沙 桐， 李玉嬌， 張峰波， 王紅英， 李智偉， 趙 驍， 周曉濤， 丁劍冰,3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011; 2第一附屬醫(yī)院, 烏魯木齊 830054;3省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室， 烏魯木齊 830011)

細(xì)粒棘球蚴病是由細(xì)粒棘球絳蟲幼蟲感染中間宿主引起的一種地方性和自然疫源性的人獸共患寄生蟲病[1]。細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus,Eg)生活史需要兩個宿主，成蟲寄生在犬(終末宿主)的小腸，其蟲卵隨糞便排出體外污染環(huán)境造成中間宿主羊和人感染，進(jìn)而發(fā)展為包蟲病[2]。包蟲病在我國新疆和青藏高原地區(qū)比較常見，由于人群的自我保護(hù)意識較差，疾控的宣傳控制力量比較弱，缺乏各種關(guān)于包蟲病的健康教育，受感染人數(shù)比較多。由于包蟲病治療預(yù)后差，其預(yù)防顯得尤為重要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尋找并獲得Eg的相關(guān)保護(hù)性疫苗成為近年來的熱點。2009年，曹春寶[3]在細(xì)粒棘球蚴中發(fā)現(xiàn)了新基因--egG1Y162 抗原基因，該抗原基因已送登基因庫(Genbank)。曹春寶構(gòu)建的egG1y162蛋白質(zhì)是細(xì)粒棘球絳蟲成蟲和原頭蚴均表達(dá)的蛋白。該蛋白能夠跟感染囊性包蟲病的病人血清和犬血清進(jìn)行反應(yīng)，說明該蛋白具有良好的抗原性，從該蛋白中獲得確切的表位信息，進(jìn)行表位疫苗的構(gòu)建，或者反復(fù)將該表位構(gòu)建到高分子載體上，能夠提高疫苗的保護(hù)能力，對未來包蟲病感染的預(yù)防有著重要的意義[4]。Zhang等[5]在此基礎(chǔ)上對egG1y162蛋白的抗原表位進(jìn)行分析，將軟件預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行多重比較，并對預(yù)測的T細(xì)胞和B細(xì)胞聯(lián)合表位通過分子生物學(xué)的方法進(jìn)行克隆、誘導(dǎo)和表達(dá)，純化出相應(yīng)的重組蛋白。又根據(jù)預(yù)測的3個T-B 聯(lián)合表位所在的區(qū)域結(jié)果將抗原截短為2段，其中一段含有1個T-B聯(lián)合表位，即1～51位氨基酸殘基，另外一段含有2個T-B 聯(lián)合表位，即52～120位氨基酸殘基。第一段被命名為egG1y162-1，第二段被命名為egG1y162-2[6]。因此，本次研究將利用生物信息學(xué)方法[7-12]，通過計算機(jī)軟件對egG1y162-1和egG1y162-2重組蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)和空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析比較，并對可能的T細(xì)胞(人和鼠)及B細(xì)胞優(yōu)勢表位進(jìn)行預(yù)測，為深入研究包蟲的egG1y162-1/2相關(guān)候選疫苗分子的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1egG1y162-1和egG1y162-2的氨基酸序列egG1y162蛋白的氨基酸序列存于GenBank，登錄號為AB458259[2],全長120個氨基酸，egG1y162-1為1～51位氨基酸，egG1y162-2為52～120位氨基酸。

1.2egG1y162-1和egG1y162-2的理化性質(zhì)利用在線軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分別對egG1y162-1和egG1y162-2的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.3egG1y162-1和egG1y162-2的二級結(jié)構(gòu)使用DNAstar protean軟件和SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html) 在線軟件分析egG1y162-1和egG1y162-2的二級結(jié)構(gòu)。

1.4egG1y162-1和egG1y162-2的三級結(jié)構(gòu)運用SWISS MODEL在線軟件(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive)建立模型，分析egG1y162-1和egG1y162-2的三級結(jié)構(gòu)。

1.5egG1y162-1和egG1y162-2的T細(xì)胞抗原表位運用在線軟件SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitopeprediction.htm)、IEDB(http://tools.iedb.org/mhcii/)分析egG1y162-1和egG1y162-2的T細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位。

1.6egG1y162-1和egG1y162-2的B細(xì)胞抗原表位運用在線軟件ABCpred(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ABC_submission.html)、BCPred( http://ailab.ist.psu.edu/bcpred/predict.html)、BepiPred-1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred-1.0/)、IEDB(http://tools.iedb.org/bcell/)分析egG1y162-1和egG1y162-2的B細(xì)胞可能的優(yōu)勢抗原表位。

2 結(jié)果

2.1egG1y162-1和egG1y162-2的氨基酸序列根據(jù)GenBank AB458259上的egG1y162蛋白氨基酸序列，確定egG1y162-1(1～51位氨基酸)的序列為：VDPELMAKLTKELKTTLPEHFRWIHVGSRSL-

ELGWNATGLANLHADHIKLT，51個氨基酸殘基；egG1y162-2(52～120位氨基酸)的序列為：ANLYTTYVTFKYRNVPIERQKLTLEGLKPSTFY-

EVVVQAFKGGSQVFKYTGFIRTLAPGEDGA-

DRASGF，69個氨基酸殘基。

2.2ProtParam在線軟件分析結(jié)果

2.2.1 egG1y162-1的理化性質(zhì) egG1y162-1蛋白由51個氨基酸組成，蛋白分子質(zhì)量為5789.70 Daltons；理論pI值為7.08；其中含有6個強(qiáng)堿性(+)氨基酸(K,R)；6個強(qiáng)酸性(-)氨基酸(D,E)；分子式為C262H417N73O73S1；不穩(wěn)定指數(shù)為44.20，歸類為不穩(wěn)定蛋白(>40時，預(yù)測蛋白不穩(wěn)定)；平均親水系數(shù)GRAVY：-0.259(GRAVY值的范圍為-2～2，負(fù)值表明為親水性蛋白)，歸類為親水性蛋白。

2.2.2 egG1y162-2的理化性質(zhì) egG1y162-2蛋白由69個氨基酸組成，蛋白分子質(zhì)量為7743.80 Daltons；理論pI值為9.40；其中含有9個強(qiáng)堿性(+)氨基酸(K,R)；6個強(qiáng)酸性(-)氨基酸(D,E)；分子式為C357H545N91O102；不穩(wěn)定指數(shù)為19.33，歸類為穩(wěn)定蛋白(>40時，預(yù)測蛋白不穩(wěn)定)；平均親水系數(shù)GRAVY：-0.267(GRAVY值的范圍在-2～2之間，負(fù)值表明為親水性蛋白)，歸類為親水性蛋白。

2.3egG1y162-1和egG1y162-2的二級結(jié)構(gòu)

2.3.1 SOPMA服務(wù)器分析 SOMPA分析軟件是用來分析蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)。藍(lán)色Hh表示α-螺旋，紅色Ee表示β-折疊，綠色Tt表示β-轉(zhuǎn)角，紫色Cc表示無規(guī)卷曲。egG1y162-1結(jié)果見圖1，egG1y162-2結(jié)果見圖2。

2.3.2 DNAstar protean結(jié)果 運用DNAstar protean軟件中Garnier-Robson法和Chou-Fasman法分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，主要是α-螺旋(Alpha)、β-折疊(Beta)、β-轉(zhuǎn)角(Turn)、無規(guī)卷曲(Coil)。egG1y162-1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)結(jié)果分別見圖3和表1，兩種方法結(jié)果均顯示egG1y162-1無β-折疊區(qū)域，α-螺旋占比最高，易形成表位的轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲區(qū)域較少。egG1y162-2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)結(jié)果見圖4和表2，兩種方法結(jié)果顯示egG1y162-2的α-螺旋、β-折疊占比較高，但存在許多易形成表位的轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲區(qū)域。

表1 DNAStar Protean預(yù)測egG1y162-1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

表2 DNAStar Protean預(yù)測egG1y162-2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

2.4egG1y162-1和egG1y162-2的三級結(jié)構(gòu)運用Swiss-Model建立三維模型， 圖5中模型顯示的是egG1y162-1上5～38位氨基酸殘基可能的空間結(jié)構(gòu)，綠色線段標(biāo)記的9～28位氨基酸殘基為egG1y162-1的B表位，紅色線段標(biāo)記的29～36位氨基酸殘基為egG1y162-1的人鼠共同T表位。圖6中模型顯示的是egG1y162-2上16～56位氨基酸殘基可能的空間結(jié)構(gòu)，綠色和藍(lán)色線段分別標(biāo)記的25～39位、41～60位氨基酸為egG1y162-2的B表位，紅色線段標(biāo)記的26～41位氨基酸殘基為egG1y162-2的人鼠共同T表位。

2.5egG1y162-1和egG1y162-2的T細(xì)胞抗原表位運用在線軟件SYFPEITHI、IEDB分別分析egG1y162-1和egG1y162-2上各自的人和鼠的T細(xì)胞抗原表位，選取SYFPEITHI上10個分值最高和IEDB上10個百分等級最低的結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果見表3。

根據(jù)各項結(jié)果，預(yù)測egG1y162-1上人的T表位為22～36位氨基酸殘基(RWIHVGSRSLELGWN)，鼠的T表位為29～43位氨基酸殘基(RSLELGWNATGLANL)；egG1y162-2上人的T表位為26～41位氨基酸殘基(GLKPSTFYEVVVQAF)、46～60位氨基酸殘基(VFKYTGFIRTLAPGE)，鼠的T表位為16～30位氨基酸殘基(PIERQKLTLEGLKPS)、31～45位氨基酸殘基(TFYEVVVQAFKGGSQ)。

表3 SYFPEITHI、IEDB預(yù)測的egG1y162-1、egG1y162-2 T細(xì)胞表位

2.6egG1y162-1和egG1y162-2的B細(xì)胞抗原表位運用ABCpred、BCPred、BepiPred分析序列，結(jié)果見表4。

IEDB分析egG1y162-1和egG1y162-2結(jié)果，轉(zhuǎn)角區(qū)域指數(shù)分別見圖7-1、圖7-2，親水指數(shù)分別見圖8-1、圖8-2，骨架柔韌性分別見圖9-1、圖9-2，線性表位分別見圖10-1、圖10-2，表面可及性分別見圖11-1、圖11-2，抗原指數(shù)分別見圖12-1、圖12-2。圖中分值(Score)在紅線水平以上的黃色區(qū)域為易形成表位的區(qū)域，曲線越高表示相應(yīng)指數(shù)越高。

表4 egG1y162-1、egG1y162-2的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測

圖7-1 egG1y162-1轉(zhuǎn)角區(qū)域指數(shù)

圖8-1 egG1y162-1 親水指數(shù)

圖8-2 egG1y162-2親水指數(shù)

圖9-1 egG1y162-1 骨架柔韌性

圖9-2 egG1y162-2 骨架柔韌性

圖10-1 egG1y162-1 線性表位

圖10-2 egG1y162-2 線性表位

圖11-1 egG1y162-1 表面可及性

圖11-2 egG1y162-2 表面可及性

圖12-1 egG1y162-1 抗原指數(shù)

圖12-2 egG1y162-2 抗原指數(shù)

ABCpred、BCPred、BepiPred分析結(jié)果顯示，egG1y162-1、egG1y162-2分別有4個、9個指數(shù)較高的區(qū)段。結(jié)合IEDB各項結(jié)果，考慮egG1y162-1的B細(xì)胞抗原表位可能在15～16位氨基酸殘基附近，可能的B細(xì)胞抗原表位為9～28位氨基酸殘基(LTKELKTTLPEHFRWIHVGS)；egG1y162-2的B細(xì)胞抗原表位可能在27、29、41～42位氨基酸殘基附近，可能的B細(xì)胞抗原表位為25～39位氨基酸殘基(EGLKPSTFYEVVVQAFKGGS)、41～60位氨基酸殘基(KGGSQVFKYTGFIRTLAPGE)。

3 討論

生物信息學(xué)分析技術(shù)是近幾年的研究熱點，科研工作者們使用多種分析軟件進(jìn)行預(yù)測和比對，將研究工作的重點從蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的分析轉(zhuǎn)為深入的預(yù)測和計算蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)。Zhang等[5-6]經(jīng)過綜合感染包蟲病的人和犬血清的Western-blot反應(yīng)結(jié)果，證明egG1y162-2的免疫反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于egG1y162-1，前者的反應(yīng)條帶非常清晰，也證明了最初的設(shè)想，在含有T-B聯(lián)合表位的三個區(qū)域中，egG1y162-2 上集中了兩個經(jīng)過預(yù)測的優(yōu)勢T-B聯(lián)合抗原表位，具有比較強(qiáng)的免疫優(yōu)勢功能。本研究，通過多種生物信息學(xué)方法，對egG1y162-1和egG1y162-2蛋白質(zhì)進(jìn)行分析和預(yù)測。二者結(jié)果進(jìn)行比對，可以發(fā)現(xiàn)，egG1y162-2在穩(wěn)定性、親水性等方面均優(yōu)于egG1y162-1。運用ABCpred、BCPred、BepiPred分析預(yù)測B細(xì)胞抗原表位，結(jié)果顯示egG1y162-2的優(yōu)勢B細(xì)胞表位多于egG1y162-1，再結(jié)合IEDB軟件對蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)角區(qū)域指數(shù)、表面可及性、骨架柔韌性指數(shù)、抗原性指數(shù)和親水性指數(shù)進(jìn)行分析(圖7、8、9、10、11、12，1為egG1y162-1的結(jié)果，2為egG1y162-2的結(jié)果)。親水性指數(shù)越高暴露于表面的幾率越大，成為抗原表位的可能性越大。表面可及性越大，蛋白質(zhì)抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性就越大。而蛋白質(zhì)骨架柔韌性越高，發(fā)生扭曲折疊的幾率就越大?？乖院玫碾亩危赡茏鳛榭乖砦籟12]。綜合各項結(jié)果，選取egG1y162-1的9～28位氨基酸(LTKELKTTLPEHFRWIHVGS)為egG1y162-1的優(yōu)勢B細(xì)胞表位，選取egG1y162-2的25～39位氨基酸(EGLKPSTFYEVVVQAFKGGS)、41～60位氨基酸(KGGSQVFKYTGFIRTLAPGE)為egG1y162-2的優(yōu)勢B細(xì)胞表位。運用SYFPEITHI、IEDB在線軟件分析預(yù)測人類與鼠egG1y162-1、egG1y162-2的T細(xì)胞抗原表位，對SYFPEITHI分值最高的(分值越高，表示該序列成為優(yōu)勢表位的可能性越高)、IEDB百分等級最低(百分等級越低，表示該序列成為優(yōu)勢表位的可能性越高)的各選取10個結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)合二級結(jié)構(gòu)等結(jié)果，排除不易形成表位的結(jié)構(gòu)，預(yù)測egG1y162-1上人的T表位為22～36位氨基酸(RWIHVGSRSLELGWN)，鼠的T表位為29～43位氨基酸(RSLELGWNATGLANL)；egG1y162-2上人的T表位為26～41位氨基酸(GLKPSTFYEVVVQAF)、46～60位氨基酸(VFKYTGFIRTLAPGE)，鼠的T表位為16～30位氨基酸(PIERQKLTLEGLKPS)、31～45位氨基酸(TFYEVVVQAFKGGSQ)。人與鼠兩者對比，egG1y162-1上29～36位氨基酸(RSLELGWN)區(qū)域可能存在人鼠共同T細(xì)胞抗原表位；egG1y162-2上26～41位氨基酸(GLKPSTFYEVVVQAFK)區(qū)域可能存在人鼠共同T細(xì)胞抗原表位。研究人鼠共同T細(xì)胞抗原表位，有助于在利用鼠做egG1y162疫苗試驗時，驗證相關(guān)疫苗在人體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)免疫的可行性。

總之，egG1y162-1、egG1y162-2作為良好的疫苗的候選分子，均具有良好的抗原性和免疫原性，但egG1y162-2在各方面指標(biāo)均優(yōu)于egG1y162-1，EgG1Y162中較強(qiáng)特異性的優(yōu)勢抗原表位可能分布在EgG1Y162-2片段中。通過對egG1y162-1、egG1y162-2蛋白理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、T表位及B表位的分析和預(yù)測，為精確地定位EgG1Y162抗原表位的氨基酸殘基，構(gòu)建高效的多表位疫苗奠定了基礎(chǔ)。