷技術(shù)。經(jīng)過研究，胃蛋白酶原和胃蛋白酶、胃泌素、細(xì)胞因子、Claudin蛋白家族、膽汁酸等指標(biāo)在GERD患者中具有明顯的分泌異常，可作為GERD診斷標(biāo)志物。雖然目前這些GERD異常標(biāo)志物依舊受多種因素影響，存在各自的局限性，但是有望成為今后GERD診斷發(fā)展方向。HP無法準(zhǔn)確作為GERD診斷標(biāo)志物，但HP指標(biāo)在指導(dǎo)GERD治療至關(guān)重要。由于GERD患病率逐年增加和臨床癥狀的多樣性，各種篩查手段仍然需要大量試驗進行驗證，以提高GERD的診斷率。