下調(diào)TPD52基因表達(dá)通過(guò)Wnt信號(hào)通路對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞活力、凋亡及TNF-α和IL-6表達(dá)的影響

瞿秋紅， 韋立蓓， 尹 伶

(武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院婦產(chǎn)科， 湖北 武漢 430064)

子宮肌瘤是女性常見(jiàn)的良性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，但具體病因尚未明確[1]。腫瘤蛋白D52(tumor protein D52，TPD52)的基因定位于8q21染色體。該蛋白是D52家族成員之一，與多種腫瘤的發(fā)展及形成有密切關(guān)系，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如肺癌和乳腺癌等[2-3]。沉默前列腺癌中TPD52的表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力[4]。在子宮肌瘤中TPD52的研究較少，有研究指出，miR-139-5p可通過(guò)靶向抑制TPD52誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞于G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。Wnt信號(hào)通路與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，子宮肌瘤細(xì)胞上存在Wnt信號(hào)通路的活化，抑制Wnt信號(hào)通路可降低子宮肌瘤的生長(zhǎng)[6]。本研究旨在通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制子宮肌瘤細(xì)胞TPD52表達(dá)，觀察細(xì)胞活力、凋亡及免疫細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)表達(dá)的變化，并研究對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 標(biāo)本來(lái)源

隨機(jī)選擇2016年2月～2017年3月在武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院婦科病房就診，行子宮肌瘤剔除術(shù)的子宮肌瘤患者6例，年齡為36～48歲，平均年齡為(42.47±0.81)歲，術(shù)前至少3個(gè)月無(wú)激素類藥物治療史，手術(shù)中獲取的子宮肌瘤組織即刻在含有青鏈霉素的冷D-Hanks液中，低溫轉(zhuǎn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)，且術(shù)后經(jīng)過(guò)病理學(xué)診斷確定為子宮肌瘤，且沒(méi)有肌瘤變性。

2 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco；Ⅰ型膠原酶和MTT試劑均購(gòu)自Sigma；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司；TRIzol購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；RT-qPCR試劑盒購(gòu)自MBI；抗TPD52、β-catenin、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)和survivin抗體購(gòu)自CST。SunRise酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自Becton-Dickinson。

3 方法

3.1人子宮平滑肌瘤的分離培養(yǎng) 無(wú)菌條件將子宮肌瘤瘤核組織取出，用含有青鏈霉素的冷D-Hanks液清洗組織塊以將表面血污去除，將組織塊剪成1 cm×1 cm×1 cm大小，于離心管中靜置，加入含有15%胎牛血清及0.2% Ⅰ型膠原酶的適量消化液，于37 ℃水浴中振蕩消化，每隔1 h過(guò)200目篩收集濾液1次，約3～5 h后終止消化，離心濾液，棄掉上清，D-Hanks液洗滌沉淀，臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的成活率，加入10%的DMEM培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，無(wú)菌接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察到細(xì)胞單層達(dá)80%生長(zhǎng)融合時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，且生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

3.2實(shí)驗(yàn)分組及siRNA轉(zhuǎn)染 在線設(shè)計(jì)針對(duì)TPD52的特異性小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)序列(正向5’-GGAAGAGCUAAGAAGAGAA-TT-3’，反向5’-UUCUCUUCUUAGCUCUUCCTT-3’)及其陰性對(duì)照序列(正向 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反向5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-TT-3’)，由廣州瑞博生物技術(shù)有限公司合成，分別命名為si-TPD52組和陰性對(duì)照(negative control, negative)組，并設(shè)置空白對(duì)照(blank control, blank)組。Dickkopf-1(DKK1)為Wnt信號(hào)通路抑制劑，加入劑量為10 μmol/L。以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的子宮肌瘤細(xì)胞于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)70%后，參照Invitrogen的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

3.3Western blot實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞中加入適量的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定提取的總蛋白濃度，取上樣蛋白40 μg，依次經(jīng)12%的SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)NC膜、5%脫脂奶粉封膜，4 ℃搖床孵育皆按照1∶1 000稀釋好的抗TPD52、β-catenin、cyclin D1和survivin抗體過(guò)夜，洗膜，加入1∶5 000稀釋的 II 抗，室溫?fù)u床孵育2 h，ECL發(fā)光劑顯影，X膠片顯影。以GAPDH作為內(nèi)參照，Quantity One對(duì)蛋白信號(hào)條帶進(jìn)行分析，ImageJ圖像處理與分析軟件具體量化蛋白信號(hào)值，以各蛋白與GAPDH條帶的信號(hào)值比值作為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.4MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 胰酶消化子宮肌瘤細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，以5×107/L個(gè)接種于96孔板，每孔中加入100 μL，于37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2、飽和濕度孵育，細(xì)胞完全貼壁后開(kāi)始轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染48 h的每孔細(xì)胞中加入5 mg/L的MTT液20 μL，于37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2、飽和濕度孵育4 h，將上清棄掉，PBS洗滌后在每孔中加入150 μL的DMSO，室溫30 min，充分振蕩后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 PBS洗滌轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞；收集1×106個(gè)細(xì)胞，500 μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞；加入5 μL的Annexin V-FITC，混合均勻，再加入10 μL的PI；混勻后室溫、避光、冰浴15 min；1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況,其中左上象限代表壞死細(xì)胞，左下象限代表活細(xì)胞，右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率為早期與晚期凋亡率之和。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6RT-qPCR檢測(cè) TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá) TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，取1 μg的總RNA在20 μL的逆轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA。用Primier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)TNF-α、IL-6及內(nèi)參照GAPDH的qPCR引物(TNF-α的上游引物序列為5’-GAACTCCAGGCGGTGTCT-3’，下游引物序列為5’-GGCTCATACCAGGGCTTG-3’；IL-6的上游引物序列為5’-CACTTCACAAGTCGGAGGCT-3’，下游引物序列為5’-TCTGACAGTGCATCATCGCT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’，下游引物序列為5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’)，由TaKaRa公司合成。以cDNA為模板，采用20 μL的qPCR反應(yīng)體系對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明。根據(jù)所得的Ct均值，通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算TNF-α和IL-6的相對(duì)表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TPD52在轉(zhuǎn)染si-TPD52的子宮肌瘤細(xì)胞中的表達(dá)

si-TPD52組TPD52的表達(dá)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，而在陰性對(duì)照組的表達(dá)與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說(shuō)明抑制TPD52表達(dá)的子宮肌瘤細(xì)胞建立成功，見(jiàn)圖1。

2 si-TPD52對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞活力和凋亡的影響

空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組間細(xì)胞活力及凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與陰性對(duì)照組比較，si-TPD52組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3 si-TPD52對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞TNF-α和IL-6表達(dá)的影響

空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組間TNF-α和IL-6表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與陰性對(duì)照組比較，si-TPD52組的TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05)，IL-6的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

Figure 1.The protein expression of TPD52 in the uterine fibroid cells transfected with si-TPD52. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖1TPD52在轉(zhuǎn)染si-TPD52的子宮肌瘤細(xì)胞的表達(dá)

4 si-TPD52對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的影響

Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin及相關(guān)靶蛋白cyclin D1和survivin的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組間β-catenin、cyclin D1和survivin蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與陰性對(duì)照組比較，si-TPD52組β-catenin、cyclin D1和survivin的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表1。

5 si-TPD52和Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞活力和凋亡的影響

si-TPD52轉(zhuǎn)染子宮肌瘤細(xì)胞及Wnt信號(hào)通路抑制劑DKK1處理細(xì)胞，細(xì)胞活力、凋亡率及β-catenin、cyclin D1和survivin的蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示,與si-TPD52組比較，si-TPD52+DKK1組的細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，β-catenin、cyclin D1和survivin的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表2。

討 論

在維持正常組織生長(zhǎng)平衡的過(guò)程中，細(xì)胞的增殖及凋亡相互協(xié)調(diào)，如果細(xì)胞的凋亡受到抑制，增殖與凋亡的平衡被打破，增殖過(guò)度就使細(xì)胞的增殖成為可能?，F(xiàn)認(rèn)為，在子宮肌瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中有增殖和凋亡的失衡，體內(nèi)細(xì)胞的凋亡受到抑制是該病的一個(gè)重要特征[7]。大量研究提示，TPD52與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系，多種腫瘤組織中TPD52呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)，其表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生[8-9]，這提示在子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中TPD52可能發(fā)揮重要作用。RNA干擾是使特定基因表達(dá)沉默的一項(xiàng)新技術(shù)，目前在多種疾病治療、基因功能研究等方面應(yīng)用廣泛[10-11]。有研究指出，通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默TPD52表達(dá)可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡[12]。沉默TPD52可通過(guò)下調(diào)p53和上調(diào)Bcl-2等表達(dá)影響肝癌的發(fā)生發(fā)展[13]。子宮肌瘤中TPD52的研究較少，miR-139-5p可通過(guò)靶向抑制TPD52影響子宮肌瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[5]，但通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制子宮肌瘤細(xì)胞TPD52表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響及機(jī)制尚未研究清楚。

Figure 2.The effect of si-TPD52 on the viability and apoptosis of uterine fibroid cells. A: the cell viability in each group; B: the results of flow cytometry for analyzing the cell apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnegative group.

圖2si-TPD52對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞活力及凋亡的影響

表1si-TPD52對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)和Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白水平的影響

Table 1.The effects of si-TPD52 on the mRNA expression of TNF-α and IL-6, and the protein levels of Wnt signaling pathway-related molecules in the uterine fibroid cells (Mean±SD.n=3)

GroupmRNA expressionProtein expressionTNF-αIL-6β-cateninCyclin D1SurvivinBlank1.000±0.0001.000±0.0000.722±0.0590.187±0.0190.262±0.028Negative 0.923±0.0640.955±0.0720.778±0.0680.178±0.0210.280±0.030si-TPD520.518±0.047*3.654±0.148*0.306±0.032*0.097±0.010*0.109±0.013*

*P<0.05vsnegative group.

Figure 3.The effects of si-TPD52 on the protein expression of Wnt signaling pathway-related molecules in the uterine fibroid cells.

圖3si-TPD52對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)的影響

本研究中分離培養(yǎng)原代子宮肌瘤細(xì)胞，將合成的針對(duì)TPD52的特異性siRNA轉(zhuǎn)染子宮肌瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中TPD52的表達(dá)明顯降低，MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPD52表達(dá)受到抑制后子宮肌瘤細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率增加，提示抑制TPD52表達(dá)可阻滯子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。Wnt信號(hào)通路是一條調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的重要信號(hào)通路，近些年的研究表明，該通路是子宮肌瘤發(fā)病過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14-15]。Wnt信號(hào)通路抑制劑可降低Wnt信號(hào)通路的經(jīng)典信號(hào)通路Wnt/β-catenin相關(guān)因子表達(dá)，從而對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞生長(zhǎng)起抑制作用，因此認(rèn)為Wnt/β-catenin信號(hào)可能是子宮肌瘤治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)[16-17]。TNF-α在腫瘤及炎癥中起關(guān)鍵作用，可加重炎癥及腫瘤的進(jìn)展，IL-6是一種多效細(xì)胞因子，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，在腫瘤治療方面有重要作用，子宮肌瘤中TNF-α表達(dá)升高，IL-6表達(dá)降低，且阻斷Wnt信號(hào)可下調(diào)TNF-α表達(dá)和上調(diào)IL-6表達(dá)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，沉默TPD52表達(dá)可降低Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin及相關(guān)靶蛋白cyclin D1和survivin的表達(dá)，下調(diào)TNF-α表達(dá)和上調(diào)IL-6表達(dá)，而加入Wnt信號(hào)通路抑制劑DKK1后si-TPD52對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞的活力抑制及凋亡促進(jìn)作用更明顯。

Figure 4.The effects of si-TPD52 and Wnt signaling pathway inhibitor on the viability and apoptosis of uterine fibroid cells. A: the apoptosis was analyzed by flow cytometry; B: the images of Western blot for determining the protein levels of Wnt signaling pathway-related molecules.

圖4si-TPD52抑制Wnt信號(hào)通路對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的影響

表2si-TPD52和Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞活力和凋亡的影響

Table 2.The effects of si-TPD52 and Wnt signaling pathway inhibitor on the viability and apoptosis of uterine fibroid cells (Mean±SD.n=3)

GroupA valueApoptotic rate (%)Protein expressionβ-cateninCyclin D1Survivinsi-TPD520.211±0.02218.45±0.720.562±0.0480.147±0.0170.182±0.021si-TPD52+DKK10.132±0.016*24.65±1.22*0.211±0.017*0.054±0.008*0.134±0.007*

*P<0.05vssi-TPD52 group.

綜上所述，下調(diào)TPD52基因表達(dá)可通過(guò)Wnt信號(hào)通路抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)下調(diào)TNF-α和上調(diào)IL-6表達(dá)。該研究可能為TPD52在子宮肌瘤中的作用及機(jī)制研究奠定一定的基礎(chǔ)。