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(1.渤海大學食品科學研究院,遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧錦州 121013;2.中國農(nóng)業(yè)大學,食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083)

酪蛋白是乳中含量最多的一大類蛋白的總稱,約占牛乳中總蛋白含量的80%。根據(jù)對游離態(tài)鈣離子的敏感程度,酪蛋白分為四類:αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白。酪蛋白在牛乳中不是單獨存在的,而是與磷酸鈣相互結(jié)合形成直徑約為200nm的近似球狀的復合物,即“酪蛋白膠束”[1]。牛乳中的酪蛋白膠束具有很高的穩(wěn)定性。自從二十世紀六十年代以來,很多學者對酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)進行了深入而細致的研究,但是對其結(jié)構(gòu)的闡述仍停留在理論模型的假說方面,尚無一致的結(jié)論[2]。

早在十九世紀人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了酪蛋白膠束的存在[3]。但是直到二十世紀六十年代時,酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)才逐漸成為乳品工作中研究的熱點。到目前為止,盡管食品生產(chǎn)者可以根據(jù)一些經(jīng)驗操作生產(chǎn)出一些與酪蛋白膠束相關(guān)的食品(如奶酪、酸奶、奶粉和干酪素)[4],但是由于人們對酪蛋白膠束的內(nèi)部結(jié)構(gòu)尚不明確,因此限制了酪蛋白膠束的一些更為廣泛地應(yīng)用,如一些營養(yǎng)物質(zhì)載體的制備或者具有特定功能性質(zhì)產(chǎn)品的生產(chǎn)[5]。本文就酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)和部分重要的理化性質(zhì)研究進展進行綜述,以期對乳蛋白資源的開發(fā)和利用提供一些思路。

1 酪蛋白膠束中蛋白的組成

αs1-酪蛋白在荷斯坦牛乳中占總酪蛋白含量的40%左右,共由199個氨基酸組成,其分子質(zhì)量約為2.3萬道爾頓。由于αs1-酪蛋白中含有8個磷酸絲氨酸殘基,因此其每個分子結(jié)構(gòu)中含有8個磷酸化的礦質(zhì)元素結(jié)合位點(主要是無機磷、鈣和鎂)[6]。其結(jié)構(gòu)的疏水性見圖1。從圖1可以看出,αs1-酪蛋白中的疏水區(qū)域和親水區(qū)域在其結(jié)構(gòu)的劃分并不明顯,兩者基本呈交替出現(xiàn)的狀態(tài)[7]。

圖1 αs1-酪蛋白的疏水性示意圖[12] Fig.1 The hydrophobicity of αs1-casein

αs2-酪蛋白的含量約占荷斯坦牛乳酪蛋白總含量的10%,其分子質(zhì)量也約為2.3道爾頓,共由207個氨基酸組成[8]。αs2-酪蛋白中共含有10個磷酸絲氨酸殘基。其結(jié)構(gòu)的疏水性見圖2,其結(jié)構(gòu)中含有2個疏水性比較強的區(qū)域,分布于C端的160～207位和90～120位[6]。

圖2 αs2-酪蛋白的疏水性示意圖[12] Fig.2 The hydrophobicity of αs2-casein

β-酪蛋白在荷斯坦牛乳中占總酪蛋白含量的40%左右,共由209個氨基酸組成,其分子質(zhì)量約為2.4萬道爾頓[9]。由于β-酪蛋白中含有5個磷酸絲氨酸殘基,因此其每個分子結(jié)構(gòu)中含有5個磷酸化的礦質(zhì)元素結(jié)合位點(主要是無機磷、鈣和鎂)。其結(jié)構(gòu)的疏水性見圖3,β-酪蛋白中的疏水區(qū)域約占其總鏈長度的3/4,是所有酪蛋白中疏水性最強的[10]。

圖3 β-酪蛋白的疏水性示意圖[12] Fig.3 The hydrophobicity of β-casein

κ-酪蛋白約占荷斯坦牛乳中總酪蛋白含量的10%,含有169個氨基酸殘基,其分子質(zhì)量約為1.9萬道爾頓[11]。與其它酪蛋白最大的不同是,κ-酪蛋白中不含磷酸絲氨酸殘基,所以也就不能結(jié)合鈣、無機磷和鎂等礦質(zhì)元素。同時κ-酪蛋白的糖基化程度很高。此外,凝乳酶可以切斷κ-酪蛋白中105位和106位的氨基酸之間的肽鍵,使κ-酪蛋白的負電荷消失,從而導致酶凝乳凝膠的形成[10]。

2 酪蛋白膠束中礦質(zhì)元素的組成

酪蛋白膠束中主要的礦質(zhì)元素占膠束中干重的百分比見表1。盡管膠束中含有鎂、鋅、鈉、鉀和檸檬酸等鹽類物質(zhì),但是磷酸鈣的含量約占總膠束中鹽含量的90%。磷酸鈣在膠束中的存在形式有很多種,鈣和無機磷在溶解相和膠束中動態(tài)平衡見圖4。膠束中鈣和無機磷的含量分別約占牛乳中總鈣和總磷含量的72%和48%[13]。根據(jù)膠束中鈣和磷的摩爾比,人們可以推斷出磷酸鈣在膠束中的存在形式。但是不同的學者所得到的鈣和磷的摩爾比是不同的。有的學者通過研究認為,膠束中的鈣和無機磷的摩爾比約等于1.5,因此就認為膠束中的磷酸鈣是Ca3(PO4)2。但是這一結(jié)論存在著明顯的不足之處。由前述可知,膠束中的酪蛋白中含有很多磷酸化的位點,這些磷酸化位點中的磷不可能是以無機磷狀態(tài)存在的,因此這一結(jié)論中并沒有將膠束中磷酸化的有機磷部分除去,因此這一結(jié)論存在著很大的爭議。但是目前尚無一種新技術(shù),能夠?qū)业鞍啄z束中磷酸鈣的確切組成進行檢測。

圖4 鈣和磷在膠束相和溶解相中的存在形式 Fig.4 The existential form of calcium an phosphate in micelle and serum phase

3 酪蛋白膠束的基本理化性質(zhì)

水分子、酪蛋白和礦質(zhì)元素共同組成了牛乳中的酪蛋白膠束。除去水分子后的酪蛋白膠束含有約93%的酪蛋白和7%的礦質(zhì)元素。酪蛋白膠束的具體組成成分和基本的理化性質(zhì)分別見表1和表2。盡管將牛乳中這種酪蛋白與礦質(zhì)元素的復合體稱為“膠束”,但是酪蛋白膠束與傳統(tǒng)意義上的膠束還是存在著很大的區(qū)別[14]。酪蛋白膠束是由約2萬個酪蛋白分子結(jié)合在一起的,但是它們的結(jié)構(gòu)并不像傳統(tǒng)意義上的膠束一樣具有親水的頭部和疏水的尾部。礦質(zhì)元素、αs-和β-酪蛋白組成了酪蛋白膠束的內(nèi)部結(jié)構(gòu),而κ-酪蛋白覆蓋在酪蛋白膠束的表面,對維持膠束的穩(wěn)定性起到了重要的作用。值得我們注意的是,酪蛋白膠束的內(nèi)部包含著大量的水(平均每克蛋白要結(jié)合3～4g水),這是酪蛋白膠束內(nèi)部結(jié)構(gòu)的一個很重要的特點。

表1 荷斯坦牛乳酪蛋白膠束的組成[15]Table 1 The composition of casein micelles in cow milk

表2 牛乳酪蛋白膠束的理化性質(zhì)[16]Table 2 The physicochemical poperties of cow casein micelles

酪蛋白在乳中濃度約為25g/kg[17]。在牛乳中四種酪蛋白(αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白)的比例約為4∶1∶3.5∶1.5。在有些物種的酪蛋白膠束中,可能沒有其中的一種及以上酪蛋白,或者說各個酪蛋白的相對或者絕對比例是不同的[1],或者對于同一種酪蛋白而言,其氨基酸的序列存在差異。比如,人乳中酪蛋白的含量約為4g/kg,占人乳中總蛋白含量的30%～50%。人乳中的這些酪蛋白以β-酪蛋白為主,αs-酪蛋白的含量幾乎沒有。

在牛乳中αs-和β-酪蛋白具有多個磷酸化基團,它們的氨基酸序列中都含有SerP-SerP-SerP-X-SerP序列。這一氨基酸序列使酪蛋白能夠結(jié)合大量的鈣離子,從而使酪蛋白發(fā)生沉淀[4]。這些磷酸化的色氨酸殘基也能夠使得磷酸鈣與酪蛋白結(jié)合。κ-酪蛋白只有一個磷酸絲氨酸殘基,因此即使在很高的鈣離子濃度的條件下,仍然不能發(fā)生沉淀。所有的酪蛋白都含有一定數(shù)量的疏水性氨基酸,κ-和β-酪蛋白含有大量的疏水區(qū)域。所有的酪蛋白都沒有太多規(guī)則的二級結(jié)構(gòu),同時也沒有固定不變的三級結(jié)構(gòu)。因此它們的結(jié)構(gòu)被稱為流變性的或者無定形態(tài)的結(jié)構(gòu)。這就意味著酪蛋白的結(jié)構(gòu)很容易隨著外界環(huán)境的變化而變化。

4 酪蛋白膠束理論結(jié)構(gòu)模型的研究進展

到目前為止,由于檢測手段的限制,人們還不能全面地闡述酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)[18]。目前為止,人們針對膠束的理化性質(zhì)在不同條件下的行為得出一致結(jié)論是,酪蛋白膠束是一種類似于覆盆子的結(jié)構(gòu),而不是一種單純的球體結(jié)構(gòu),其掃描電鏡圖見圖5[19]。κ-酪蛋白位于酪蛋白膠束的表面,決定了酪蛋白膠束的很多性質(zhì),尤其是膠束的穩(wěn)定性。κ-酪蛋白中的106至169位片段所組成的聚電解質(zhì)(簡稱酪蛋白糖巨肽)伸向溶液中,通過靜電斥力和空間位阻效應(yīng)保持膠束之間的穩(wěn)定性[4]。酪蛋白糖巨肽是高度親水性的多肽段,不僅包含一個磷酸化基團,而且含有多個糖基化的基團。糖巨肽中的親水性氨基酸能夠與水分子緊密結(jié)合。所以酪蛋白膠束表面就通過κ-酪蛋白與水分子結(jié)合形成5～10nm的毛發(fā)層結(jié)構(gòu)。這種毛發(fā)層結(jié)構(gòu)使酪蛋白膠束之間維持很好的空間位阻效應(yīng)。

圖5 酪蛋白膠束的冷場發(fā)射電鏡的掃描圖 Fig.5 Picture obtained from field emission scanning eletron microscope

由于目前的研究手段和技術(shù)是無法直接檢測和觀察酪蛋白膠束的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的,所以酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)一直處于理論假設(shè)和模型的建立階段。這些模型中比較著名的理論結(jié)構(gòu)模型有套核結(jié)構(gòu)模型、內(nèi)部結(jié)構(gòu)模型、亞單元結(jié)構(gòu)模型和Holt結(jié)構(gòu)模型。

套核結(jié)構(gòu)模型:酪蛋白膠束的內(nèi)部是as-酪蛋白和β-酪蛋白通過疏水作用力結(jié)合而成,κ-酪蛋白位于酪蛋白膠束的表面,組成了膠束的“外套”,這樣酪蛋白膠束就呈現(xiàn)一種放射狀的玫瑰花似的聚合體[20]。

亞單元模型:不同的酪蛋白單體之間相互聚合形成了一個個小單元,這些小單元相互結(jié)合形成酪蛋白膠束[21-22]。見圖6所示,首先,單體酪蛋白分子通過分子間的疏水作用相結(jié)合成一個個亞單元。這些亞單元總共含約20個單體酪蛋白分子。它們又可以分為兩大類:富含β-和as-酪蛋白組成的亞單元和κ-酪蛋白組成的亞單元。κ-酪蛋白組成的亞單元占總亞單元的比例較少,覆蓋在酪蛋白膠束的表面,而含β-和as-酪蛋白組成的亞單元存在于膠束的內(nèi)部。膠體磷酸鈣將各個亞單元連接起來[21]。但是到目前為止,尚沒有任何實驗?zāi)軌蜃C明酪蛋白膠束中富含β-和as-酪蛋白組成的亞單元和κ-酪蛋白組成的亞單元的存在。

圖6 亞單元結(jié)構(gòu)模型的示意圖[25] Fig.6 The sub-micelle model of casein micelles

雙結(jié)合模型:圖7所示,αs-和β-酪蛋白通過兩種作用力相互連接—分子內(nèi)部的疏水作用力和膠體磷酸鈣的連接作用[23]。這些相互結(jié)合后的酪蛋白位于膠束的內(nèi)部,κ-酪蛋白幾乎不含磷酸絲氨酸,因此它不能通過磷酸鈣的連接作用與其它酪蛋白相互結(jié)合,所以位于膠束的表面,同時起到限制膠束無限增長的作用[24]。

圖7 酪蛋白膠束的雙結(jié)合模型示意圖[23] Fig.7 The dual-binding model of casein micelles

Holt結(jié)構(gòu)模型認為,酪蛋白膠束內(nèi)部是膠體磷酸鈣將單體酪蛋白分子連接起來而組合成的納米簇狀復合物,κ-酪蛋白像“毛刷”一樣位于酪蛋白膠束的表面。Holt模型是綜合了上述的各個模型的合理之處后,通過小角X射線衍射以及各種驗證性的實驗結(jié)果所得出的目前關(guān)于酪蛋白膠束最為合理的結(jié)構(gòu)模型[24],見圖8。

圖8 Holt理論結(jié)構(gòu)模型[26-27] Fig.8 The Holt model of casein micelles

酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)是非常復雜的,它們是由高度磷酸化的αs和β-酪蛋白與磷酸鈣相互纏繞在一起而形成的,κ-酪蛋白覆蓋在酪蛋白膠束的表面,阻止了膠束的生長。目前已經(jīng)有大量的研究證實,酪蛋白膠束的粒徑?jīng)Q定于酪蛋白膠束表面的κ-酪蛋白占總酪蛋白的相對百分比。酪蛋白也存在很多變體,研究發(fā)現(xiàn),與A變體的κ-酪蛋白相比,B變體的κ-酪蛋白的相對百分比更高,膠束的尺寸更小。通過梯度離心后得到不同粒徑的酪蛋白膠束,然后分析其組成后發(fā)現(xiàn),酪蛋白膠束的平均直徑與酪蛋白膠束中所含的κ-酪蛋白的相對百分比成反比,與β-酪蛋白的相對百分比成正比。這一現(xiàn)象能夠很好地證明,β-酪蛋白位于酪蛋白膠束的表面,而κ-酪蛋白位于膠束的內(nèi)部。

5 結(jié)語

酪蛋白膠束位于乳品工業(yè)的核心地位,乳的酸凝、酶凝以及液態(tài)乳穩(wěn)定性的變化,從本質(zhì)上來說,都是乳中酪蛋白膠束所發(fā)生的一系列變化所導致的。但是由于人們對酪蛋白膠束的內(nèi)部結(jié)構(gòu)尚不明確,因此,乳品工業(yè)中與酪蛋白膠束相關(guān)的單元操作大都依賴于傳統(tǒng)的經(jīng)驗操作。因此,有必要對酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)進行更為深入的研究。同時,不同資源乳(如水牛乳、羊乳和牦牛乳)中的酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)和組成存在較大的差異,因此有必要對這些特種乳資源的酪蛋白膠束進行研究,以此來探討不同乳源的膠束的形成機制?？傊?酪蛋白膠束內(nèi)部結(jié)構(gòu)的準確揭示需要新的研究手段的出現(xiàn)和廣大乳品科技工作者的不斷努力。

[1]Wang P,Liu H,Wen P,etal. The composition,size and hydration of yak casein micelles[J]. International Dairy Journal,2013,31(2):107-110.

[2]Rabo F,El-Dieb S,El-Asser M,etal. Effect of some physical treatments and additives on some functional properties of buffaloes’ and cows’ casein micelles[J]. Egyptian Journal of Dairy Science,2010,38(1):35-44.

[3]Waugh DF,Von Hippel PH. κ-Casein and the stabilization of casein micelles[J]. Journal of the American Chemical Society,1956,78(18):4576-4582.

[4]Dalgleish DG. On the structural models of bovine casein micelles-review and possible improvements[J]. Soft Matter,2011,7(6):2265-2272.

[5]Bachar M,Mandelbaum A,Portnaya I,etal. Development and characterization of a novel drug nanocarrier for oral delivery,based on self-assembled β-casein micelles[J]. Journal of Controlled Release,2012,160(2):164-171.

[6]McMahon DJ,Oommen BS. Supramolecular Structure of the Casein Micelle[J]. Journal of Dairy Science,2008,91(5):1709-1721.

[7]Fox P,Brodkorb A. The casein micelle:historical aspects,current concepts and significance[J]. International Dairy Journal,2008,18(7):677-684.

[8]Osta R,Marcos S,Rodellar C. A MnlI polymorphism at the bovine αs2‐casein gene[J]. Animal genetics,1995,26(3):213-213.

[9]Givens I,Aikman P,Gibson T,etal. Proportions of A1,A2,B and C β-casein protein variants in retail milk in the UK[J]. Food Chemistry,2013,139(1-4):549-552.

[10]O’Mahony J,Fox P. Milk Proteins:Introduction and Historical Aspects[M]. Advanced Dairy Chemistry:Springer;2013. p. 43-85.

[11]Nagy K,Váró G,Szalontai B. κ-Casein terminates casein micelle build-up by its “soft” secondary structure[J]. European Biophysics Journal,2012,41(11):959-968.

[12]Horne DS. Casein micelle structure and stability[M]. In:Abby T,Mike B,Harjinder S,editors. Milk Proteins. San Diego:Academic Press,2008:133-162.

[13]Ahmad S,Gaucher I,Rousseau F,etal. Effects of acidification on physico-chemical characteristics of buffalo milk:A comparison with cow’s milk[J]. Food Chemistry,2008,106(1):11-17.

[14]Glantz M,Hakansson A,Lindmark Mansson H,etal. Revealing the size,conformation,and shape of casein micelles and aggregates with asymmetrical flow field-flow fractionation and multiangle light scattering[J]. Langmuir,2010,26(15):12585-12591.

[15]McMahon DJ,Brown RJ. Composition,Structure,and Integrity of Casein Micelles:A Review[J]. Journal of Dairy Science,1984,67(3):499-512.

[16]Fox PF,Brodkorb A. The casein micelle:Historical aspects,current concepts and significance[J]. International Dairy Journal,2008,18(7):677-684.

[17]Nair PK,Alexander M,Dalgleish D,etal. Physico-chemical properties of casein micelles in unheated skim milk concentrated by osmotic stressing:interactions and changes in the composition of the serum phase[J]. Food Hydrocolloids,2013,In the press,doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.foodhyd.2013.01.001.

[18]Dalgleish DG,Corredig M. The structure of the casein micelle of milk and its changes during processing[J]. Annual Review of Food Science and Technology,2012,3:449-467.

[19]Dalgleish DG,Spagnuolo PA,Douglas Goff H. A possible structure of the casein micelle based on high-resolution field-emission scanning electron microscopy[J]. International Dairy Journal,2004,14(12):1025-1031.

[20]Horne DS. Casein micelles as hard spheres:limitations of the model in acidified gel formation[J]. Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects,2003,213(2-3):255-263.

[21]McMahon D,Oommen B. Casein Micelle Structure,Functions,and Interactions[M]. Germany:Springer,2013:185-209.

[22]Ma J,Xu Q,Zhou J,etal. Nano-scale core-shell structural casein based coating latex:Synthesis,characterization and its biodegradability[J]. Progress in Organic Coatings 2013,In the press,doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.porgcoat.2013.04.006.

[23]Qi P,X. Studies of casein micelle structure:the past and the present[J]. Lait,2007,87(4-5):363-383.

[24]De Kruif CG,Huppertz T,Urban VS,etal. Casein micelles and their internal structure[J]. Advances in Colloid and Interface Science,2012,171-172(0):36-52.

[25]Horne DS. Casein micelle structure:Models and muddles[J].Current Opinion in Colloid & Interface Science,2006,11(2-3):148-153.

[26]Phadungath C. Casein micelle structure:a concise review[J].Songklanakarin J Sci Technol,2005,27(1).

[27]Holt C,Horne D. The hairy casein micelle:evolution of the concept and its implications for dairy technology[J]. Nederlands melk en Zuiveltijdschrift,1996,50(2):85-111.