劉 波，陳倩倩，王階平，陳 崢，鄧文瓊，劉 欣，肖 謙，唐國(guó)梁

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350002；2.豫園生物科技有限公司，長(zhǎng)沙 410001）

廣西是我國(guó)甘蔗主要產(chǎn)區(qū)，機(jī)制糖產(chǎn)量超過(guò)我國(guó)機(jī)制糖年總產(chǎn)量的2/3，制糖產(chǎn)業(yè)是廣西不爭(zhēng)的經(jīng)濟(jì)大戶(hù)，也是環(huán)境污染大戶(hù)。據(jù)推算，每產(chǎn)1 t糖排出的廢糖蜜為0.27 t，濾泥占到壓榨總量的2%；全國(guó)每年產(chǎn)糖量為800萬(wàn)t，產(chǎn)生廢糖蜜216萬(wàn)t，濾泥16萬(wàn)t，排出污水量640萬(wàn)t[1]。一個(gè)年產(chǎn)10萬(wàn)t蔗糖的中等規(guī)模的糖廠，其COD總量相當(dāng)于一個(gè)50萬(wàn)人口的中等城市排放的生活污水中的COD總量。就廣西而言，排放到江河中的COD總量有70%來(lái)自糖廠，對(duì)河水的水質(zhì)及周?chē)沫h(huán)境造成很?chē)?yán)重的污染，水域的生態(tài)平衡和水資源的應(yīng)用也受到很大的影響[2]。

國(guó)內(nèi)外在處理蔗渣和糖廠濾泥方面提出了許多方法。在國(guó)外，Kumar等[3]利用微生物處理和蚯蚓后處理堆肥發(fā)酵甘蔗廢棄物形成有機(jī)肥；Pérez等[4]利用分枝桿菌（Mycobacteria）處理糖廠濾泥將植物甾醇（Phytosterols）轉(zhuǎn)換為雄烷（Androstanes）；Rocky-Sali?mi等[5]利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis K46b）發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)植酸酶；Veana等[6]利用黑曲霉（Aspergillus niger GH1）固體發(fā)酵糖蜜和蔗渣生產(chǎn)蔗糖酶；Poo?pathi等[7]利用蔗渣發(fā)酵生產(chǎn)殺蚊生物農(nóng)藥蘇云金芽孢 桿 菌（Bacillus thuringiensis subsp.israelensis）；Techapun等[8]設(shè)計(jì)了連續(xù)流加培養(yǎng)裝置，利用放線菌（Streptomyces sp.Ab106）發(fā)酵糖廠濾泥等農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)木聚糖酶（Xylanase）。在國(guó)內(nèi)，糖廠濾泥處理有過(guò)許多研究，譚宏偉[9]將糖廠濾泥堆肥發(fā)酵制成生物有機(jī)肥；左見(jiàn)軍等[10]綜述了甘蔗糖廠濾泥的資源化利用，糖廠濾泥綜合利用可概括為濾泥生產(chǎn)復(fù)合肥、加工成動(dòng)物飼料、提取蔗蠟及植物固醇、制備材料及添加劑、作為生物質(zhì)燃料等5個(gè)方面。蒙世協(xié)等[1]研究了亞硫酸法糖廠濾泥對(duì)生土熟化改良試驗(yàn)，施用亞硫酸法濾泥處理和亞硫酸法濾泥+復(fù)合微生物菌處理的土壤有機(jī)質(zhì)提高，甘蔗發(fā)芽生根快，出苗率高。劉曉舉等[11]利用糖廠濾泥生產(chǎn)根瘤菌菌劑，分析優(yōu)化了大豆根瘤菌在濾泥中生長(zhǎng)的最佳條件：溫度29℃，pH 7.5，總糖總氮比7∶10，濕度72.97%，接種量51.3 mL·kg-1，脫水濾泥可以作為根瘤菌生長(zhǎng)的載體。黃颯等[12]將碳酸法糖廠濾泥與酸性土壤混合后用于甘蔗種植試驗(yàn)，探索碳酸法糖廠濾泥資源再利用，解決濾泥填埋環(huán)境污染問(wèn)題。虎玉森等[13]利用等離子體發(fā)射光譜（ICP）法、分光光度法和容量分析等方法，測(cè)定了糖廠濾泥中的金屬元素、全磷、有效磷、全氮和有機(jī)質(zhì)含量，說(shuō)明了糖廠濾泥進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值。

糖廠濾泥堆肥發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)肥被廣泛采用。譚宏偉[9]采用功能菌發(fā)酵糖廠濾泥生產(chǎn)生物有機(jī)肥的腐熟速度快，受環(huán)境因素影響較小，發(fā)酵效果穩(wěn)定，發(fā)酵溫度最高達(dá)77.2℃，且70.0～77.2℃的維持時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12 d；發(fā)酵后的有機(jī)質(zhì)含量和有機(jī)酸轉(zhuǎn)化率優(yōu)勢(shì)明顯，分別較傳統(tǒng)（自然）發(fā)酵提高30.2%和12.3%（絕對(duì)值）。農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥發(fā)酵過(guò)程中，微生物起著重要的作用。Wang等[14]報(bào)道了餐廚垃圾發(fā)酵過(guò)程添加石灰和磷酸氨鎂（鳥(niǎo)糞石），可促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和消除臭味。Zhong等[15]比較了接種劑添加與否對(duì)牛糞發(fā)酵的影響，研究表明接種與否影響較小，增加墊料對(duì)發(fā)酵有利，發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)種群為芽孢桿菌等厚壁菌門(mén)的微生物。Zhao等[16]研究了堆肥過(guò)程腐殖質(zhì)降解菌對(duì)腐殖質(zhì)電子傳遞基團(tuán)（lkyl C，O-alkyl C，aryl C，car?boxylic C，aromatic C）的響應(yīng)，影響著堆肥發(fā)酵過(guò)程，調(diào)節(jié)電子傳遞基團(tuán)，可以調(diào)節(jié)堆肥發(fā)酵過(guò)程。許多研究表明，堆肥發(fā)酵過(guò)程中芽孢桿菌是優(yōu)勢(shì)微生物[17-21]。芽孢桿菌具有較高的抗逆性（耐高溫、耐高鹽、耐酸堿、抗紫外線等），在各種土壤中的生存能力較強(qiáng)[22]；同時(shí)能分解有機(jī)質(zhì)，解磷解鉀，提供作物生長(zhǎng)養(yǎng)分，分泌許多抗病、生根、促長(zhǎng)的次生代謝物[23]，在生物肥料和生物農(nóng)藥中廣泛應(yīng)用。作者選用芽孢桿菌作為糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程研究的微生物指標(biāo)，對(duì)于揭示堆肥生產(chǎn)生物有機(jī)肥耐熱微生物種群變化具有重要意義。關(guān)于糖廠濾泥生物有機(jī)肥堆肥發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌種群變化動(dòng)態(tài)的研究未見(jiàn)報(bào)道。

作者利用堆肥發(fā)酵方法，經(jīng)過(guò)好氧發(fā)酵，加速了對(duì)糖廠濾泥的除臭、腐熟、脫水、殺蟲(chóng)和滅菌，高溫堆肥有效殺滅濾泥中夾帶的病原菌、蟲(chóng)卵和雜草籽等，降解有毒有害物質(zhì)；將糖廠濾泥堆肥發(fā)酵加工成生物有機(jī)肥，用于果樹(shù)、瓜類(lèi)、糧油、蔬菜、花卉等的基肥和追肥。為了解糖廠濾泥堆肥發(fā)酵加工生物有機(jī)肥生產(chǎn)過(guò)程中的芽孢桿菌種群動(dòng)態(tài)，通過(guò)采樣、分離、計(jì)數(shù)、純化、鑒定，對(duì)其進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）樣本采集：糖廠濾泥生物有機(jī)肥生產(chǎn)廠家為龍州南華長(zhǎng)豐生物有機(jī)肥有限公司。堆肥發(fā)酵工藝：利用鏟車(chē)把濾泥堆成高1.5 m、底寬4 m、長(zhǎng)182 m的長(zhǎng)條形堆垛，平均每3 d用翻堆機(jī)翻拋1次，發(fā)酵周期60 d，糖廠濾泥腐熟后，粉碎，混合化學(xué)肥料N∶P∶K=12%∶5%∶8%，經(jīng)過(guò)圓盤(pán)造粒，烘干形成商品。發(fā)酵加工過(guò)程的采樣：于糖廠濾泥堆垛的第1 d（AUG-L，淺發(fā)酵）、第30 d（AUG-M，中發(fā)酵）、第60 d（AUG-H，深發(fā)酵）、混合化學(xué)肥料后（AUG-F1，添化肥）、造粒后（AUGF2）分別采樣，同時(shí)，采集堆肥旁邊空地土壤；各采樣點(diǎn)采用五點(diǎn)取樣法，各取500 g，混合后共2500 g樣本，放入冰箱保存?zhèn)溆?。樣品信息?jiàn)表1。

（2）試劑儀器：芽孢桿菌采用LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉5.0 g，pH 7.2～7.4，瓊脂15.0 g，水1.0 L。PCR擴(kuò)增引物采用細(xì)菌通用16S rRNA引物27F（5′-GAG TTTGAT CCT GGC TCA G-3′）和 1492R（5′-ACG GCT ACCTTG TTA CGA CTT-3′），由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)試劑：Mix[含 10×Buffer，dNTP（10 mmol·L-1），Taq 酶（2.5 U·μL-1）]（上海博尚生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），100 bp Marker（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。DNA提取試劑：100 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1Tris/HCl，1 mmol·L-1EDTA，Tris-saturated phenol，氯仿。儀器：UVP GelDoc-It TS Imaging System凝膠成像儀、華粵行儀器有限公司Tpersonal Biometra梯度PCR儀、PowerPac Basic BIO-RAD電泳儀、離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5418R）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芽孢桿菌分離

從各樣本中取樣10 g至90 mL的無(wú)菌水中，搖床30℃，170 r·min-1振蕩30 min充分混合，配成10%濃度的樣本懸浮液；采用劉國(guó)紅等[24]加熱篩選法加以改進(jìn)，將懸浮液放置到80℃的水浴中加熱10 min，殺死細(xì)菌菌體保存芽孢；采用張艷等[25]活菌計(jì)數(shù)法加以改進(jìn)，將樣品梯度稀釋后（10-3、10-4、10-5），涂布LB培養(yǎng)基的平板上，放置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d后觀察培養(yǎng)皿上的菌落，根據(jù)菌落大小、形態(tài)、顏色對(duì)相同類(lèi)型的菌落進(jìn)行編號(hào)和計(jì)數(shù)，分離純化不同編號(hào)的菌株，用16S rDNA基因?qū)幪?hào)菌株進(jìn)行種類(lèi)鑒定，獲得芽孢桿菌種類(lèi)，排除非芽孢桿菌進(jìn)行活菌數(shù)的統(tǒng)計(jì)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，分離純化菌株采用-80℃甘油冷凍法進(jìn)行保存，采用Tris-飽和酚法提取芽孢桿菌基因組DNA，采用通用細(xì)菌16S rRNA引物進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序、鑒定。

表1 蔗糖壓榨糖廠濾泥堆肥發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥過(guò)程樣品信息Table 1 Information of the samples in the process of sugar-refinery filtering mud composting fermentation to produce bio-organic fertilizers

1.2.2 芽孢桿菌種類(lèi)鑒定

細(xì)胞懸浮液制備：于1.5 mL EP管中加入400 μL STE緩沖液，用刮菌環(huán)從平板中刮取少量已純化好的菌落，混勻。DNA提取：1 mL的細(xì)胞懸液在8000 g下離心2 min，棄去上清液后用400 μL STE緩沖液沖洗細(xì)胞兩次，8000 g離心2 min，棄去上清液（若為平板，則400 μL STE懸浮，離心，棄上清液）。用200 μL TE緩沖液懸浮細(xì)胞，然后用100 μL的Tris-飽和酚（取下層）加到離心管中，渦旋混合60 s（振蕩用浮板）。在4℃下13 000 g離心5 min以從有機(jī)相中分離出水相，取160 μL上清液轉(zhuǎn)移到干凈的1.5 mL EP管中。加40 μL TE緩沖液到EP管中，用100 μL氯仿混合，4 ℃13 000 g離心5 min，用氯仿提取的方法純化裂解，直到?jīng)]有白色的界面出現(xiàn)，此過(guò)程重復(fù)2～3遍，每次直接往里加100 μL氯仿，離心。取160 μL上清液到干凈的1.5 mL EP管中，再加40 μL TE緩沖液在37℃下放置10 min，以分解RNA。將100 μL氯仿加到離心管中混勻后，在4℃下13 000 g離心5 min。將150 μL上清液轉(zhuǎn)移到干凈的1.5 mL EP管中，此時(shí)的上清液包含有純化的DNA，且可以直接用于序列實(shí)驗(yàn)，并可在-20 ℃保存。PCR反應(yīng)體系：ddH2O：9.5 μL、Mix：12 μL、正向引物：1 μL、反向引物：1 μL、DNA：1.5 μL；PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，10℃保存。PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取5 μL PCR產(chǎn)物，點(diǎn)樣于1%的瓊脂糖凝膠中，以100 bp Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量，110 V電壓，電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。測(cè)序：檢測(cè)出有條帶的菌株P(guān)CR產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。16S rRNA序列分析：將所得序列在細(xì)菌序列比對(duì)網(wǎng)站EZtaxon-e.ezbiocloud.net上進(jìn)行序列比對(duì)分析后，參照劉波等[26]發(fā)表的芽孢桿菌屬及其近緣屬種名目錄，標(biāo)明中文名稱(chēng)。

1.2.3 糖廠濾泥發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌種群動(dòng)態(tài)分析

（1）統(tǒng)計(jì)糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程各階段（AUGL-第1 d淺發(fā)酵，AUG-M-第30 d中發(fā)酵，AUG-H-第60 d深發(fā)酵，AUG-F1-復(fù)合化學(xué)肥料后，AUG-F2-添化肥造粒后）芽孢桿菌活菌總數(shù)，進(jìn)行種群數(shù)量變化動(dòng)態(tài)分析比較；（2）分析糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程各階段芽孢桿菌不同種類(lèi)和數(shù)量的結(jié)構(gòu)變化，利用種類(lèi)變更率（%）（與上一階段相同種類(lèi)的個(gè)數(shù)/該階段種類(lèi)總個(gè)數(shù)），統(tǒng)計(jì)各階段與上一個(gè)階段相同種類(lèi)芽孢桿菌變更的情況，如果該階段與上階段相同種類(lèi)個(gè)數(shù)多，變更率就低，反之就高，分析種類(lèi)結(jié)構(gòu)變化的程度。（3）利用靠近發(fā)酵場(chǎng)地的本地土壤分離的芽孢桿菌種類(lèi)與糖廠濾泥中分離的種類(lèi)進(jìn)行比較，分析糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌與本土芽孢桿菌的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌種類(lèi)鑒定

從糖廠濾泥堆肥發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥過(guò)程的6個(gè)樣品中共分離到64株芽孢桿菌（表2），分屬于7個(gè)屬，27種，其中芽孢桿菌屬（Bacillus）16種、哈格瓦氏菌屬（Bhargavaea）1種、纖細(xì)芽孢桿菌屬（Gracilibacil?lus）1種、賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）1種、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）3種、鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌屬（Ornithinibacillus）2種、類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus）2種、枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）1種。芽孢桿菌屬占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

2.2 糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程的芽孢桿菌種類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育及中國(guó)新紀(jì)錄種的發(fā)現(xiàn)

在糖廠濾泥堆肥發(fā)酵加工過(guò)程中分離的芽孢桿菌可聚類(lèi)為4類(lèi)（見(jiàn)圖1），第1類(lèi)主要類(lèi)群是以芽孢桿菌屬為主的種類(lèi)，包含了18個(gè)種；第2類(lèi)主要類(lèi)群為大洋芽孢桿菌屬、鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌屬、枝芽孢桿菌屬的種類(lèi)，包含了6個(gè)種；第3類(lèi)主要類(lèi)群為賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬的種類(lèi)，包含1個(gè)種；第4類(lèi)主要為類(lèi)芽孢桿菌屬的種類(lèi)，包含2個(gè)種。其中，有6種芽孢桿菌在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道，為我國(guó)新紀(jì)錄種，它們是：（1）大豆發(fā)酵芽 孢 桿 菌 Bacillus glycinifermentans（FJAT-47935、FJAT-47944、FJAT-47907），（2）外村尚芽孢桿菌Ba?cillus hisashii（FJAT-47926），（3）科研中心哈格瓦氏菌Bhargavaea cecembensis（FJAT-47948）（屬于芽孢桿菌目、動(dòng)球菌科、哈格瓦氏菌屬），（4）苯乙酮賴(lài)氨酸芽孢 桿 菌 Lysinibacillus acetophenoni（FJAT-47912、FJAT-47934、FJAT-47919），（5）巴伐利亞鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌Ornithinibacillus bavariensis（FJAT-47915），（6）拾蛤鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌（Ornithinibacillusscapharcae FJAT-47951）。

2.3 糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程中芽孢桿菌數(shù)量與種群結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化

糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化，見(jiàn)圖2。在糖廠濾泥不同發(fā)酵加工階段，可培養(yǎng)芽孢桿菌數(shù)量差異顯著（P＜0.01**），糖廠濾泥堆肥發(fā)酵初始階段（AUG-L，淺發(fā)酵，1 d）芽孢桿菌總含量114萬(wàn)cfu·g-1；隨著發(fā)酵進(jìn)程進(jìn)入發(fā)酵中期（AUG-M，中發(fā)酵，30 d），總含量上升了107.89%，為237萬(wàn)cfu·g-1；隨著糖廠濾泥堆肥發(fā)酵腐熟進(jìn)入深發(fā)酵階段，總含量下降了84.13%，為37.6萬(wàn)cfu·g-1；腐熟糖廠濾泥添加化肥混合后，芽孢桿菌數(shù)量有所回升，總含量為152萬(wàn)cfu·g-1；經(jīng)過(guò)圓盤(pán)造粒干燥后，產(chǎn)品中的芽孢桿菌數(shù)量大幅度下降到43萬(wàn)cfu·g-1。

表2 糖廠濾泥微生物肥料生物有機(jī)肥堆肥發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌分離鑒定Table 2 Isolation and identification of the Bacillus-like species from the samples in the process of sugar-refinery filtering mud composting fermentation to produce bio-organic fertilizers

糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程中芽孢桿菌種群結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖3。糖廠濾泥堆肥發(fā)酵初始階段（AUGL，淺發(fā)酵，1 d）分離到8種芽孢桿菌，總含量為114萬(wàn)cfu·g-1，優(yōu)勢(shì)種為 Bacillus glycinifermentans FJAT-47935（大豆發(fā)酵芽孢桿菌）（36萬(wàn)cfu·g-1）和Bacillus tequilensis FJAT-47943（特基拉芽孢桿菌）（25萬(wàn)cfu·g-1）；其中，Bacillus glycinifermentans FJAT-47935為我國(guó)新紀(jì)錄種。

糖廠濾泥堆肥發(fā)酵中期階段（AUG-M，中發(fā)酵，30 d），堆垛發(fā)酵30 d，分離到10種芽孢桿菌，總含量為237 × 104cfu·g-1，優(yōu)勢(shì)種為Oceanobacillus polygoni FJAT-47932（蓼藍(lán)大洋芽孢桿菌）（128萬(wàn)cfu·g-1）和Oceanobacillus halophilum FJAT-47931（嗜鹽大洋芽孢桿菌）（72萬(wàn)cfu·g-1）；其中，Lysinibacillus acetophe?noni FJAT-47934（苯乙酮賴(lài)氨酸芽孢桿菌）為我國(guó)新紀(jì)錄種。

圖1 基于16S rRNA基因序列的糖泥生物有機(jī)肥發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 1 Phylogenetic tree of the Bacillus-like species from the samples in the process of sugar-refinery filtering mud composting fermentation to produce bio-organic fertilizers based on the 16S rRNA gene sequences

糖廠濾泥堆肥發(fā)酵腐熟階段（AUG-H，深發(fā)酵，60 d），堆垛發(fā)酵60 d，分離到6種芽孢桿菌，總含量為37.6萬(wàn) cfu·g-1，優(yōu)勢(shì)種為 Oceanobacillus caeni FJAT-47952（淤泥大洋芽孢桿菌）（10.7萬(wàn)cfu·g-1）和Paeni?bacillus harenae FJAT-47953（沙漠沙類(lèi)芽孢桿菌）（10.2萬(wàn) cfu·g-1）；其中，3個(gè)種即 Ornithinibacillus scapharcae FJAT-47951（拾蛤鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌）、Bhar?gavaea cecembensis FJAT-47948（科研中心哈格瓦氏菌）、Bacillus glycinifermentans FJAT-47944（大豆發(fā)酵芽孢桿菌）為我國(guó)新紀(jì)錄種。

圖2 糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌種群數(shù)量變化動(dòng)態(tài)Figure 2 Dynamic changes in population quantity of the Bacilluslike species in the samples in the process of sugar-refinery filtering mud composting fermentation

糖廠濾泥腐熟料混合化肥加工階段（AUG-F1，添加化肥），堆垛發(fā)酵腐熟后，添加化肥成分（N∶P∶K=15%∶5%∶8%），造粒前分離到8種芽孢桿菌，總含量為152萬(wàn)cfu·g-1，優(yōu)勢(shì)種為Oceanobacillus caeni FJAT-47911（淤泥大洋芽孢桿菌）（43萬(wàn)cfu·g-1）和Bacillus glycinifermentans FJAT-47907（大豆發(fā)酵芽孢桿菌）（42萬(wàn)cfu·g-1）；其中3個(gè)種，即Bacillus glycinifermen?tans FJAT-47907（大豆發(fā)酵芽孢桿菌）、Ornithinibacil?lus bavariensis FJAT-47915（巴伐利亞鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌）、Lysinibacillus acetophenoni FJAT-47912（苯乙酮賴(lài)氨酸芽孢桿菌）為我國(guó)新紀(jì)錄種。

糖廠濾泥腐熟料造粒加工階段（AUG-F2，造粒產(chǎn)品），堆垛發(fā)酵腐熟后，添加化肥，進(jìn)行圓盤(pán)造粒，從造粒產(chǎn)品中分離到8種芽孢桿菌，總含量為43萬(wàn)cfu·g-1，優(yōu)勢(shì)種為 Bacillus thermotolerans FJAT-47921（耐溫芽孢桿菌）（11萬(wàn) cfu·g-1）和 Bacillus farraginis FJAT-47917（混料芽孢桿菌）（9萬(wàn)cfu·g-1）；其中，Ba?cillus hisashii FJAT-47926（外村尚芽孢桿菌）為我國(guó)新紀(jì)錄種。

2.4 糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌與本土芽孢桿菌關(guān)系

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從糖廠濾泥堆肥發(fā)酵堆場(chǎng)周?chē)寥乐蟹蛛x到芽孢桿菌7種，總含量為215萬(wàn)cfu·g-1，優(yōu)勢(shì)種為Bacillus pumilus FJAT-47966（短小芽孢桿 菌）（65萬(wàn) cfu·g-1）和 Bacillus galactosidilyticus FJAT-47969（解半乳糖苷芽孢桿菌）（41萬(wàn)cfu·g-1），未發(fā)現(xiàn)我國(guó)新紀(jì)錄種。本地土壤樣品中的短小芽孢桿菌、高地芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)硫芽孢桿菌在糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程未發(fā)現(xiàn)，而解半乳糖苷芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，可以在糖廠濾泥堆肥發(fā)酵加工過(guò)程中看到；糖廠濾泥中的許多芽孢桿菌，在本地土壤中未分離到，本土芽孢桿菌對(duì)糖廠濾泥堆肥發(fā)酵的影響較小，其發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)的芽孢桿菌主要來(lái)源于自帶種類(lèi)。

圖3 糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌種類(lèi)結(jié)構(gòu)變化動(dòng)態(tài)Figure 3 Dynamic changes in population structure of the Bacillus-like species in the samples in the process of sugarrefinery filtering mud composting fermentation

3 討論

近年來(lái)，糖廠濾泥用于生產(chǎn)生物有機(jī)肥成為資源化趨勢(shì)。劉忠等[27]進(jìn)行蔗田土壤有機(jī)質(zhì)平衡預(yù)測(cè)，為甘蔗生產(chǎn)中合理使用甘蔗殘?bào)w、糖廠濾泥和酒精廢液，提高土壤肥力及甘蔗產(chǎn)量提供依據(jù)。蒙炎成等[28]研究了糖廠濾泥對(duì)蔗田土壤微生物數(shù)量的影響，結(jié)果表明處理后1個(gè)月，濾泥和酒精發(fā)酵液處理土壤細(xì)菌總數(shù)均達(dá)到最大值；處理后2個(gè)月，濾泥處理土壤放線菌總數(shù)達(dá)到最大值；處理后3個(gè)月，土壤絲狀真菌總數(shù)達(dá)到最大值；說(shuō)明糖廠濾泥對(duì)提高蔗田土壤微生物數(shù)量有顯著的促進(jìn)作用。謝少蘭[29]報(bào)道了利用糖廠濾泥擠壓造粒生產(chǎn)有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)混肥的工藝技術(shù)，產(chǎn)品的農(nóng)田試驗(yàn)獲得較好效果，利用濾泥和蔗灰作為有機(jī)質(zhì)，摻合適量的氮、磷、鉀，制成濾泥（蔗灰）復(fù)混肥料，農(nóng)田試驗(yàn)證明，對(duì)農(nóng)作物有增產(chǎn)效果，已被當(dāng)?shù)氐恼徂r(nóng)所認(rèn)識(shí)。然而，糖廠濾泥料堆肥發(fā)酵生產(chǎn)微生物肥過(guò)程芽孢桿菌種群變化動(dòng)態(tài)的研究未見(jiàn)報(bào)道。

表3 糖廠濾泥堆肥發(fā)酵堆場(chǎng)周?chē)寥劳裂挎邨U菌種類(lèi)分離鑒定Table 3 Isolation and identification of the Bacillus-like species in the soil samples around the sugar-refinery filtering mud composting fermentation yard

糖廠濾泥堆肥發(fā)酵生產(chǎn)生物有機(jī)肥過(guò)程中芽孢桿菌種類(lèi)比較豐富。本研究分離到7屬27種芽孢桿菌，在這些芽孢桿菌中，發(fā)現(xiàn)6種國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道的芽孢桿菌，它們是：（1）Bacillus glycinifermentans FJAT-47935、FJAT-47944、FJAT-47907（大豆發(fā)酵芽孢桿菌），由韓國(guó)學(xué)者Kim等[30]從大豆發(fā)酵物中分離的芽孢桿菌新種；（2）Bacillus hisashii FJAT-47926（外村尚芽孢桿菌），由日本學(xué)者Nishida等[31]從取食高溫堆肥發(fā)酵物的無(wú)菌老鼠的盲腸中分離的芽孢桿菌新種；（3）Bhargavaea cecembensis FJAT-47948（科研中心哈格瓦氏菌），由印度學(xué)者M(jìn)anorama等[32]從印度洋查戈斯-拉克代夫海嶺深5904 m沉積物中分離的哈格瓦氏菌屬新種，屬于芽孢桿菌目、動(dòng)球菌科；（4）Lysini?bacillus acetophenoni FJAT-47912、FJAT-47934、FJAT-47919（苯乙酮賴(lài)氨酸芽孢桿菌），由Azmatunni?sa等[33]從有機(jī)溶劑乙酰苯中分離的賴(lài)氨酸芽孢桿菌新種；（5）Ornithinibacillus bavariensis FJAT-47915（巴伐利亞鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌），由德國(guó)學(xué)者M(jìn)ayr等[34]從德國(guó)巴伐利亞洲巴氏消毒牛奶中分離，建立鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌新屬的模式種；（6）Ornithinibacillus scapharcae FJAT-47951（拾蛤鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌新），由韓國(guó)學(xué)者Shin等[35]從死蛤上分離出的鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌屬新種；這些芽孢桿菌為我國(guó)芽孢桿菌新紀(jì)錄種。

糖廠濾泥堆肥發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌種群動(dòng)態(tài)的研究表明，糖廠濾泥堆肥發(fā)酵初期，自帶豐富的芽孢桿菌種群，包括了8種芽孢桿菌，總含量達(dá)114萬(wàn)cfu·g-1，達(dá)到常規(guī)接菌的水平。經(jīng)過(guò)30 d發(fā)酵，芽孢桿菌數(shù)量上升達(dá)到高峰，種類(lèi)下降為6種，除了Bacillus si?amensis FJAT-47940與前一期發(fā)酵相同外，其余種類(lèi)不同，種類(lèi)變更率83%；含量與堆肥發(fā)酵初期比上升了107.89%，達(dá)237萬(wàn)cfu·g-1；經(jīng)過(guò)60 d堆肥腐熟，芽孢桿菌數(shù)量大幅度下降，與前一期發(fā)酵相比，數(shù)量下降了84.13%，為37.6萬(wàn)cfu·g-1，雖然數(shù)量下降，但種類(lèi)上升為10種，除了Oceanobacillus caeni FJAT-47952、Oceanobacillus polygoni FJAT-47947、Bacillus siamensis FJAT-47950相同外，其余種類(lèi)不同，種類(lèi)變更率70%，物料腐熟過(guò)程另外一批芽孢桿菌種群占優(yōu)勢(shì)；到了添加化肥階段，添加化肥成分N∶P∶K=15%∶5%∶8%，添加化肥后，產(chǎn)品造粒加工過(guò)程工序在混合槽內(nèi)存放1～2 d，此時(shí)，芽孢桿菌數(shù)量有所回升，總含量為152萬(wàn)cfu·g-1，種類(lèi)有所下降，為8種，其中除了Oceanobacillus caeni FJAT-47911、Bacillus tequilensis FJAT-47913、Bacillus thermotolerans FJAT-47914以外，其余種類(lèi)不同，種類(lèi)變更率達(dá)62%；進(jìn)入圓盤(pán)造粒階段，混合物料經(jīng)過(guò)圓盤(pán)造粒，烘干、包裝等工序生產(chǎn)出產(chǎn)品，此時(shí)，芽孢桿菌數(shù)量大幅度下降，總含量為43萬(wàn)cfu·g-1，種類(lèi)為8種，除了Bacillus thermotolerans FJAT-47921、Lysinibacillus endophyticus FJAT-47919、Bacillus tequilensis FJAT-47925外，其余種類(lèi)不同，種類(lèi)變更率為62%。

作者首次揭示了糖廠濾泥堆肥發(fā)酵、生物有機(jī)肥加工過(guò)程芽孢桿菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化；糖廠濾泥堆肥發(fā)酵全過(guò)程不外加芽孢桿菌接種劑，自帶的芽孢桿菌能發(fā)揮作用，數(shù)量變化范圍在-80%～+100%；種類(lèi)的變更率在62%～84%，即不同堆肥加工階段芽孢桿菌種類(lèi)大部分不相同，盡管堆肥發(fā)酵過(guò)程有些階段芽孢桿菌含量較高（如堆肥發(fā)酵中期芽孢桿菌數(shù)量達(dá)237萬(wàn)cfu·g-1），但在最終復(fù)合生物肥料產(chǎn)品中芽孢桿菌總含量?jī)H為43萬(wàn)cfu·g-1。同時(shí)，這些芽孢桿菌與本地土壤芽孢桿菌關(guān)系不大，主要是由自身原料攜帶的種類(lèi)；堆肥加工過(guò)程，那些適應(yīng)堆肥物料變化的種類(lèi)生長(zhǎng)起來(lái)，不適應(yīng)的被淘汰，不同芽孢桿菌通過(guò)對(duì)堆肥物料適應(yīng)，其選擇了相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)生態(tài)位。因而，在糖廠濾泥堆肥發(fā)酵時(shí)，自身的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)條件（濕度、通氣、pH、溫度等）選擇了自帶的足夠豐富的芽孢桿菌種群，外加芽孢桿菌菌種的必要性值得討論。在生產(chǎn)復(fù)合生物肥料時(shí)，添加芽孢桿菌菌種進(jìn)入產(chǎn)品，是否能提升產(chǎn)品的芽孢桿菌含量值得討論，要看芽孢桿菌對(duì)物料適應(yīng)性和加工過(guò)程的適應(yīng)性，才能形成有效芽孢桿菌種群。

4 結(jié)論

糖廠濾泥堆肥發(fā)酵、添加加工過(guò)程芽孢桿菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，數(shù)量變化范圍在-80%～+100%；種類(lèi)的變更率在62%～84%。

糖廠濾泥堆肥發(fā)酵的芽孢桿菌主要來(lái)至自身攜帶的種類(lèi)，本地土壤芽孢桿菌關(guān)系不大。盡管堆肥發(fā)酵過(guò)程有些階段芽孢桿菌含量較高（如堆肥發(fā)酵中期芽孢桿菌數(shù)量達(dá)237萬(wàn)cfu·g-1），但在最終復(fù)合生物肥料產(chǎn)品中芽孢桿菌總含量?jī)H為43萬(wàn)cfu·g-1。

糖廠濾泥堆肥發(fā)酵，分離到7屬27種芽孢桿菌，在這些芽孢桿菌中，發(fā)現(xiàn)6種國(guó)內(nèi)新紀(jì)種，它們是：（1）Bacillus glycinifermentans（大豆發(fā)酵芽孢桿菌），（2）Bacillus hisashii FJAT-47926（外村尚芽孢桿菌），（3）Bhargavaea cecembensis FJAT-47948（科研中心哈格瓦氏菌），（4）Lysinibacillus acetophenoni（苯乙酮賴(lài)氨酸芽孢桿菌），（5）Ornithinibacillus bavariensis（巴伐利亞鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌），（6）Ornithinibacillus scaphar?cae（拾蛤鳥(niǎo)氨酸芽孢桿菌新）。