羥基磷灰石表面蛋白質(zhì)吸附的研究進(jìn)展

付亞康 張科宏 翁 杰 劉耀文

1(雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 雅安 625000)2(西南交通大學(xué)材料先進(jìn)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610031)3(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

引言

當(dāng)生物材料(導(dǎo)管、支架、人造髖關(guān)節(jié)或組織工程材料)和蛋白質(zhì)溶液(血液、組織液、培養(yǎng)液)接觸時(shí)，溶液中的蛋白質(zhì)將迅速地吸附于材料表面，并且在幾秒到幾分鐘之內(nèi)達(dá)到飽和，形成一層蛋白質(zhì)膜[1]。隨后，細(xì)胞膜表面受體與吸附蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，使細(xì)胞外信號(hào)通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，最終決定黏附細(xì)胞的生物行為[2]。由于細(xì)胞直接與吸附蛋白作用，不與材料表面接觸，所以生物材料表面蛋白質(zhì)吸附的性能(包括吸附蛋白質(zhì)的種類、數(shù)量、構(gòu)象變化[3]等)對(duì)生物材料的性能研究及功能設(shè)計(jì)具有重要的意義，因而蛋白質(zhì)吸附一直是生物材料研究領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。

HAP是人體硬組織中的主要無(wú)機(jī)成分, 理論組成為Ca10(PO4)6(OH)2，鈣磷比為1.67，其晶體為六方晶系(見圖1)，屬于P63/m空間群，其結(jié)構(gòu)為六角柱體，a、b軸夾角為120°，晶胞常數(shù)為a=b=9.432?，c=6.884?。HAP良好的生物相容性和生物活性已被大量研究所證實(shí)[3], 因而被廣泛地應(yīng)用于臨床骨缺損修復(fù)。近年來(lái)，多孔HAP植入體顯示出優(yōu)良的骨誘導(dǎo)性, 但其骨誘導(dǎo)機(jī)理還存在較多不明之處[4-5]。目前對(duì)HAP骨誘導(dǎo)機(jī)理的研究大多涉及蛋白質(zhì)在HAP表面的吸附，一方面是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和HAP是硬組織的重要組成成分[6]，另一方面是因?yàn)椤邦惞橇谆沂瘜印盵7-9]的形成包括蛋白質(zhì)吸附過(guò)程。

圖1 (a)HAP晶胞結(jié)構(gòu)示意;(b)HAP晶胞結(jié)構(gòu)在(110)晶面上的投影[17]Fig.1 (a)Schematic diagram of the unit cell structure of HAP; (b)Projection of unit cell of HAP crystal viewed along (110) face[17]

另外，HAP還可以用作層析柱的填料[10]，其中PO43-可與帶正電的蛋白質(zhì)以離子鍵結(jié)合，由氯化鈉或磷酸鈉濃度梯度洗脫；其中Ca2+可與帶負(fù)電蛋白質(zhì)的自由羧基以金屬螯合的方式結(jié)合，由磷酸鈉濃度梯度洗脫。HAP耐堿度高、生物安全性好，是目前唯一直接用于蛋白質(zhì)和核酸純化的無(wú)機(jī)層析填料[11-12]，其表面蛋白質(zhì)吸附的性能對(duì)HAP的層析功能具有重要影響。

綜上所述，大量研究集中在HAP表面蛋白質(zhì)吸附的行為和機(jī)制上，但由于該研究涉及蛋白質(zhì)[13]、吸附環(huán)境[14]、HAP性能三方面因素[15-16]；研究過(guò)程中可變的因素較多，導(dǎo)致許多研究的結(jié)論不一致，甚至相反[17-18]，因此關(guān)于HAP表面蛋白質(zhì)吸附的行為和機(jī)制還未形成較統(tǒng)一、清楚的認(rèn)識(shí)。下面綜述近30年關(guān)于HAP表面蛋白質(zhì)吸附的研究工作，主要涉及吸附的機(jī)制、重要的影響因素以及與之相關(guān)的應(yīng)用研究，希望能為HAP表面蛋白質(zhì)吸附行為的認(rèn)識(shí)、骨誘導(dǎo)機(jī)理的研究及具有選擇性蛋白吸附功能的HAP材料的設(shè)計(jì)提供有益的借鑒。

1 吸附機(jī)制

蛋白質(zhì)分子在HAP表面發(fā)生吸附的過(guò)程，實(shí)際上是蛋白質(zhì)分子從溶液中向HAP材料表面遷移、富集的過(guò)程。研究表明，導(dǎo)致這一過(guò)程發(fā)生的作用力主要有靜電作用、氫鍵和范德華力。具體情況中，導(dǎo)致吸附的作用力可能是其中的一種，也可能是多種[19-20]。

1.1 靜電作用

研究表明，靜電引力是導(dǎo)致HAP與蛋白質(zhì)之間發(fā)生吸附最主要的一種作用力。由于Ca2+、PO43-是組成HAP的主要離子，Ca2+帶正電荷，PO43-帶負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)分子往往帶有一定量的電荷；另外HAP晶格大小與蛋白質(zhì)分子的尺寸同屬于微納米范圍，因此理論上HAP和蛋白質(zhì)分子之間可以發(fā)生靜電作用而吸附。眾多實(shí)驗(yàn)都支持這一結(jié)論，Kazuhiko等制備了Ca/P為1.55～1.70的HAP，隨著Ca/P的增大，HAP表面的正電性逐漸增大，蛋白吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HAP對(duì)BSA分子(酸性蛋白，帶負(fù)電荷)的吸附量由0.45mg/m2逐漸增大至0.82 mg/m2，研究認(rèn)為這是因?yàn)镠AP晶面中Ca2+密度增大，晶面與帶負(fù)電荷的BSA分子之間靜電引力增強(qiáng)，導(dǎo)致吸附量增大[21]。為了驗(yàn)證這種結(jié)論，Santos等對(duì)HAP表面進(jìn)行噴金處理，屏蔽了HAP表面的Ca2+和PO43-，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)噴金后HAP表面對(duì)BSA的吸附量大大下降，說(shuō)明BSA分子在HAP表面發(fā)生吸附主要是通過(guò)靜電作用，而不是疏水作用[22]。Chen等采用分子動(dòng)態(tài)平衡模擬技術(shù)，模擬富含亮氨酸的釉原蛋白(LRAP)在HAP(001)晶面上的吸附行為，發(fā)現(xiàn)LRAP的羧基與HAP(001)晶面上Ca2+之間存在較強(qiáng)的靜電引力，LRAP上-COO-的兩個(gè)氧原子與鈣原子呈三角形分布[23]。

1.2 氫鍵

氫鍵也是蛋白質(zhì)與HAP之間發(fā)生吸附的一種重要作用力[19]。Dong等研究了BMP-2在HAP(001)晶面的吸附，發(fā)現(xiàn)BMP-2具有3種吸附基團(tuán)，分別為-OH、-NH2和-COO-，不帶電荷的吸附基團(tuán)(-OH和-NH2)主要以氫鍵作用與HAP晶面發(fā)生吸附，通過(guò)量子化學(xué)的計(jì)算也證實(shí)了氫鍵的存在[24]。Zhou等采用分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)研究了BMP-7在HAP表面的吸附過(guò)程，得到類似的結(jié)論：發(fā)現(xiàn)BMP-7的吸附殘基可分為兩類，即谷氨酸/天冬氨酸、精氨酸/賴氨酸，前者以靜電引力的方式吸附于HAP表面，后者以氫鍵的形式吸附于HAP表面[20]?？梢钥闯?，氫鍵主要存在于不帶電的吸附基團(tuán)與HAP表面之間。

1.3 范德華力

Liao等利用分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)，研究FN第3結(jié)構(gòu)域第10模塊(FN-III10)和第7-10模塊(FN-III7-10)在HAP(001)晶面的吸附過(guò)程(見圖2)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著吸附的進(jìn)行，范德華力和靜電引力交替地主導(dǎo)著吸附的進(jìn)程：FN-III10在吸附起始階段，靜電引力起主導(dǎo)作用；吸附進(jìn)行20 ns后，大量氨基酸殘基逐漸吸附于HAP表面，氨基酸殘基與HAP表面帶電離子發(fā)生電性的錯(cuò)配，導(dǎo)致靜電斥力增大，靜電引力作用逐漸減弱，范德華力逐漸增強(qiáng)，成為主要的吸附作用力。在范德華力的作用下，F(xiàn)N-III10中無(wú)規(guī)則卷曲部分發(fā)生較大的結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致FN-III10的構(gòu)象發(fā)生變化(見圖2(d))。而FN-III7-10的吸附經(jīng)歷了由弱到強(qiáng)的吸附過(guò)程，隨著堿性殘基Arg1421錨定到HAP表面，吸附驅(qū)動(dòng)力由范德華力轉(zhuǎn)變?yōu)殪o電引力。

圖2 計(jì)算機(jī)模擬FN-III10在HAP(001)晶面的吸附過(guò)程。(a)吸附時(shí)間為0；(b)吸附時(shí)間為6.11 ns；(c)吸附時(shí)間為21.59 ns；(d)吸附時(shí)間為100 ns[19]Fig. 2 Snapshots of computer simulation process of FN-III10 adsorption on HAP(001). (a) At 0 ns; (b) At 6.11ns; (c) At 21.59ns; (d) At 100 ns[19]

2 影響因素

HAP表面的蛋白質(zhì)吸附過(guò)程十分復(fù)雜，主要受到材料因素、蛋白質(zhì)及吸附環(huán)境三方面因素的影響，如表1所示。材料因素包括晶面結(jié)構(gòu)、比表面積、孔隙尺寸等，蛋白質(zhì)因素主要包括蛋白質(zhì)種類及濃度，環(huán)境因素主要包括溫度、pH、離子的種類及濃度等。

2.1 表面晶面

隨著HAP合成技術(shù)的多樣化，眾多研究者制備出針狀、帶狀、片狀及球狀等HAP顆粒用于蛋白質(zhì)吸附的研究，研究發(fā)現(xiàn)HAP表面的晶面成分是影響HAP表面蛋白質(zhì)吸附性能的一個(gè)重要因素[25-26]。根據(jù)HAP不同晶面與蛋白質(zhì)分子之間作用的特點(diǎn)[27]，可將HAP參與吸附的晶面分為兩類：a晶面和c晶面(見圖3)。

圖3 HAP中帶電離子和基團(tuán)分布的俯視示意。 (a)HAP的c晶面；(b)HAP的a晶面，鈣顯示綠色；磷顯示藍(lán)紫色；氧顯示紅色[26]Fig.3 The top view of charged ions or groups distribution on (a) c and (b) a crystal planes of HAP. Ca, green; P, violet; O, red[26]

2.1.1a晶面

a晶面是指HAP沿c軸取向生長(zhǎng)后形成的晶面。HAP的 a晶面上分布著大量的鈣(Ⅰ)和鈣(Ⅱ)離子，鈣(Ⅰ)和鈣(Ⅱ)離子是酸性蛋白質(zhì)的吸附位點(diǎn)(C位點(diǎn))，因此a晶面對(duì)酸性蛋白質(zhì)具有選擇性吸附作用。例如，劉翠蓮等研究了纖維蛋白原(Fg)在HAP(100)、(001)晶面的吸附行為，(100)和(001)晶面分別屬于a和c晶面，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HAP(100)晶面對(duì)Fg的吸附量大于(001)晶面；計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)也表明，F(xiàn)g在(100)晶面的吸附性能強(qiáng)于(001)晶面的吸附性，這正是因?yàn)镠AP的a晶面對(duì)酸性的Fg具有選擇性吸附作用[28]。再如，Kazuhiko等采用水熱法，制備了寬度相近、c軸方向長(zhǎng)度在27～102 nm范圍的納米HAP，蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)表明，BSA的飽和吸附量隨HAP顆粒c軸長(zhǎng)度增大而增大，由0.66 mg/m2增大至1.44 mg/m2。這是因?yàn)殡S著HAP顆粒c軸方向尺寸逐漸增大，顆粒外表面中a晶面成分占總比表面積的比例逐漸增大，導(dǎo)致HAP對(duì)酸性蛋白質(zhì)(如BSA)的選擇吸附性逐漸增強(qiáng)[29]。

表1影響HAP表面蛋白質(zhì)吸附性能的因素

Tab.1FactorsaffectingproteinadsorptionpropertiesonHAPsurface

影響因素對(duì)蛋白質(zhì)吸附性能的影響暴露晶面a晶面促進(jìn)對(duì)酸性蛋白質(zhì)的吸附c晶面促進(jìn)對(duì)堿性蛋白質(zhì)的吸附比表面積 當(dāng)HAP顆粒暴露晶面的組成固定 蛋白質(zhì)吸附量隨比表面積增大而增大 當(dāng)HAP顆粒暴露晶面組成不固定 蛋白質(zhì)吸附性能與比表面積大小無(wú)關(guān)孔隙尺寸 當(dāng)孔隙尺寸大于蛋白質(zhì)分子尺寸時(shí),蛋白質(zhì)吸附量隨比表面積增大而增大吸附環(huán)境PO43- 抑制酸性蛋白質(zhì)在HAP表面的吸附,在低濃度范圍內(nèi)促進(jìn)堿性蛋白質(zhì)在HAP表面的吸附Ca2+ 促進(jìn)酸性蛋白質(zhì)的吸附;有助于α螺旋構(gòu)象的形成,從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的吸附pH 在一定范圍內(nèi),pH增大,促進(jìn)堿性蛋白質(zhì)的吸附,抑制酸性蛋白質(zhì)的吸附溫度對(duì)不同蛋白質(zhì)的吸附影響不同

2.1.2c晶面

HAP的c晶面是指HAP沿a軸取向生長(zhǎng)形成的晶面。c晶面上分布著大量的PO43-，它是堿性蛋白質(zhì)的吸附位點(diǎn)(P位點(diǎn))，因而c晶面對(duì)堿性蛋白質(zhì)具有選擇性吸附作用。Zhuang等利用氣-液界面法制備了暴露c晶面的片狀HAP顆粒，蛋白吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：該片狀HAP對(duì)溶菌酶(LYS，堿性蛋白)具有超強(qiáng)的選擇性吸附作用[30]。筆者也曾研究HAP不同晶面對(duì)蛋白質(zhì)的吸附行為，發(fā)現(xiàn)隨著c晶面含量逐漸增加，HAP對(duì)LYS(堿性蛋白質(zhì))的吸附性逐漸增強(qiáng)，對(duì)BSA(酸性蛋白質(zhì))的吸附性逐漸減弱，說(shuō)明HAP的c晶面對(duì)堿性蛋白質(zhì)具有選擇性吸附作用[31]。

其三，教育行政部門需要認(rèn)識(shí)到教師情緒勞動(dòng)作為勞動(dòng)類型之一，不能被“忽視”，也不能被“敵視”，需要被合理考慮。因此，教育行政部門從意識(shí)上要重視教師情緒勞動(dòng)的存在與管理，從策略上要全員關(guān)注、全程管理、科學(xué)優(yōu)化，努力將對(duì)教師情緒勞動(dòng)的模糊認(rèn)知、判斷、處理走向更加科學(xué)、合

2.2 比表面積

HAP的比表面積是指單位質(zhì)量的HAP顆粒具有的總面積，由于蛋白質(zhì)吸附發(fā)生于HAP顆粒的表面，因而比表面積對(duì)HAP表面蛋白質(zhì)吸附的性能具有重要影響。比表面積對(duì)HAP表面蛋白質(zhì)吸附性能的影響與HAP顆粒表面暴露晶面的組成有關(guān)，除此之外還與孔隙的尺寸有關(guān)。因此，比表面積對(duì)HAP表面蛋白質(zhì)吸附性能的影響要根據(jù)HAP暴露晶面的組成固定、不固定和孔隙尺寸3種情況而定。

2.2.1HAP顆粒暴露晶面的組成固定

HAP表面暴露晶面的組成固定，是指HAP單位面積中蛋白質(zhì)吸附位點(diǎn)的類型、數(shù)量不變，此時(shí)單位質(zhì)量HAP的最大蛋白質(zhì)吸附量隨比表面積增大而增大。這是因?yàn)楸缺砻娣e越大，單位質(zhì)量HAP含有的蛋白質(zhì)吸附位點(diǎn)越多，因此單位質(zhì)量HAP的蛋白質(zhì)吸附量越大。例如，F(xiàn)ernandez等使用模板調(diào)控的方法制備了暴露晶面組成固定，比表面積不同的HAP顆粒，蛋白吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)HAP的比表面積由34 m2/g增大至62 m2/g時(shí)，HAP對(duì)Fg的飽和吸附量由55 μg/mg增大至195 μg/mg，對(duì)FN的飽和吸附量由194 μg/mg增大至259 μg/mg[32]。類似的，Matsumoto等通過(guò)改變反應(yīng)溫度制備了暴露晶面組成固定，比表面積不同的HAP顆粒，蛋白吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)HAP比表面積由11 m2/g增大至88 m2/g時(shí)，HAP對(duì)細(xì)胞色素c的飽和吸附量由1.61 μg/mg增大至14.59 μg/mg[33]。

2.2.2HAP顆粒暴露晶面的組成不固定

HAP顆粒暴露晶面的組成不固定，是指HAP單位面積中各種暴露晶面所占總面積的比例發(fā)生了變化。在這種情況下，HAP表面蛋白質(zhì)吸附性能與比表面積無(wú)直接關(guān)系。這是因?yàn)镠AP不同晶面對(duì)蛋白質(zhì)吸附的性能不同，當(dāng)HAP顆粒暴露晶面的組成不固定時(shí)，HAP比表面積的增大并不意味著HAP單位面積中蛋白質(zhì)吸附位點(diǎn)的增多，因而不能決定HAP的蛋白質(zhì)吸附性能。例如，Zhuang等制備了纖維狀HAP(fHAP)、片狀HAP(pHAP)(見圖4)，比表面積分別為4.28、17.51 m2/g，蛋白吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：fHAP、pHAP對(duì)BSA的飽和吸附量分別為9.0、7.9 μg/mg，fHAP的比表面積小于pHAP的比表面積(SSAfHAPMpHAP)[30]。這正是因?yàn)閒HAP和pHAP表面暴露晶面不同：fHAP的主要暴露晶面為a晶面，促進(jìn)BSA的吸附；而pHAP的主要暴露晶面為c晶面，抑制BSA的吸附。因此，pHAP對(duì)BSA的最大吸附量不隨比表面積增大而增大。

圖4 HAP的掃描電鏡圖。(a)fHAP；(b)pHAP(比例尺：10 μm)[30]Fig.4 SEM images. (a) fHAP; (b) pHAP (scale bars:10 μm)[30]

2.2.3HAP微結(jié)構(gòu)中的孔隙尺寸

孔隙是HAP微結(jié)構(gòu)中常見的一種，孔隙的存在導(dǎo)致HAP比表面積增加。當(dāng)孔隙尺寸大于蛋白質(zhì)分子尺寸時(shí)，蛋白質(zhì)分子可以進(jìn)入孔隙發(fā)生吸附，因而單位質(zhì)量HAP的蛋白質(zhì)吸附量隨比表面積增大而增大；相反，當(dāng)孔隙尺寸小于蛋白質(zhì)分子尺寸時(shí)，蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入孔隙發(fā)生吸附，因而單位質(zhì)量HAP的蛋白質(zhì)吸附量不隨比表面積增大而增大。例如，F(xiàn)ujii等制備了具有10 nm介孔的HAP顆粒，介孔的引入使HAP的比表面積由對(duì)照組的50 m2/g增大至220 m2/g[34]。蛋白吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)挝毁|(zhì)量含介孔的HAP對(duì)β2-MG(分子尺寸為4.5 nm×2.5 nm×2 nm)的飽和吸附量由0.1 μg/mg增大至0.44 μg/mg，升高4.4倍，與比表面積的增大倍數(shù)相同；而單位質(zhì)量含介孔的HAP對(duì)BSA(分子尺寸為4 nm×4 nm×16 nm)的飽和吸附量未發(fā)生明顯變化。

2.3 吸附環(huán)境

蛋白質(zhì)吸附環(huán)境是指蛋白質(zhì)發(fā)生吸附的水溶液的參數(shù)條件，主要包括溶液中無(wú)機(jī)鹽離子的種類及濃度、溫度和pH值等因素。眾多研究發(fā)現(xiàn)，影響HAP表面蛋白質(zhì)吸附性能的環(huán)境因素主要有Ca2+濃度、PO43-濃度、pH和溫度等。

2.3.1PO43-

PO43-是HAP晶格的構(gòu)成離子，也是體液中重要的無(wú)機(jī)鹽離子。研究表明：在蛋白質(zhì)吸附中，PO43-抑制酸性蛋白質(zhì)在HAP表面的吸附；在低濃度范圍內(nèi)，PO43-促進(jìn)堿性蛋白質(zhì)在HAP表面的吸附。例如，Giichiro等研究發(fā)現(xiàn)：在0.002～0.2 mol/L的PO43-濃度范圍內(nèi)，隨著PO43-濃度逐漸增大，HAP顆粒對(duì)BSA的吸附量逐漸減小；而對(duì)LYS的吸附量是先增大，當(dāng)PO43-濃度超過(guò)0.01 mol/L后，HAP對(duì)LYS的吸附量又逐漸減小[35]。Yang等也發(fā)現(xiàn)，PO43-和BSA在HAP表面具有競(jìng)爭(zhēng)吸附關(guān)系，PO43-能夠有效抑制BSA分子在HAP表面的吸附[36]。Smith等使用化學(xué)力顯微鏡觀察到，隨著吸附環(huán)境中PO43-的加入，BSA分子在HAP表面的吸附受到抑制[37]。筆者曾研究了吸附環(huán)境中PO43-濃度對(duì)HAP的ζ電位和蛋白質(zhì)吸附性能的影響，得到了類似的結(jié)論，研究認(rèn)為：隨著PO43-濃度升高，溶液中的PO43-逐漸吸附于HAP表面的Ca2+位點(diǎn)(C位點(diǎn)[27])，使BSA的吸附位點(diǎn)減少，因而HAP對(duì)BSA的吸附量隨PO43-濃度增大而逐漸減??；對(duì)于LYS的吸附，當(dāng)PO43-濃度較小時(shí)，PO43-吸附于HAP表面，使HAP表面負(fù)電性增加，HAP與LYS之間靜電作用增強(qiáng)，導(dǎo)致對(duì)LYS的吸附量增加；當(dāng)PO43-濃度較大時(shí)，溶液中PO43-與LYS分子之間的靜電作用增強(qiáng)，同時(shí)伴隨溶液中離子強(qiáng)度的增大，HAP表面雙電層被壓縮，負(fù)電性減弱，HAP與LYS分子之間靜電作用逐漸減小，導(dǎo)致對(duì)LYS的吸附性能減弱[31]。

2.3.2Ca2+

Ca2+同時(shí)存在于HAP晶體和體液環(huán)境中，對(duì)不同種類蛋白質(zhì)在HAP表面的吸附性能具有重要的調(diào)控作用，關(guān)于其調(diào)控機(jī)理主要有兩種解釋。

一種觀點(diǎn)認(rèn)為，Ca2+可以調(diào)控HAP表面的電荷性質(zhì)，進(jìn)而調(diào)控HAP的蛋白質(zhì)吸附性能。在不含有Ca2+的環(huán)境中，HAP表面帶負(fù)電荷[38]。Yin等發(fā)現(xiàn)，隨著吸附環(huán)境中Ca2+濃度逐漸增大，HAP表面電荷逐漸由負(fù)電轉(zhuǎn)變?yōu)檎姡⑶艺娦灾饾u增強(qiáng)，當(dāng)Ca2+濃度大于0.005mol/L時(shí)，HAP表面的正電荷不再增加；蛋白吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HAP對(duì)BSA的吸附量也隨Ca2+濃度增大而增大，當(dāng)Ca2+濃度增大至0.005mol/L時(shí)，HAP對(duì)BSA的吸附量達(dá)到最大，與HAP的ζ電位隨Ca2+變化的規(guī)律一致[39]。類似的，Boix發(fā)現(xiàn)，BMP-2(酸性蛋白，pI≈5)在HAP表面的吸附量也隨吸附環(huán)境中Ca2+濃度的增大而增大[40]。Yin等認(rèn)為，這是由于Ca2+吸附于HAP表面，導(dǎo)致HAP表面正電性增強(qiáng)，進(jìn)而對(duì)BSA的吸附量增大，當(dāng)Ca2+濃度大于0.005 mol/L時(shí)，Ca2+的吸附達(dá)到飽和，因而對(duì)BSA的吸附量達(dá)到最大[39]。

另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，Ca2+能夠改變蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，進(jìn)而調(diào)控蛋白質(zhì)在HAP表面的吸附行為[41-42]。Roy發(fā)現(xiàn)，吸附環(huán)境中Ca2+能促進(jìn)基質(zhì)Gla蛋白在HAP表面的吸附，Ca2+誘導(dǎo)基質(zhì)Gla蛋白發(fā)生了有利于在HAP表面吸附的構(gòu)象變化[43]。Wallin等利用圓二色譜研究基質(zhì)Gla蛋白中α-螺旋的含量，發(fā)現(xiàn)在含有Ca2+的環(huán)境中基質(zhì)Gla蛋白的α-螺旋的含量明顯增高，同時(shí)基質(zhì)Gla蛋白在HAP表面的吸附量增大，認(rèn)為α-螺旋結(jié)構(gòu)有利于基質(zhì)Gla蛋白在HAP表面發(fā)生吸附[44]。類似的，Wians等也發(fā)現(xiàn)，吸附環(huán)境中加入Ca2+后，骨鈣蛋白(OC)中α-螺旋的含量明顯增加，同時(shí)OC在HAP表面的吸附量增大[45]。Hauschka等發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)論，并認(rèn)為鈣離子的存在使蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)增加，后者有利于在HAP表面發(fā)生吸附，因而使蛋白質(zhì)在HAP表面的吸附性能增強(qiáng)[46]。

2.3.3pH

pH是一項(xiàng)重要的生理環(huán)境參數(shù)，對(duì)蛋白質(zhì)在HAP表面的吸附具有重要影響。Sharpe等發(fā)現(xiàn)，pH能有效調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)鐵蛋白在HAP涂層表面的吸附性能[47]。Wassell等發(fā)現(xiàn)，HAP對(duì)BSA的最大吸附量和吸附常數(shù)都隨pH增大而逐漸減小[48]。筆者曾研究了吸附環(huán)境pH對(duì)HAP表面ζ電位及蛋白質(zhì)吸附性能的影響，發(fā)現(xiàn)在pH為5～11的范圍內(nèi)，隨著pH的增大，HAP表面負(fù)電性逐漸增強(qiáng)，對(duì)BSA的吸附量逐漸減小，對(duì)LYS的吸附量逐漸增大[31]。筆者認(rèn)為，這是由于pH調(diào)節(jié)HAP與蛋白質(zhì)分子之間的靜電作用程度所致，隨著pH增大，HAP表面吸附的OH-增加，HAP表面負(fù)電性增強(qiáng)，導(dǎo)致HAP對(duì)BSA(酸性蛋白質(zhì))的吸附量逐漸減小，對(duì)LYS(堿性蛋白質(zhì))的吸附量逐漸增大；pH的變化有可能導(dǎo)致BSA分子的構(gòu)象發(fā)生變化，使BSA在HAP表面吸附的機(jī)制發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)吸附性能發(fā)生變化。

2.3.4溫度

溫度對(duì)不同蛋白質(zhì)在HAP表面的吸附行為的影響不同。Yang等利用石英晶體天平技術(shù)，系統(tǒng)地研究了溫度對(duì)HAP表面BSA吸附性能的影響，發(fā)現(xiàn)隨著吸附溫度升高，BSA的吸附量逐漸增大[36]。他們認(rèn)為，這是因?yàn)楦邷貤l件下BSA分子向HAP表面擴(kuò)散的速率增大，導(dǎo)致BSA在HAP表面的吸附量較大。

相反，Hlady等發(fā)現(xiàn)，人血清白蛋白(HSA)在HAP表面的吸附量隨溫度升高而降低，認(rèn)為這是因?yàn)镠SA在HAP表面的吸附屬于放熱反應(yīng)，低溫有利于吸附的進(jìn)行[49]。Dillman等的研究得到同樣的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)血清蛋白在高分子薄膜表面的飽和吸附量也隨體系溫度升高而降低[50]。

3 應(yīng)用研究

3.1 藥物緩釋載體

近年來(lái)，為了提高HAP材料骨誘導(dǎo)性能，載BMP等促骨生長(zhǎng)蛋白的HAP被用于骨組織修復(fù)的研究，其中HAP的載藥量和對(duì)藥物的緩釋性能是研究的熱點(diǎn)。Dasgupta等發(fā)現(xiàn)，通過(guò)摻雜Zn元素可以提高HAP對(duì)BSA的載藥量，同時(shí)可以調(diào)控BSA的緩釋行為[51]。為了提高HAP對(duì)蛋白質(zhì)類藥物的緩釋效果，F(xiàn)u等制備了空心結(jié)構(gòu)的HAP微球，中空結(jié)構(gòu)進(jìn)一步提高了對(duì)BSA的載藥量，達(dá)126 μg/mg；對(duì)具有中空結(jié)構(gòu)的HAP進(jìn)行燒結(jié)后，微球殼層中形成中孔，中孔結(jié)構(gòu)的限制作用和靜電引力作用有效減緩了BSA的釋放，使載BSA的HAP微球在植入14 d內(nèi)表現(xiàn)良好的藥物緩釋性能[52]。類似的，為了防止植入后發(fā)生藥物的突釋，Liu等采用原位合成法，在HAP成核、生長(zhǎng)的環(huán)境中引入BSA分子，使BSA分子嵌入到HAP的晶體結(jié)構(gòu)中，避免了表面物理吸附載藥引起的藥物突釋，實(shí)現(xiàn)了更長(zhǎng)時(shí)間的藥物緩釋[53]。Xie 等體外研究了納米HAP對(duì)BMP-2的載藥和緩釋性能，發(fā)現(xiàn)納米HAP顆粒對(duì)BMP-2的載藥量較好，達(dá)70 μg/mg，在植入14 d內(nèi)具有較平穩(wěn)的緩釋效果[54]。

3.2 骨組織工程支架

骨組織工程支架是指由細(xì)胞(或生長(zhǎng)因子)、生物材料組裝而成，能夠在修復(fù)初期提供力學(xué)強(qiáng)度并且支持新骨長(zhǎng)入的人造生物材料支架。研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)可以促進(jìn)新骨生長(zhǎng)，在骨修復(fù)領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景，具有裝載BMP功能的支架材料的設(shè)計(jì)和制備成為研究的熱點(diǎn)。有的研究者利用高分子、HAP，分別模擬生物骨組織中的有機(jī)、無(wú)機(jī)成分；利用HAP對(duì)BMP強(qiáng)烈的吸附作用，提高BMP的載藥量，結(jié)合高分子材料適宜的強(qiáng)度和降解性能，使該類復(fù)合材料具有良好的骨組織修復(fù)功能。例如，Kaito等制備了載BMP-2的HAP/PLA-PEG骨修復(fù)支架，利用兔橈骨缺損評(píng)價(jià)支架的修復(fù)性能，發(fā)現(xiàn)植入8周后，骨缺損完全修復(fù)且強(qiáng)度良好[55]。值得注意的是，載BMP-2的量?jī)H為之前研究中所需BMP-2含量的10%，極大降低了BMP-2過(guò)量導(dǎo)致的風(fēng)險(xiǎn)。這主要是因?yàn)镠AP本身具有骨誘導(dǎo)性能，同時(shí)貫通多孔結(jié)構(gòu)有利于新骨向材料內(nèi)部長(zhǎng)入。

另外，HAP和BMP還可以進(jìn)一步提高靜電紡絲纖維的成骨分化性能。靜電紡絲纖維具有特殊的纖維結(jié)構(gòu)，有利于干細(xì)胞骨性分化。Li等將納米HAP顆粒與BMP-2成分加入到靜電紡絲纖維中，體外人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(hMSCs)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：加入BMP-2和HAP成分的纖維，誘導(dǎo)hMSCs骨性分化的能力更強(qiáng)；同時(shí)BMP-2和HAP成分的加入，促進(jìn)了纖維上鈣鹽的沉積及具有晶體結(jié)構(gòu)的骨組織的形成。這說(shuō)明，HAP和BMP-2能夠有效地增強(qiáng)靜電紡絲纖維材料的骨誘導(dǎo)性能[56]。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

HAP表面蛋白質(zhì)吸附問(wèn)題涉及生物、材料、物理、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科，展現(xiàn)出巨大的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值，始終是研究的重要熱點(diǎn)之一。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代分析檢測(cè)技術(shù)不斷創(chuàng)新和組合，諸如原子力顯微鏡、表面等離子共振、耗散型石英晶體微天平和計(jì)算機(jī)分子模擬等技術(shù)逐漸地被運(yùn)用于HAP表面蛋白質(zhì)吸附問(wèn)題的研究，使研究從簡(jiǎn)單的對(duì)吸附量的定量深入到分子構(gòu)象的變化、分子形貌及吸附的動(dòng)態(tài)過(guò)程等層面，極大地增進(jìn)了人們對(duì)該問(wèn)題的理解。有理由相信，隨著未來(lái)更加先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)運(yùn)用于該領(lǐng)域，對(duì)HAP表面蛋白質(zhì)吸附的認(rèn)識(shí)將進(jìn)一步深入。