陳來運 袁超 孫曉萍

摘要：旨在探究4個綿羊品種的多胎性狀分子遺傳機制，以高山美利奴羊、青海細毛羊、中國美利奴羊和敖漢細毛羊為研究對象，通過分析全基因組測序結(jié)果對4個綿羊品種FSHR基因外顯子單核苷酸多態(tài)性進行篩選，利用專門軟件預(yù)測單核苷酸多態(tài)性對FSHR基因mRNA二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，高山美利奴羊、中國美利奴羊、敖漢細毛羊FSHR基因在外顯子上分別存在3個SNPs（T904G、C975T、G1572A）、7個SNPs（G149A、G813A、T817C、T904G、C975T、T1234C、G1572A）、6個SNPs（G813A、T817C、T904G、C975T、T1234C、G1572A），青海細毛羊FSHR基因在外顯子上不存在突變位點。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，試驗所檢測到的7個SNPs中T817C、T904G、T1234C導(dǎo)致mRNA的二級結(jié)構(gòu)和最小自由能發(fā)生改變，G813A引起最小自由能改變，而未引起mRNA二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，G149A、C975T與G1572A未引起最小自由能與mRNA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。5個錯義突變位點（G149A、G813A、T904G、C975T、G1572A）均導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

關(guān)鍵詞：綿羊;FSHR基因;多態(tài)性;SNPs;生物信息學(xué)分析

中圖分類號： S826.2 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0047-05

卵泡刺激素受體（follicle-stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR）屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的糖蛋白亞家族成員，成熟的FSHR是由二硫鍵構(gòu)成的穩(wěn)定低聚體[1]。FSHR與FSH（follicle stimdating hormone，F(xiàn)SH）功能的發(fā)揮有著緊密的聯(lián)系[2]。FSH是由垂體合成并分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，在卵泡生長過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其是一種不能穿過細胞膜的生物大分子，必須通過FSHR特異性介導(dǎo)[3]。因此，F(xiàn)SHR對動物卵泡的發(fā)育與成熟具有重要作用，從而對動物繁殖性狀造成影響。研究證實，F(xiàn)SHR基因顯著影響動物繁殖性狀，吳井生等對106頭小梅山豬研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因第10個外顯子存在2個多態(tài)位點對小梅山豬產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響，在P1位點上，2胎以上小梅山母豬中AA型個體的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)比BB型分別顯著高出1.95、1.66頭（P<001）;在P3位點上，2胎以上及所有胎次的母豬中，DD型個體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均極顯著高于CC型（P<0.01）[4]。邢耀潭對12頭單胎、92頭雙胎天祝白牦牛研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因 P3片段（-1 195 bp處）在天祝白牦牛單胎群體和雙胎群體中，雙胎母牛的突變率顯著高于單胎母牛的突變率，說明FSHR基因很可能是控制天祝白牦牛雙胎性狀的主效基因[5]。Chu等統(tǒng)計252只小尾寒羊不同F(xiàn)SHR基因型產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘平均值和標準差，發(fā)現(xiàn)FSHR基因不同基因型產(chǎn)羔數(shù)存在極顯著差異[6]。

Jiang等于2014年公布綿羊新一代從頭測序的基因組信息，綿羊FSHR基因（GenBank登錄號為NC_019460）位于第3號染色體上，基因全長196 149 bp，包含9個內(nèi)含子和10個外顯子，外顯子總長為2 431 bp，編碼395個氨基酸[7]。目前，對動物FSHR基因SNP的研究主要集中于豬[4，8]、牛[5，9]、羊[6，10]等的第10個外顯子及5′ 側(cè)翼區(qū)，但對FSHR基因其他外顯子分析較少。因此，本研究選取高山美利奴羊、青海細毛羊、中國美利奴羊和敖漢細毛羊為研究對象，根據(jù)全基因組測序的結(jié)果，分析FSHR基因外顯子在4個綿羊品種上的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），并對篩選出的SNPs進行生物信息學(xué)分析，以期篩選出與4個綿羊品種產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的遺傳標記，為4個綿羊品種多胎性狀的研究奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集30只高山美利奴羊（甘肅省綿羊繁殖技術(shù)推廣站）、30只中國美利奴羊（新疆鞏乃斯種羊場）、30只敖漢細毛羊（內(nèi)蒙古敖漢種羊場）、30只青海細毛羊（青海省三角城種羊場）共120只羊血樣，每只羊頸部靜脈采血5 mL于江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司EDTA-K2抗凝真空采血管中，每只綿羊分別采集2管血液樣品，于-20 ℃冰箱冷凍保存，用于DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 全基因組測序 4個綿羊品種共120只，分別對每只羊取1管血液并送至北京諾禾致源科技股份有限公司，提取DNA樣品（試驗過程中須無降解、無污染、無斷裂等，以保證所提4個綿羊品種DNA純度及完整性），經(jīng)檢測合格的4個綿羊品種的DNA樣品分別每個樣品取2 μg用于10×genomics平臺建庫，基于Illumina Hiseq平臺進行雙末端 150 bp 測序。根據(jù)2014年公布的綿羊參考基因組Oar_v 40（GCF_000298735.2），利用不同綿羊品種的測序結(jié)果序列reads，應(yīng)用SOAPdenovo（諾禾自主研發(fā)軟件）進行組裝得到長的序列片段，然后利用lastz軟件獲得4個綿羊品種的每個個體全基因組信息，該試驗由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.2 FSHR基因多態(tài)位點篩選 將120個未分群未過濾的SNP vcf文件按照4個品種（高山美利奴羊、青海細毛羊、中國美利奴羊、敖漢細毛羊）進行分群，所用軟件為vcftools_v 0114。將分好群的SNP文件進行過濾，過濾條件為：單個樣本測序覆蓋深度>2、maf（最小等位基因頻率）>0.05、mis（缺失）<0.1。根據(jù)FSHR基因位置信息：Chromosome 2，NC_000002.12 （48953161-49154527，complement），利用 vcftools_v 0.1.14軟件進行4個綿羊品種FSHR基因外顯子SNP位點的提取，然后統(tǒng)計各個品種FSHR基因外顯子SNP位點數(shù)，利用A-NNOVAR軟件將各個品種FSHR基因外顯子SNP位點進行注釋。

1.2.3 FSHR基因多態(tài)位點遺傳多樣性分析 通過生物學(xué)分析軟件POPGEN 1.32軟件統(tǒng)計4個綿羊品種FSHR基因各SNPs位點的野生型、雜合型及突變純合型的基因型頻率、野生型和突變型等位基因頻率、Hardy-Weinberg平衡檢驗，利用群體多態(tài)信息含量（PIC）計算程序計算4個綿羊品種FSHR基因各SNPs位點遺傳多樣性參數(shù)多態(tài)信息含量（PIC）。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 4個綿羊品種FSHR基因由于SNPs產(chǎn)生了不同的基因型。利用RNA二級結(jié)構(gòu)分析軟件RNAfold進行4個綿羊品種不同基因型的FSHR基因RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用NPSA軟件中的MLRC程序進行4個綿羊品種不同基因型的FSHR基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;利用蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件SWISS-MODEL進行4個綿羊品種不同基因型的FSHR基因蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個綿羊品種FSHR基因外顯子SNPs篩選

根據(jù)4個綿羊品種共120只羊的全基因組測序結(jié)果與綿羊參考基因組比對分析4個綿羊品種FSHR基因外顯子上存在的多態(tài)位點，高山美利奴羊FSHR基因外顯子上共發(fā)現(xiàn)3個SNPs，包括2個轉(zhuǎn)換位點（C→T、G→A）和1個顛換位點（T→G）;中國美利奴羊FSHR基因外顯子上共發(fā)現(xiàn)7個SNPs，包括6個轉(zhuǎn)換位點（3個G→A、2個T→C和1個C→T）和1個顛換位點（T→G）;敖漢細毛羊INHA外顯子上FSHR基因外顯子上共發(fā)現(xiàn)6個SNPs，包括5個轉(zhuǎn)換位點（2個G→A、2個T→C和1個C→T）和1個顛換位點（T→G）;青海細毛羊FSHR基因外顯子上沒有發(fā)現(xiàn)突變。通過對4個綿羊品種FSHR基因外顯子氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，高山美利奴羊發(fā)生了3個錯義突變，中國美利奴羊存在2個同義突變T817C、T1234C和5個錯義突變G149A、G813A、T904G、C975T、G1572A，敖漢細毛羊存在2個同義突變T817C、T1234C和5個錯義突變G149A、G813A、T904G、C975T、G1572A，4個綿羊品種FSHR基因外顯子均不存在無義突變（表1）。

2.2 4個綿羊品種多態(tài)位點統(tǒng)計學(xué)分析

根據(jù)4個品種共120只羊的全基因組測序結(jié)果分析高山美利奴羊FSHR基因外顯子SNPs位點基因型頻率、基因頻率、Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)檢測（χ2、P值）、群體多態(tài)信息含量（PIC）計算結(jié)果。高山美利奴羊FSHR基因外顯子上檢測到的T904G、C975T、G1572A均表現(xiàn)出野生型和突變雜合型2種基因型，野生型基因型頻率均高于突變雜合型基因型頻率，野生型等位基因T、C、G分別為優(yōu)勢等位基因，均表現(xiàn)為低度多態(tài)。中國美利奴羊FSHR基因外顯子上檢測到的G149A、T904G、C975T、T1234C、G1572A表現(xiàn)出野生型和突變雜合型2種基因型，野生型基因型頻率均高于突變雜合型基因型頻率，野生型等位基因G、T、C、T、G分別為優(yōu)勢等位基因，均表現(xiàn)為低度多態(tài);中國美利奴羊FSHR基因外顯子上檢測到的G813A、T817C表現(xiàn)出野生型、突變雜合型和突變純合型3種基因型，G813A野生型基因型頻率高于突變雜合型與突變純合型基因型頻率和等位基因G為優(yōu)勢等位基因，T817C突變雜合型基因型頻率高于野生型與突變雜合型基因型頻率和等位基因C為優(yōu)勢等位基因，G813A、T817C都表現(xiàn)為中度多態(tài)。敖漢細毛羊FSHR基因外顯子上檢測到的T904G、C975T、G1572A表現(xiàn)出野生型和突變雜合型2種基因型，野生型基因型頻率均高于突變雜合型基因型頻率，野生型等位基因T、C、G分別為優(yōu)勢等位基因，均表現(xiàn)為低度多態(tài)。敖漢細毛羊FSHR基因外顯子上檢測到的G813A、T817C、T1234C表現(xiàn)出野生型、突變雜合型和突變純合型3種基因型，G813A和T1234C野生型基因型頻率高于突變雜合型與突變純合型基因型頻率和等位基因G、T分別為優(yōu)勢等位基因，T817C突變雜合型基因型頻率高于野生型與突變雜合型基因型頻率和等位基因C為優(yōu)勢等位基因，G813A、T817C和T1234C都表現(xiàn)為中度多態(tài);高山美利奴羊、中國美利奴羊和敖漢細毛羊FSHR基因外顯子上檢測到的所有突變位點χ2值均未達到顯著水平（P>0.05），說明3個綿羊品種FSHR基因外顯子上檢測到的所有突變位點均達到Hardy-weinberg平衡狀態(tài)（表2）。

2.3 FSHR基因的RNA二級結(jié)構(gòu)分析

利用RNA二級結(jié)構(gòu)分析軟件RNAfold預(yù)測3個綿羊品種不同基因型的FSHR基因mRNA二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖1），表明G149A、C975T、G1572A位點的突變不會導(dǎo)致最小自由能的改變，G149A、C975T、G1572A位點的變異也不會導(dǎo)致mRNA二級結(jié)構(gòu)的改變;G813A位點的突變最小自由能增加，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，G813A未導(dǎo)致mRNA二級結(jié)構(gòu)的改變;T817C、T904G和T1234C位點的突變均導(dǎo)致FSHR基因最小自由能改變，其中T817C導(dǎo)致FSHR基因RNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能降低，二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加，T904G和T1234C位點的突變導(dǎo)致FSHR基因RNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能增加，二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，T817C、T904G和T1234C位點的突變導(dǎo)致FSHR基因mRNA二級結(jié)構(gòu)的改變。

2.4 FSHR基因多態(tài)位點蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用NPSA軟件中的MLRC程序進行4個綿羊品種不同基因型的FSHR基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，結(jié)果表明，F(xiàn)SHR基因編碼蛋白質(zhì)為全α蛋白，不存在β-轉(zhuǎn)角。錯義突變G149A位點使編碼蛋白質(zhì)無規(guī)則卷曲所占比例減少，擴展鏈所占比例增加，α-螺旋所占比例不變;錯義突變G813A位點使編碼蛋白質(zhì)α-螺旋所占比例減少，無規(guī)則卷曲與擴展鏈所占比例增加;錯義突變位點T904G使編碼蛋白質(zhì)無規(guī)則卷曲與α-螺旋所占比例減少，擴展鏈所占比例增加;錯義突變位點C975T使編碼蛋白質(zhì)無規(guī)則卷曲所占比例減少，α-螺旋與擴展鏈所占比例增加;錯義突變位點G1572A使編碼蛋白質(zhì)無規(guī)則卷曲與擴展鏈所占比例減少，α-螺旋所占比例增加。

2.5 FSHR基因多態(tài)位點蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件SWISS-MODEL進行3個綿羊品種不同基因型的FSHR基因蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，結(jié)果表明，3個綿羊品種各錯義突變位點導(dǎo)致FSHR基因蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相一致。

3 討論

羊的繁殖性狀是影響羊養(yǎng)殖業(yè)的重要經(jīng)濟性狀，直接影響綿羊養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)成本與生產(chǎn)效益，限制綿羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，因此提高綿羊的繁殖性能對畜牧業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義[11]。大量研究表明，F(xiàn)SHR與哺乳動物的繁殖性狀有密切的關(guān)系，例如雌性動物卵巢功能[12-13]、卵泡生長發(fā)育[14]和雌性動物睪丸發(fā)育[15]、精子發(fā)生[16]、精子活力與精液質(zhì)量[17-19]等。近年，關(guān)于哺乳動物FSHR基因多態(tài)性與多胎性狀之間的關(guān)系研究較多。許瑤等研究豬FSHR基因外顯子10的多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)間的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因可作為提高豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標記[8]。陳祥等對220只產(chǎn)羔記錄完整的黔北麻羊FSHR基因SNPs位點的不同基因型與繁殖性狀進行分析，在C1246A位點，黔北麻羊群體中BB型個體的產(chǎn)羔數(shù)與AA型和AB型差異顯著（P<0.05）[10]。Pan等對FSHR基因的5′側(cè)翼區(qū)與產(chǎn)羔數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)綿羊FSHR基因與綿羊產(chǎn)羔數(shù)極顯著相關(guān)（P<0.01），CC的基因型比TC和TT多0.42（P<0.01）和0.53（P<0.01），表明綿羊FSHR基因可以作為提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)候選基因[20]。

由上述研究可推測，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性與高山美利奴羊、青海細毛羊、中國美利奴羊、敖漢細毛羊的多胎性狀也存在相關(guān)性。本研究通過分析4個品種全基因組測序結(jié)果，首次對4個綿羊品種FSHR的全外顯子的單核苷酸多態(tài)性進行研究。研究發(fā)現(xiàn)，高山美利奴羊FSHR基因在外顯子上存在3個多態(tài)位點（T904G、C975T、G1572A），中國美利奴羊FSHR基因在外顯子上存在7個多態(tài)位點（G149A、G813A、T817C、T904G、C975T、T1234C、G1572A）、敖漢細毛羊FSHR基因在外顯子上存在6個多態(tài)位點（G813A、T817C、T904G、C975T、T1234C、G1572A）。4個品種之間檢查結(jié)果與龍威海等對黔北麻羊FSHR基因的檢測結(jié)果[21]及王惠娥等對多浪羊和卡拉庫爾羊FSHR基因的檢測結(jié)果[22]存在差異，可能是由地域不同造成的自然選擇不同或者是品種的不同造成的?；蛲怙@子編碼氨基酸序列，外顯子上的單核苷酸突變可能會造成RNA二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)改變，進而對其生物學(xué)功能造成影響[23]。本研究所檢測7個SNPs中T817C、T904G、T1234C既使mRNA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，又改變了最小自由能，G813A只改變最小自由能，mRNA二級結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，G149A與C975T、G1572A既沒有使最小自由能發(fā)生改變，又沒有改變mRNA的二級結(jié)構(gòu)。堿基突變會導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，本研究對4個品種所檢測的7個多態(tài)位點中5個錯義突變位點（G149A、G813A、T904G、C975T、G1572A）進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，5個突變位點會導(dǎo)致 α-螺旋、無規(guī)則卷曲、擴展鏈的比例發(fā)生改變，進一步分析蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)錯義導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的改變，對FSHR基因功能是否造成影響還需要進一步的試驗研究。

本試驗為高山美利奴羊、青海細毛羊、中國美利奴羊、敖漢細毛羊的FSHR基因多態(tài)性與多胎性相關(guān)性的研究提供了參考，后續(xù)試驗研究將進一步分析試驗結(jié)果中的各品種FSHR基因SNPs位點與綿羊多胎性狀相關(guān)性，研究FSHR基因多態(tài)性對綿羊產(chǎn)羔數(shù)的影響。

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