王曉捷，崔蒙蒙，常天明，王 剛，李江南，何希君，劉長(zhǎng)明，熊 濤，翁長(zhǎng)江*

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一種嚴(yán)重威脅世界養(yǎng)豬業(yè)的高度接觸性傳染病，該病可導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各日齡豬特別是育肥仔豬的嚴(yán)重呼吸道癥狀[1]。臨床上PRRS的發(fā)生常伴隨其它病毒的混合感染或細(xì)菌的繼發(fā)性感染。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)與PRRSV共感染最為常見。在出現(xiàn)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)臨床癥狀的豬群中，PRRSV和 PCV2共感染比率可高達(dá) 47.7%[2]。與PRRSV或PCV2單獨(dú)感染相比，PRRSV和PCV2共感染的仔豬病理變化明顯加重，病毒血癥持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)[3]。先感染高致病性 PRRSV(HP-PRRSV)再感染PCV2的豬群發(fā)病率和死亡率明顯提高[4]，這些結(jié)果表明PRRSV和PCV2共感染具有協(xié)同致病能力。

PCR、RT-PCR、免疫組化方法和ELISA是檢測(cè)PRRSV和PCV2共感染的常用方法[5-6]。新一代基于雙Z結(jié)構(gòu)寡核苷酸探針的RNAscope原位雜交技術(shù)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)示蹤組織或細(xì)胞內(nèi)的RNA[7]。RNAscope技術(shù)已經(jīng)在腫瘤、胚胎發(fā)育等研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，適用于檢測(cè)細(xì)胞、石蠟包埋切片或新鮮冰凍組織切片中的RNA。已有研究報(bào)道RNAscope能夠有效檢測(cè)豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)和組織中的PRRSV RNA[8]。本研究利用RNAscope原位雜交技術(shù)，檢測(cè)了PRRSV和PCV2共感染的PAM和石蠟包埋切片中的PRRSVN基因和PCV2Rep基因。為PRRSV和PCV2共感染提供了一種新的檢測(cè)方法，為探究PRRSV和PCV2共感染協(xié)同致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和臨床組織樣品PRRSV HuN4株由哈爾濱獸醫(yī)研究所田志軍研究員惠贈(zèng)；PCV2b YJ株由哈爾濱獸醫(yī)研究所劉長(zhǎng)明研究員惠贈(zèng)；PAMs采用肺灌洗的方法分離自28日齡健康仔豬[9]；臨床PRRSV-PCV2共感染豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)和腎臟石蠟包埋組織由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料多聚甲醛、Triton X-100、DAPI、TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；8孔EZ培養(yǎng)皿購自德國(guó)Millicell公司；ImmedgeTM疏水性屏障筆、RNAscopeR二代熒光檢測(cè)試劑盒、Hybez雜交爐均購自美國(guó) Advanced Cell Diagnostics(ACD)公司；兔抗PRRSV Nsp9多克隆抗體由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)封文海教授惠贈(zèng)；鼠抗PCV2 Cap單克隆抗體(MAb)由劉長(zhǎng)明研究員惠贈(zèng)。

1.3 RNAscope技術(shù)檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染

1.3.1 探針的設(shè)計(jì)和合成針對(duì)PRRSV HuN4株N基因(14 800 bp～15 151 bp)序列設(shè)計(jì)8對(duì)探針，命名為 PRRSV-N-probes；針對(duì) PCV2 YJ株Rep基因(2 bp～894 bp)序列設(shè)計(jì) 19對(duì)探針，命名為PCV2-Rep-probes。探針均由ACD公司設(shè)計(jì)與合成。

1.3.2 PRRSV-PCV2共感染細(xì)胞樣品的制備通過肺灌洗的方法制備PAMs，并接種于8孔EZ培養(yǎng)皿內(nèi)，采用0.1 MOI PRRSV感染PAMs 24 h作為PRRSV感染組；采用1 MOI PCV2感染PAMs 12 h作為PCV2感染組；采用0.1 MOI PRRSV HuN4株感染 PAMs 12 h，再用 1 MOI PCV2感染 12 h作為PRRSV-PCV2共感染組；采用等量1640培養(yǎng)基處理PAMs作為對(duì)照組。感染一定時(shí)間后固定細(xì)胞用做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 PRRSV和PCV2感染PAMs的探針雜交、信號(hào)放大以及檢測(cè)探針的雜交、信號(hào)放大及檢測(cè)參照RNAscope熒光檢測(cè)試劑盒說明書以及本實(shí)驗(yàn)室前期的RNAscope檢測(cè)方法[8]進(jìn)行。用ImmedgeTM疏水性屏障筆在1.3.2固定的細(xì)胞外周建立疏水圈，在疏水圈內(nèi)滴加蛋白酶III室溫處理細(xì)胞15 min，去除多余液體后用PBS洗滌載玻片，向載玻片疏水圈內(nèi)的組織或細(xì)胞樣品滴加探針溶液，在Hybez雜交爐中40℃恒溫恒濕孵育2 h，去除多余液體，緩沖液沖洗載玻片；在同樣恒溫恒濕條件下，依次通過RNAscopeR二代熒光檢測(cè)試劑盒中AMP1-FL、AMP2-FL、AMP3-FL和AMP4-FL-A等處理使信號(hào)逐級(jí)放大；加入DAPI，避光復(fù)染30 s后封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.3.4 間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)以及與RNAscope聯(lián)和使用檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染將PRRSV和PCV2單獨(dú)感染或PRRSV-PCV2共感染的PAMs固定后，加入 0.3%TritonX-100處理 15 min；10%FBS封閉 30 min；以兔抗PRRSV Nsp9多克隆抗體(1∶100)或鼠抗 PCV2 Cap MAb(1∶100)為一抗室溫孵育 2 h，以山羊抗兔 IgG-TRITC(1∶200)或山羊抗鼠IgG-FITC(1∶200)為二抗室溫孵育 1 h；分別以 IFA檢測(cè)PRRSV、PCV2以及 PRRSV-PCV2的共感染。同時(shí)以RNAscope-IFA二者聯(lián)和檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染的PAMs，樣品先經(jīng)過RNAscope信號(hào)放大步驟，再經(jīng)同樣的IFA方法檢測(cè)。

1.4 RNAscope方法檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染的臨床樣品臨床PRRSV-PCV2共感染豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)和腎臟石蠟包埋組織經(jīng)切片后，使用二甲苯透明、脫蠟，然后利用PRRSV-N-probes和PCV2-Rep-probes同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記(Label)或不使用探針標(biāo)記(Mock)，后續(xù)信號(hào)放大和檢測(cè)過程與1.3.3相同。

2 結(jié)果

2.1 RNAscope原位雜交方法檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染利用RNAscope原位雜交方法檢測(cè)PRRSV、PCV2單獨(dú)感染或PRRSV-PCV2共感染PAMs中的病毒RNA。激光共聚焦結(jié)果顯示，在PRRSV單獨(dú)感染的PAMs中，PRRSV-N-probes可以識(shí)別PRRSVN基因，出現(xiàn)綠色熒光；在PCV2單獨(dú)感染的PAMs中，PCV2-Rep-probes可以識(shí)別PCV2Rep基因，出現(xiàn)紅色熒光；在PRRSV-PCV2共感染的PAMs中，能在同一細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到PRRSVN基因和PCV2Rep基因，在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)紅色和綠色熒光(圖1A)。結(jié)果表明，RNAscope原位雜交方法可以從基因水平檢測(cè)到PRRSV-PCV2的共感染。

利用IFA試驗(yàn)檢測(cè) PRRSV、PCV2單獨(dú)感染或PRRSV-PCV2共感染的PAMs。結(jié)果顯示， PRRSV單獨(dú)感染的PAMs出現(xiàn)綠色熒光(Nsp9蛋白)；PCV2單獨(dú)感染的PAMs細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)紅色熒光(Cap蛋白)；在PRRSV-PCV2共感染的同一PAMs的細(xì)胞質(zhì)中同時(shí)觀察到綠色熒光和紅色熒光(圖1B)。結(jié)果表明，IFA可以從蛋白水平檢測(cè)到PRRSV-PCV2的共感染。

RNAscope原位雜交技術(shù)可以在細(xì)胞水平上直觀地檢測(cè)病毒RNA，IFA則常用于檢測(cè)目的蛋白的亞細(xì)胞定位，本研究利用IFA和RNAscope原位雜交同時(shí)檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染的 PAMs，結(jié)果顯示在PRRSV-PCV2共感染的PAMs中，PRRSVN基因和PCV2的Cap蛋白在同一個(gè)PAM內(nèi)分別被PRRSV-N-probes和anti-Cap抗體識(shí)別，同時(shí)出現(xiàn)綠色和紅色熒光(圖 1C)； PRRSV的 Nsp9蛋白和PCV2Rep基因在同一個(gè)PAM細(xì)胞內(nèi)分別被PCV2-Rep-probes和anti-Nsp9抗體識(shí)別，同時(shí)出現(xiàn)綠色和紅色熒光(圖1D)。這些研究結(jié)果表明，RNAscope原位雜交與IFA方法聯(lián)和使用可以用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中的PRRSV-PCV2的共感染，并能同時(shí)對(duì)細(xì)胞中病毒RNA和病毒蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

2.2 RNAscope原位雜交檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染的臨床樣品將來源于臨床PRRSV-PCV2共感染豬的組織經(jīng)石蠟包埋、組織切片和脫蠟處理，再利用PRRSV-N-probes和PCV2-Rep-probes對(duì)其進(jìn)行RNAscope原位雜交檢測(cè)。結(jié)果顯示，在PRRSVPCV2共感染豬的腎臟組織中僅檢測(cè)到PCV2感染的陽性細(xì)胞(紅色熒光)。在PRRSV-PCV2感染豬的肺臟、脾臟和淋巴結(jié)的組織切片中同時(shí)檢測(cè)到PRRSV(綠色熒光)和 PCV2感染的細(xì)胞(紅色熒光)(圖 2)。結(jié)果表明，RNAscope原位雜交可用于PRRSV-PCV2共感染的臨床樣品的檢測(cè)，但需對(duì)多個(gè)組織樣品進(jìn)行檢測(cè)才能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

圖1 RNAscope方法檢測(cè)PRRSV-PCV2的共感染Fig.1 Detection of PRRSV and PCV2 co-infection in PAMs by RNAscope

3 討論

臨床上常用PCR、RT-PCR、免疫組化和ELISA等方法檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染[10-12]，但是這些方法無法直接觀察到兩種病毒感染的同一個(gè)細(xì)胞。傳統(tǒng)的基于核酸探針雜交的原位雜交技術(shù)由于病毒RNA豐度低、易降解等問題導(dǎo)致假陰性、背景高的原因沒有得到推廣。RNAscope原位雜交技術(shù)采用獨(dú)特的雙Z結(jié)構(gòu)探針設(shè)計(jì)保證了探針識(shí)別序列的特異性，其特殊的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大策略可以在樣品中標(biāo)記低拷貝數(shù)甚至降解成小片段的RNA。因此，該技術(shù)被用于檢測(cè)HPV的感染[13]，但用于多病原混合感染的檢測(cè)鮮有報(bào)道。

圖2 RNAscope方法檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染豬的組織Fig.2 Detection of PRRSV and PCV2 infection in the paraffin-embedded tissues from piglets infected with PRRSV and PCV2 using RNAscope probes

PRRSV-PCV2共感染在臨床上普遍存在。有研究表明，相對(duì)于PRRSV和PCV2單獨(dú)感染，PRRSV-PCV2共感染對(duì)彼此的增殖具有促進(jìn)作用，病毒血癥持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)[14]，這可能與PRRSV感染能夠降低巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞的吞噬能力[15]和PRRSV-PCV2共感染時(shí)明顯降低具有抗病毒活性的IFN-γ的表達(dá)水平[16]等特性有關(guān)，但其中具體分子機(jī)制仍不清楚。因此，通過RNAscope技術(shù)研究PRRSV-PCV2共感染將為闡明其協(xié)同致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究設(shè)計(jì)了兩組特異的探針，采用RNAscope原位雜交技術(shù)，檢測(cè)了PRRSV與PCV2共感染的PAM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法可以檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染的PAM。這與IFA檢測(cè)結(jié)果一致。但前者是從基因水平檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染的單個(gè)PAM，后者是從蛋白水平檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染的單個(gè)PAM，二者可以對(duì)檢測(cè)結(jié)果互相印證。

本研究還用RNAscope原位雜交技術(shù)檢測(cè)了來自臨床PRRSV-PCV2共感染豬的不同組織切片。結(jié)果顯示，在PRRSV-PCV2共感染豬的脾臟、肺臟和淋巴結(jié)中可以檢測(cè)到PRRSV和PCV2感染的細(xì)胞，但不同組織中PRRSV和PCV2檢出陽性細(xì)胞數(shù)量差異較大，在淋巴結(jié)的生發(fā)中心區(qū)域有大量PRRSVPCV2共感染細(xì)胞。腎臟組織并未檢測(cè)到PRRSV感染的細(xì)胞，造成上述差異的原因可能是由于病毒組織嗜性的差異或病毒感染程度不同造成的。因此，在利用RNAscope原位雜交方法檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染的臨床樣品時(shí)建議綜合考量多個(gè)組織的檢測(cè)結(jié)果。RNAscope原位雜交技術(shù)可以從基因水平直觀地檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中的病毒感染，IFA常用于檢測(cè)病毒蛋白的亞細(xì)胞定位。本研究首次利用RNAscope探針檢測(cè)PRRSVN基因，同時(shí)利用IFA方法檢測(cè)PCV2 Cap蛋白；或用RNAscope探針檢測(cè)PCV2Rep基因，同時(shí)利用IFA方法檢測(cè)PRRSV Nsp9蛋白來檢測(cè)PRRSV-PCV2共感染。結(jié)果表明，RNAscope原位雜交技術(shù)能夠與傳統(tǒng)的IFA方法聯(lián)和使用，對(duì)細(xì)胞中的病毒RNA和病毒蛋白進(jìn)行鑒定和亞細(xì)胞定位。在PRRSV-PCV2共感染過程中，該方法可為探究細(xì)胞水平上PRRSV和PCV2的復(fù)制規(guī)律以及病毒RNA與蛋白相互作用提供可靠的可視化證據(jù)。綜上所述，相對(duì)于PCR和ELISA方法，RNAscope原位雜交方法能夠直觀地檢測(cè)病毒核酸的亞細(xì)胞定位；RNAscope-IFA聯(lián)和使用能夠檢測(cè)到單個(gè)細(xì)胞中兩種病毒的共感染。由此表明，利用RNAscope原位雜交方法對(duì)PRRSV-PCV2共感染的檢測(cè)及其協(xié)同致病機(jī)制的研究具有重要意義。