李曉貝，劉福光，周昌艷，陳珊珊

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，上海 201403)

美國農(nóng)業(yè)局及中國國家糧油信息中心統(tǒng)計結(jié)果顯示，2015年全球大豆油消費量5 198萬噸(占全球植物油消費量的29%，排名第二)，其中，中國大豆油消費量為1 450萬噸，在中國植物油消費總量中穩(wěn)居第一[1]。有機氯類農(nóng)藥(organochlorine pesticides, OCPs)、多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)及多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)均屬于持續(xù)性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)，脂溶性極強且難以降解，易在環(huán)境及生物體中富集，尤其可在動物脂肪組織中富集并產(chǎn)生危害性更大的代謝產(chǎn)物，對人體具有致畸、致癌性[2-7]。因此，許多國家對植物中的OCPs、PCBs、PAHs制定了最大殘留限量值(maximum residue limit，MRL)，如我國GB 2763—2016規(guī)定大豆油中七氯的MRL為0.02 mg/kg，植物油中氯丹的MRL值為0.02 mg/kg[8]；GB 2762—2017規(guī)定油脂及其制品中苯并[α]芘的MRL值為0.01 mg/kg[9]；歐盟規(guī)定植物油中PCBs的MRL值為0.04 mg/kg[10]?；贠CPs、PCBs、PAHs的強脂溶性及植物油基質(zhì)的復(fù)雜性，使得植物油中該類化合物的提取存在較大困難，至今尚無相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)，僅有的同時檢測植物油中多種農(nóng)藥殘留的相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T4428—2016《出口油料中多種農(nóng)藥殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[11]也不包含此類化合物。

目前，已報道的植物油中農(nóng)藥、PCBs、PAHs等殘留量的提取凈化方法有：凝膠滲透色譜法(GPC)、固相萃取法(SPE)、分散固相萃取法(d-SPE)、QuEChERS法(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe)、低溫冷凍離心法、液-液分配萃取法(LLP)等；相應(yīng)的檢測儀器主要包括氣相色譜儀(GC)、液相色譜儀(LC)、超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC-MS/MS)等[12-16]。這些方法均存在操作復(fù)雜、有機溶劑使用量較大，有些只能針對同一類型的化合物進行檢測，不能滿足同時篩查植物油中多種痕量有機污染物的需求，有待進一步開發(fā)安全、快速的檢測方法。

QuEChERS前處理方法廣泛應(yīng)用于植物性農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留檢測中，已有報道采用QuEChER方法測定植物油中有機磷類、氨基甲酸酯類等農(nóng)藥[16-17]，尚未見采用QuEChERS方法直接同時測定植物油中OCPs、PCBs及PAHs。為提高植物油中有機農(nóng)藥的提取效率，可將乙腈-水作為提取溶劑，但是油、水不互溶，無法形成均一穩(wěn)定的溶液體系，使得提取效果不穩(wěn)定。表面活性劑同時具有親水基和疏水基，可通過降低疏水化合物與水的界面張力而形成穩(wěn)定的懸浮液，廣泛應(yīng)用于乳油、水乳劑、微乳劑等多種農(nóng)藥劑型中[18]。在植物油/水混合溶液中加入表面活性劑，均質(zhì)后形成穩(wěn)定的乳狀液，可增大植物油的分散度，同時降低提取過程中植物油的使用量及有機溶劑吸附的干擾物質(zhì)量，目前尚未見在植物油農(nóng)藥殘留的提取中使用表面活性劑的報道。

本研究擬以表面活性劑為乳化劑，制備相對穩(wěn)定的油/水乳狀液，并以乙腈-二甲苯為提取溶劑，基于QuEChERS前處理方法提取大豆油中OCPs、PCBs、PAHs，并通過GC-MS/MS進行檢測，希望建立可同時快速檢測大豆油中OCPs、PCBs、PAHs的方法，以期為國內(nèi)植物油中此類物質(zhì)的檢測提供技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ 8000 Evo氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，Sorval ST 16R高速離心機：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；EOFO-945205渦旋儀：美國Talboys公司產(chǎn)品；SR-2 DW振蕩器：日本Taitec公司產(chǎn)品；超純水儀：英國ELGA PureLab公司產(chǎn)品。

乙腈、丙酮、正己烷、二甲苯：均為色譜級，上海安譜公司產(chǎn)品；聚乙二醇400(PEG400)、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80、單硬脂酸甘油酯、十二烷基硫酸鈉、庚烷磺酸鈉、3-(N,N-二甲基十二烷基銨)丙烷磺酸鹽(硫代甜菜堿)、有機硅表面活性劑：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；無水硫酸鎂(MgSO4)和氯化鈉(NaCl)的鹽包、EMR除油脂凈化試劑包：美國Agilent公司產(chǎn)品；52種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)品(純度均高于96%)：德國Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品或美國AccuStandard公司產(chǎn)品。

每種標(biāo)準(zhǔn)品由丙酮或正己烷配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃下儲存；并混合所有標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用丙酮稀釋為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-18 ℃下儲存，備用。

1.2 實驗方法

1.2.1提取方法 準(zhǔn)確稱取1.00 g(±0.05 g)大豆油于50 mL離心管中，并加入2粒陶瓷均質(zhì)子，如為添加的質(zhì)控樣品，加入一定量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻后靜置20 min。乙腈-二甲苯提取液(9∶1，V/V)及超純水于4 ℃預(yù)冷備用。加入0.25%～4%(相對于植物油的質(zhì)量比)的表面活性劑及3 mL冷水，渦旋振蕩使其充分乳化；再加入5 mL提取液，渦旋15 s；之后迅速加入2 g MgSO4和0.5 g NaCl的提取鹽包，手搖快速振蕩約15 s，放熱完全后，在機械振蕩器上振蕩15 min；然后于20 ℃以5 000 r/min離心10 min，取上層有機相；以5 mL提取液再重提1次。

1.2.2凈化方法 將EMR Lipid凈化試劑倒入50 mL離心管中，用10 mL水活化，合并2次吸取的上層有機相，并轉(zhuǎn)移至該離心管中，渦旋混勻約30 s。在20 ℃下，以5 000 r/min離心10 min，此時溶液分層，上、下層澄清，中層為油層。將冷藏后的上、中、下層混合液轉(zhuǎn)入50 mL含有6 g MgSO4和0.5 g NaCl的Polish鹽析管中，渦旋30 s后，于20 ℃以5 000 r/min離心10 min。取5 mL上層凈化液于干凈的玻璃試管內(nèi)，40 ℃氮吹近干，用1 mL丙酮復(fù)溶，渦旋混勻后，過0.22 μm濾膜，濾液置于1.5 mL進樣小瓶中，待GC-MS/MS分析。

1.2.3色譜條件 色譜柱：HP-5MS毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；載氣He，流速1.2 mL/min；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持1.5 min，以25 ℃/min升至90 ℃，保持1.5 min，繼續(xù)以25 ℃/min升至180 ℃，再以5 ℃/min升至280 ℃，最后以10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min；進樣量1.0 μL；分流比10∶1。

1.2.4質(zhì)譜條件 電子轟擊電離源(EI源)；電離電壓50 eV；離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度300 ℃；碰撞氣為氬氣；選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)。52種化合物的質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 表面活性劑的選擇與優(yōu)化

2.1.1表面活性劑種類的選擇 表面活性劑按其親水基團的性質(zhì)可分為離子型表面活性劑(包括陽離子型、陰離子型及兩性離子型)和非離子型表面活性劑兩大類。離子型表面活性劑是親水基團為羧酸、磺酸、硫酸或氨基及其鹽等在水溶液中會發(fā)生電離的一類表面活性劑；非離子型表面活性劑則是分子中含有在水溶液中不發(fā)生電離的羥基、酰胺基或醚鍵為親水基團的一類表面活性劑[19]。本實驗選取8種具有代表性的表面活性劑進行研究(以水包油型(O/W)乳化劑為主，在提取過程中大豆油與水的比例為1∶3，添加表面活性劑后O/W型是較為合適的分散體系)，其性質(zhì)列于表2。與相同條件下未添加表面活性劑的提取效果進行比較，考察表面活性劑的添加及其種類對添加回收率的影響。52種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品添加水平為100 μg/kg，各種表面活性劑的添加濃度均為1%(相對于大豆油的質(zhì)量比，經(jīng)實驗，在此添加濃度下大豆油與水可充分乳化)。PCBs具有顯著的疏水性，極易溶于植物油中，難以通過常規(guī)的提取方式進行充分提取，但其性質(zhì)穩(wěn)定且在質(zhì)譜檢測器上響應(yīng)值較高。在添加的52種化合物中，PCBs回收率受提取條件變化的影響較為顯著，因此選擇其中7種典型PCBs為代表，以其回收率的變化趨勢為指標(biāo)進行表面活性劑的選擇與優(yōu)化，結(jié)果示于圖1。

表1 52種有機氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯及多環(huán)芳烴類化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of 52 OCPs, PCBs and PAHs

續(xù)表1

續(xù)表1

注：*為定量離子對

由圖1可見，使用未添加表面活性劑的QuEChERS前處理方法將大豆油提取3次后，其PCBs的添加回收率顯著高于提取2次的回收率；而添加表面活性劑后，相同條件下提取2次的效果與未添加表面活性劑提取3次的效果在同一水平，表明表面活性劑的添加顯著提高

了大豆油中PCBs的提取率。整體上，所選8種表面活性劑在提取2次的情況下均對PCBs的添加回收率有顯著性提高，回收率受表面活性劑的親水親油平衡值(HLB)及化合物結(jié)構(gòu)影響較大，而與其是離子型或非離子型表面活性劑無明顯相關(guān)性。結(jié)合表2和圖1可以看出，HLB值相對較低(HLB值越高親水性越強)的庚烷磺酸鈉及PEG400對提取率的提升效果相對較差，HLB值相對較高且與植物油有相似長鏈烷烴結(jié)構(gòu)的十二烷基硫酸鈉(SDS)及吐溫系列對回收率有較好的提升效果。然而，吐溫60(HLB 14.9)對提取率的提升效果略高于吐溫20(HLB 16.7)及SDS(HLB 40)。有研究表明[20]，乳狀液的粒度分布與乳化劑的HLB 值并無直接關(guān)系，說明在一定比例的油/水體系中，表面活性劑的HLB值達到一定需求后，對油中PCBs提取率影響更大的可能是表面活性劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具體的影響機制尚待進一步探索。售價上，Anzergent 3-12>SDS>吐溫系列；安全性上，非離子型=雙離子型>陰離子型>陽離子型。綜合有效性、成本、安全性及操作簡便性，選取Tween 60為最優(yōu)的表面活性劑。

表2 8種表面活性劑的性質(zhì)Table 2 Properties of 8 surfactants

注：*HLB值=乙氧基質(zhì)量分?jǐn)?shù)/5[21]；HLB值為8～18作為水包油(O/W)型乳化劑

圖1 表面活性劑對大豆油中PCBs提取回收率的影響(添加水平為100 μg/kg)Fig.1 Effects of the adding of surfactants on the recoveries of PCBs in soybean oil (100 μg/kg)

2.1.2表面活性劑添加濃度的優(yōu)化 表面活性劑達到一定的添加量才能獲得穩(wěn)定的油水乳狀液，Tween 60的添加濃度對大豆油中PCBs提取回收率的影響示于圖2?？梢?，PCBs的添加回收率隨著Tween 60添加濃度的提升而顯著提高，至添加濃度為1%時達到最高，然后隨著添加濃度的持續(xù)提升而降低，但仍高于未添加Tween 60的對照組。在低濃度時，隨著Tween 60濃度的增大，油滴在水中的分散性逐漸增大，PCBs的提取回收率也隨之提高，直至達到平衡。但是，若繼續(xù)增大Tween 60的添加量，可能會破壞乳狀液的穩(wěn)定分散體系，進而降低PCBs的提取回收率。綜上，Tween 60的最佳添加濃度為1%。

圖2 Tween 60的添加濃度對大豆油中PCBs提取回收率的影響(添加水平為100 μg/kg)Fig.2 Effects of Tween 60 with different concentrations on the recoveries of PCBs in soybean oil (100 μg/kg)

2.2 方法的線性范圍、回收率、精密度、檢出限和定量限

Tween 60添加濃度為1%時，以空白大豆油提取液為溶劑，分別配制1、2.5、5、10、20、50、100、200、400 μg/L的52種目標(biāo)化合物的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)(x)，相應(yīng)峰面積的豐度值為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程與線性相關(guān)系數(shù)列于表3，相關(guān)系數(shù)R2在0.993 8～0.999 7之間。

在大豆油空白樣品中，添加5、20、100 μg/kg三個濃度水平的52種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述優(yōu)化的實驗方法進行添加回收率實驗，每個添加濃度重復(fù)6次，考察方法的精密度。以3倍信噪比(S/N=3)計算方法的檢出限(LOD)，滿足添加回收率范圍及RSD值的最低添加濃度為定量限(LOQ)[22]，各化合物的添加回收率及定量限、檢出限列于表3。在5～100 μg/kg的添加濃度范圍內(nèi)，34種OCPs在大豆油中的添加回收率為64.35%～120.63%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.62%～20.50%；12種PCBs的添加回收率為49.65%～97.76%，RSD為1.59%～13.90%；6種PAHs的添加回收率為74.05%～101.52%，RSD為3.60%～18.16%。

添加濃度為5 μg/kg或10 μg/kg的大豆油加標(biāo)樣品中，52種化合物的定量離子SRM譜圖示于圖3。

注：*表示化合物添加濃度為10 μg/kg，其余化合物的添加濃度為5 μg/kg圖3 加標(biāo)大豆油中52種有機氯農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯及多環(huán)芳烴類化合物的定量離子SRM譜圖Fig.3 SRM chromatograms of 52 kinds of OCPs, PCBs and PAHs in spiked soybean oil samples

3 結(jié)論

建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定大豆油中34種有機氯農(nóng)藥(OCPs)、12種多氯聯(lián)苯(PCBs)及6種多環(huán)芳烴(PAHs)殘留量的檢測方法。該方法以表面活性劑為乳化劑制備相對穩(wěn)定的油/水乳狀液，并以乙腈-二甲苯為提取溶劑，基于QuEChERS前處理方法對大豆油中的OCPs、PCBs、PAHs進行提取，通過GC-MS/MS進行檢測。本方法以成熟的QuEChERS前處理方法為基礎(chǔ)，操作簡單、有機溶劑使用量低、油脂去除效果良好，靈敏度、精密度及回收率均可滿足國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對大豆油中相應(yīng)殘留限量的要求，可為國內(nèi)植物油中此類有機農(nóng)藥的檢測提供技術(shù)參考。