鶴慶新發(fā)野鼠鼠疫疫源地中鼠疫噬菌體的分離及其裂解譜測(cè)定

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歷史上，鶴慶縣于1772年、1778-1796年、1879-1888年在東區(qū)有過(guò)3次較大的鼠疫流行。1985年在鶴慶縣草海鎮(zhèn)的馬廠(chǎng)村、 新峰村的狗血清和鼠血清中發(fā)現(xiàn)鼠疫抗體放射免疫陽(yáng)性4份[1]，1990年后開(kāi)始每月在新峰、馬村進(jìn)行鼠疫監(jiān)測(cè)，但一直未發(fā)現(xiàn)鼠疫更多線(xiàn)索。直至2017年4月，鶴慶縣疾病預(yù)防控制中心鼠防人員在草海鎮(zhèn)馬廠(chǎng)村進(jìn)行鼠疫常規(guī)監(jiān)測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)鼠疫菌陽(yáng)性，并在隨后的擴(kuò)大調(diào)查中，陸續(xù)從活鼠中分離到10余株鼠疫菌株，從而確定馬廠(chǎng)村發(fā)生鼠間鼠疫流行[2]，鶴慶縣也正式成為建國(guó)后云南省的新發(fā)野鼠鼠疫疫源地。

鼠疫噬菌體一直被用來(lái)進(jìn)行鼠疫病原體的鑒定[3]，在自然界中與鼠疫菌存在競(jìng)爭(zhēng)和共進(jìn)化的復(fù)雜關(guān)系。只要有鼠疫菌存在的地方就有鼠疫噬菌體的蹤跡[4]，那么作為新發(fā)疫源地，鶴慶鼠疫疫源地內(nèi)是否也存在著鼠疫噬菌體，其分布率如何，生物學(xué)特性如何，一系列的疑問(wèn)的回答是更深入了解此疫源地的有益線(xiàn)索，是做好此塊疫源地鼠疫防控工作的基礎(chǔ)工作。本研究就此進(jìn)行了調(diào)查研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1樣本采集 采樣主要以鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠(chǎng)村為中心向周?chē)? km范圍調(diào)查采樣，包括鶴慶縣草海鎮(zhèn)的馬廠(chǎng)、小馬廠(chǎng)、黑泥紹及安樂(lè)等4個(gè)自然村。采用鼠鋏法(5 m鋏線(xiàn)法)捕獲老鼠，于實(shí)驗(yàn)室中無(wú)菌剖解，并在無(wú)菌條件下取鼠腸道2cm左右，立即放入置有5 mL 改良PBS增菌液(Fluka，peptone sorbitol bile brother)的離心管中，于4 ℃冰箱中保存待檢。

1.2噬菌體分離宿主菌EV76的活化 本實(shí)驗(yàn)以鼠疫菌株EV76作為噬菌體分離的宿主菌。從-80 ℃冰箱中取出含株保存的EV76疫苗株(本實(shí)驗(yàn)室保存)，接種于含1%的兔溶血LB平皿上， 28 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落，在LB平皿上三道劃線(xiàn)，28 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，挑取單菌落進(jìn)行增殖備用。

1.3鼠疫噬菌體的分離與純化 采用雙層平板法進(jìn)行噬菌體的分離純化，具體為：將上述樣本經(jīng)0.22 μm濾膜(美國(guó)Millipore)過(guò)濾，并加入到含有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EV76菌懸液100 μL的15 mL離心管中，置恒溫氣浴振蕩培養(yǎng)箱28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；再次過(guò)濾增殖液，并取300 μL與150 μLEV76菌懸液充分混勻，然后加入到6 mL的半固體培養(yǎng)液(50 ℃)中，混勻鋪板；待半固體凝固后分別置于28 ℃和37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。如若有噬菌斑出現(xiàn)，該樣本則為陽(yáng)性樣本，從雙層平皿上挑取生長(zhǎng)狀況良好的單個(gè)菌斑進(jìn)行增殖培養(yǎng)。6次單斑增殖后平皿上可見(jiàn)形態(tài)大小一致的噬菌斑，將其視為純化好的噬菌體[5]。

1.4噬菌體的電鏡觀察 取2 mL純化好的噬菌體樣本和1 mL的宿主EV76混勻加入到有6 mL液體培養(yǎng)基的增菌管中，放入空氣搖床28 ℃，220 r/min，培養(yǎng)24 h。取出增殖液0.22 μm濾膜過(guò)濾，加入EV762 mL繼續(xù)培養(yǎng)，如此重復(fù)3次，得到濃縮后的噬菌體菌液，取20 μL(噬菌體效價(jià)為1×108)滴于石蠟片上，采用醋酸雙氧鈾染色，置于銅網(wǎng)上進(jìn)行電鏡(日立HT7700)觀察。

1.5噬菌體不同溫度下裂解譜觀察 溫度設(shè)定：通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選取24 ℃、28 ℃、37 ℃作為本研究的實(shí)驗(yàn)溫度。受試菌株的選擇：選用21株鼠疫分離株分別是：鶴慶(10株)、麗江(3株)、劍川(3株)、以及云南家鼠鼠疫菌株(4株)。非鼠疫菌株115株來(lái)自于：云南省地方病防治研究所保存的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(20株)，其余95株不同種屬菌株由大理市第一人民醫(yī)院以及大理州醫(yī)院提供。

1.6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法 采用Photoshopcs3進(jìn)行噬菌體電鏡照片中噬菌體大小的測(cè)量，以及Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理，采用SAS 9.4進(jìn)行卡方分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1分離情況 此次調(diào)查共采集成年活鼠標(biāo)本共354份，經(jīng)篩查共檢出鼠疫噬菌體陽(yáng)性樣本2份，陽(yáng)性率為0.56%。4個(gè)采樣自然村中只有馬廠(chǎng)村分離到了2株鼠疫噬菌體，其余小馬廠(chǎng)、黑泥紹及安樂(lè)村未分離到鼠疫噬菌體，經(jīng)檢驗(yàn)4個(gè)自然村噬菌體分離率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.706，P>0.05)，見(jiàn)表1。從宿主動(dòng)物上看：共有大絨鼠、齊氏姬鼠、社鼠、臭鼩鼱及黃胸鼠5種，大絨鼠占72.60%，但從中未分離到鼠疫噬菌體，2兩株噬菌體分別分離自齊氏姬鼠及臭鼩鼱，詳見(jiàn)表2。經(jīng)檢驗(yàn)5種宿主動(dòng)物之間噬菌體分離率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.91，P<0.05)。采用分割法兩兩比較，臭鼩鼱分離率高于其他宿主動(dòng)物。

2.2所分離到兩株噬菌體的噬菌斑形態(tài) 分離到的兩株噬菌體命名為HQ1和HQ2。剛分離出的噬菌體生長(zhǎng)狀態(tài)較差，經(jīng)過(guò)6次純化增值后，在28 ℃和37 ℃條件下培養(yǎng)24 h在雙層瓊脂平板上形成圓形、透明、邊緣清晰的噬菌體，28 ℃條件下直徑為1～1.5 mm，37 ℃條件下噬菌斑直徑增大到2～3 mm(圖1)。

2.3噬菌體電鏡形態(tài) 醋酸雙氧鈾負(fù)染后在電子顯微鏡下觀察，鶴慶分離的兩株鼠疫耶爾森噬菌體的形態(tài)如HQ1噬菌體頭部呈正六面體結(jié)構(gòu)，頭部直徑約45.42 nm，尾部長(zhǎng)約108.17 nm; HQ2噬菌體頭部也呈正六面體結(jié)構(gòu)，頭部直徑約37.88 nm,尾部長(zhǎng)約121.85 nm(圖2)。兩株噬菌體的電鏡形態(tài)顯示，噬菌體含非收縮性尾部，根據(jù)2011年國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)第9次報(bào)告提出的噬菌體分類(lèi)與命名標(biāo)準(zhǔn)，兩株噬菌體符合肌尾噬菌體科特征[6]。

表1 鶴慶縣草海鎮(zhèn)4個(gè)自然村噬菌體分離情況Tab.1 Phage separation in 4 natural villages in Caohai Town, Heqing

表2 鶴慶縣草海鎮(zhèn)不同宿主動(dòng)物鼠疫噬菌體的分離情況Tab.2 Isolation of plague phage from different host animals in Caohai Town, Heqing

A：HQ1在28 ℃下對(duì)EV76的噬菌斑；B：HQ2在28 ℃下對(duì)EV76的噬菌斑；C：HQ1在37 ℃下對(duì)EV76的噬菌斑；D：HQ2在37 ℃下對(duì)EV76的噬菌斑。圖1 鶴慶縣2株鼠疫噬菌體不同溫度下噬菌斑圖Fig.1 Plaque pattern of two plague phage in Heqing at different temperatures

圖2 鶴慶縣2株鼠疫噬菌體電鏡形態(tài)Fig.2 Electron microscopic morphology of two plague phage in Heqing

2.4噬菌體不同溫度下裂解特性測(cè)定 所分離2株鼠疫噬菌體對(duì)于21株鼠疫菌(包括EV76)的裂解特性相同，即22 ℃與24 ℃下不裂解，28 ℃與37 ℃裂解，且37 ℃下的裂解性較28 ℃要強(qiáng)。對(duì)于115株非鼠疫菌，兩株噬菌體對(duì)在22 ℃、24 ℃、28 ℃和37 ℃狀態(tài)下均不裂解。該結(jié)果進(jìn)一步表明，所分離的噬菌體為鼠疫噬菌體。詳見(jiàn)表3與圖3。

1代表診斷噬菌體，2代表HQ1，3代表HQ2圖3 鶴慶縣2株鼠疫噬菌體不同溫度下裂解鼠疫菌圖Fig.3 Analysis of plague plaques from two plague phage of Heqing at different temperatures

表3 不同溫度下鶴慶噬菌體對(duì)136株受試菌株的裂解情況Fig.3 Lysis of 136 strains of Heqing phage at different temperatures

“-”表示未裂解，“+”表示裂解

3 討 論

3.1鶴慶新發(fā)鼠疫疫源地中存在著鼠疫噬菌體 2017年4月，云南省鶴慶縣從捕獲的350多份活鼠(及其寄生蚤)中分離到10株鼠疫菌，并證實(shí)這些鼠疫菌株與麗江野鼠鼠疫疫源地菌株具有很高的同源性，鶴慶疫情可能是麗江鼠疫進(jìn)一步向南擴(kuò)散的結(jié)果[7]。從1772至1937年間，鶴慶縣流行鼠疫50年次，累計(jì)死亡15 000人，此后再也沒(méi)有疫情報(bào)道[1]，1937到2017年過(guò)去了80年。2017年又監(jiān)測(cè)到鼠間疫情，且從活鼠中檢出鼠疫菌，分離率近3%，這說(shuō)明鼠疫在這一地區(qū)一直存在，一個(gè)古老而又未解的疑問(wèn)又提出來(lái)了，鼠疫菌在這一地區(qū)又是怎樣保存的，鼠疫菌的微生態(tài)研究也許是揭開(kāi)這一迷團(tuán)的一把鑰匙，其中鼠疫噬菌體在鼠疫微生態(tài)學(xué)研究中扮演了十分重要的角色。

本研究證實(shí)，在這一古老的新發(fā)鼠疫疫源地中確實(shí)存在著鼠疫噬菌體，而噬菌體的分離地與鼠疫菌的分離地都是在馬廠(chǎng)村，這更說(shuō)明了鼠疫菌與鼠疫噬菌體相輔而存、協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系。從分離宿主上看，雖然大絨鼠疫是此地占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的鼠種，但并未從其體內(nèi)分離到鼠疫噬菌體，而在分布較少的齊氏姬鼠上則分離到一株鼠疫噬菌體，這與齊氏姬鼠在野鼠疫源地中對(duì)鼠疫菌為高感受性、低敏感性及中等抗性，這與鼠疫菌的貯存宿主[8]的研究相對(duì)應(yīng)，也間接印證了其在疫源地中充當(dāng)鼠疫菌貯存宿主的這一角色。

3.2鶴慶分離鼠疫噬菌體特殊的裂解溫度依賴(lài)性及其生物學(xué)意義 此次分離到的兩株鼠疫噬菌體剛分離時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)較差，經(jīng)純化和傳代培養(yǎng)后生長(zhǎng)狀態(tài)明顯改善。純化后經(jīng)測(cè)定得到其最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，而鼠疫診斷噬菌體最適裂解溫度在25～28 ℃[9]。鶴慶分離噬菌斑與李存香等分離自玉龍，劍川等地噬菌體在生長(zhǎng)狀態(tài)、噬菌斑直徑、最適生長(zhǎng)溫度等方面均存在一定差異[10-11]。此次分離的兩株噬菌體只有在28～37 ℃溫度范圍內(nèi)對(duì)鼠疫菌有較強(qiáng)的裂解特性，低于25 ℃下不裂解鼠疫菌。這種特性，使其與鼠疫菌在自然條件下(馬廠(chǎng)村位于鶴慶縣草海鎮(zhèn)西山，距縣城35 km，海拔2 980 m，年平均氣溫13.5 ℃，年降水量900 mm)可以共存活，而在動(dòng)物體內(nèi)(37 ℃)該噬菌體則可裂解鼠疫菌。這樣的特性既保證了鼠疫菌在自然界中(如鼠巢、土壤中)的存留，又不至于使鼠疫菌在動(dòng)物間廣泛傳播形成大的流行。

2017年4月鶴慶發(fā)生了鼠間鼠疫流行，一種推測(cè)可能是：由于長(zhǎng)期的鼠疫較低流行，使鼠疫噬菌體在這一地方的豐盛度大大降低，從而感染鼠疫的宿主動(dòng)物能同時(shí)接觸到此種噬菌體的概率就降低，因而鼠疫菌在動(dòng)物體內(nèi)失去了“天敵”，繼而鼠疫又流行起來(lái)。隨著動(dòng)物間鼠疫的大流行后，鼠疫噬菌體的豐盛度又會(huì)增加，繼而鼠疫的流行又會(huì)被鼠疫噬菌體抑制而逐漸減弱。同時(shí)噬菌體作為一類(lèi)裂解性殺菌病毒，有嚴(yán)格的宿主特異性，對(duì)人和動(dòng)物均無(wú)害[12]，因此從鼠疫生物防控的角度，只要在這一地方投放含有這種鼠疫噬菌體的老鼠餌料，從而增加鼠疫噬菌體在這一地區(qū)宿主動(dòng)物中的豐盛度，自然會(huì)降低鼠疫動(dòng)物間流行的風(fēng)險(xiǎn)，從而降低涉及到人的可能；同時(shí)采用這種屬地分離鼠疫噬菌體進(jìn)行投放，對(duì)當(dāng)?shù)卣麄€(gè)微生態(tài)的影響更小，更為安全可靠，不至于造成外源噬菌體(如診斷用噬菌體)對(duì)鼠疫菌及其生態(tài)帶來(lái)不可預(yù)測(cè)的風(fēng)險(xiǎn)。

當(dāng)然，是什么機(jī)制導(dǎo)致對(duì)這兩株鼠疫噬菌體具有如此獨(dú)特的溫度依賴(lài)性裂解鼠疫菌的特性，仍是我們所未知的。隨著我們對(duì)這兩株鼠疫噬菌體測(cè)序的完成，更多生物學(xué)指標(biāo)的測(cè)定，我們將逐步揭開(kāi)此神秘的面紗。而這些問(wèn)題的解決，對(duì)于我們認(rèn)識(shí)鼠疫保存機(jī)制，進(jìn)而制定更科學(xué)的鼠疫防控策略，無(wú)疑是重要支撐。