秦羽楓，陳方博，張桂林，程鵬飛2，*，肖 鵬，李守淳*

（1.江西師范大學生命科學學院，南昌 330027；2.九江學院化學與環(huán)境工程學院，江西 九江 332005；3.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315211;4.江西省九江市濂溪區(qū)農(nóng)業(yè)局，江西 九江 332005）

隨著沼氣工程的發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖業(yè)糞污資源化取得了明顯的成效。但是在提供清潔能源的同時，也產(chǎn)生了大量的沼渣和沼液廢水。大量富營養(yǎng)的豬糞沼液廢水對水體環(huán)境以及人類健康都造成了嚴重危害[1-2]。豬糞沼液廢水是一種較難處理的有機廢水，除了富含N、P等營養(yǎng)物質(zhì)外，還有少量重金屬、抗生素等成分。未得到妥善處理的豬糞沼液會導致水體富營養(yǎng)化、人類飲用水源污染等問題，嚴重破壞水體生態(tài)環(huán)境[3]。

目前處理沼液廢水的方法主要有還田應用、物理化學法及厭氧發(fā)酵等工藝[4-5]。還田應用在一定程度上實現(xiàn)了畜禽糞污的資源化利用，但農(nóng)田作物對畜禽糞污的接納能力有限，不能與畜禽排放量完全同步，進而引起水體及土壤累積性污染。物理化學法與厭氧發(fā)酵技術(shù)雖然能去除沼液廢水中部分有機、無機污染物，但對沼液廢水中的N、P等大量物質(zhì)的去除效果不明顯，并且具有成本高、不易操作等缺點[6]。

微藻是一種單細胞光合自養(yǎng)生物，其生長所需要的營養(yǎng)成分較為簡單，可利用沼液廢水中營養(yǎng)物質(zhì)進行生長[7]。利用微藻凈化污水或處理豬糞沼液廢水的技術(shù)已得到國內(nèi)外學者的認可[8]。微藻在處理沼液廢水過程中，由于自身細胞的增殖與營養(yǎng)物質(zhì)的積累，在降低培養(yǎng)基成本的同時也實現(xiàn)了沼液廢水的無害化、資源化利用[9]。但實際情況中養(yǎng)豬沼液過高濃度的NH+4-N超出了微藻的耐受性，抑制了藻細胞的生長。Min等[10]通過淡水稀釋的方法降低NH+4-N濃度，Deng等[11]利用厭氧消化預處理降低NH+4-N濃度，均達到了一定的效果。但這些技術(shù)手段在應用中卻面臨高成本等問題。因此，利用藻類處理養(yǎng)豬沼液還需進一步研究[12]。

養(yǎng)豬沼液成分復雜，富含COD、有機物等物質(zhì)，導致水體的光強和光質(zhì)隨著水體透明度發(fā)生變化，抑制甚至損害藻類的生長。光是調(diào)控藻類植物生長發(fā)育的關(guān)鍵因子之一，藻類對可見光的吸收波長主要集中在400～510 nm的藍紫光區(qū)和610～720 nm的紅橙光區(qū)。大量研究發(fā)現(xiàn)光質(zhì)對藻類的生長發(fā)育、形態(tài)、光合作用和物質(zhì)代謝等具有重要的調(diào)控作用，如蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）在藍光下的生長效果最佳[13]，而紅光則能促進等鞭金藻的藻細胞生長[14]。光質(zhì)是光的重要屬性，因此光質(zhì)應被優(yōu)先考慮。探究不同光質(zhì)條件對藻類處理養(yǎng)豬沼液廢水的影響具有一定的理論意義。

在藻類培養(yǎng)處理沼液廢水過程中NH+4-N濃度是限制微藻-沼液資源化利用的重要因素。利用藻類培養(yǎng)深度凈化沼液廢水，解決廢水中高濃度-N問題很關(guān)鍵。微藻在處理N同時也為自身生長提供氮源，而銨鹽是藻細胞優(yōu)先利用的氮源，在氮吸收調(diào)節(jié)過程中起到重要作用[15]。由于實際豬業(yè)養(yǎng)殖過程中，豬飼料Cu元素的存在可以促進豬腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而豬本身卻對Cu2+的吸收率僅為10%左右，大部分Cu2+隨豬尿排出[16]。因此，Cu2+是養(yǎng)豬沼液廢水中普遍存在的金屬元素。藻類去除重金屬的機制比較明確，但沼液廢水中存在的一些金屬元素是否影響N在藻細胞內(nèi)的吸收代謝目前尚不清楚，還需進一步研究。

基于上述背景，本文以篩選得到耐污能力強的柵藻（Scenedesmus obliquus）為研究對象，采集江西九江境內(nèi)養(yǎng)殖場厭氧發(fā)酵后的典型沼液廢水，研究不同光質(zhì)條件（紅光、藍光、白光）對柵藻處理沼液廢水的影響。同時以養(yǎng)豬沼液中-N、Cu2+濃度為參照，在BG11培養(yǎng)基中考察不同濃度的-N及金屬Cu2+對柵藻生長的影響，以期為微藻-沼液廢水資源化利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

本實驗所用柵藻（Scenedesmus obliquus）由實驗室篩選并馴化保藏。柵藻種子液培養(yǎng)及-N、Cu2+濃度對柵藻生長實驗所用培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基[17]。

柵藻培養(yǎng)所用反應器為玻璃柱式反應器，內(nèi)直徑0.05 m，柱高0.55 m，反應體積0.9 L。反應器內(nèi)部布置直徑5 mm的玻璃通氣管，混合有1.5%CO（2V/V）的壓縮空氣（0.1 MPa）以100 mL·min-1的速率通過通氣管從反應器底部曝氣，使藻液攪動并補充碳源。前期研究證實，光照強度 80～100 μmol photons·m-2·s-1下柵藻細胞生長較好。為了考察柵藻生長最高效率，柵藻培養(yǎng)過程中連續(xù)光照，培養(yǎng)柱表面光強100 μmol photons·m-2·s-1，培養(yǎng)溫度（25±1）℃。

1.2 沼液廢水

本文柵藻培養(yǎng)所用沼液廢水取自江西九江境內(nèi)某養(yǎng)殖場經(jīng)厭氧發(fā)酵后的典型沼液廢水，取水時間為2017年9月12日10：00。廢水經(jīng)自然沉降2 d后，取上清液測定其初始氨氮（NH+4-N）、Cu2+、總磷（TP）、COD等指標，結(jié)果見表1。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 不同光質(zhì)條件對柵藻處理沼液廢水的影響

表1 沼液廢水的參數(shù)指標（mg·L-1）Table 1 The features of the raw piggery wastewater（mg·L-1）

本實驗以稀釋兩倍的養(yǎng)豬沼液廢水作為柵藻培養(yǎng)液。取自然沉降后的沼液上清液1000 mL，再加入1000 mL蒸餾水，制成培養(yǎng)液。將培養(yǎng)至對數(shù)期的柵藻種子液接入配制好的培養(yǎng)液中，在玻璃柱式反應器中進行培養(yǎng)。在LED光源儀器下接受不同光質(zhì)（藍光、紅光、白光）條件的培養(yǎng)，其中藍光波長范圍為455～475 nm，紅光波長范圍為580～630 nm，白光波長范圍為400～760 nm，采用連續(xù)光照，光照強度均為 100 μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃。每2 d稱量藻體生物量，重復3次，培養(yǎng)周期為10 d。

同時，在不同光質(zhì)條件培養(yǎng)過程中取培養(yǎng)液，分別測定2、4、6、10 d的培養(yǎng)液中-N濃度變化情況。NH+4-N測量采用納氏試劑分光光度法（HJ 535—2009）。

1.4 藻細胞生物量測定與生物產(chǎn)率計算

將孔徑0.45 μm、直徑50 mm、面積為0.001 m2的醋酸纖維濾膜煮沸3次后，在105℃烘箱中烘至恒質(zhì)量（W1），將待測藻細胞用移液器取15 mL藻樣到抽濾裝置內(nèi)，抽濾至已稱質(zhì)量的濾膜上，將附著藻的濾膜放入105℃烘箱中烘至恒質(zhì)量（W2），用分析天平稱量，并計算藻細胞的生物量（DW，g·L-1）。

DW=（W2-W1）/15

基于本研究培養(yǎng)時間為10 d，柵藻生物產(chǎn)率（BP，g·L-1·d-1）計算公式如下：

BP=DW/10

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 10.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅光、藍光、白光條件下沼液廢水培養(yǎng)柵藻生長及-N去除效果

培養(yǎng)10 d后測定柵藻的生長情況，結(jié)果如圖1所示，在3種光質(zhì)條件下柵藻均能在沼液廢水中生長，但在藍光和紅光下的生長狀況不佳，尤其是培養(yǎng)至后期，藻細胞增長趨于平緩。而白光條件下藻細胞的生長速率最快，明顯高于藍光和紅光，其生物產(chǎn)率分別為0.21、0.04、0.03 g·L-1·d-1。

在光照強度100 μmol·m-2·s-1的不同光質(zhì)條件下培養(yǎng)柵藻，經(jīng)測定，稀釋1倍后的沼液中N濃度為326 mg·L-1。一個培養(yǎng)周期內(nèi)測定的培養(yǎng)液中-N濃度見圖2。由圖2可知，相同培養(yǎng)條件中，白光光質(zhì)條件下柵藻去除沼液廢水中N能力最強，由初始的N濃度326 mg·L-1降到29 mg·L-1，去除率為91.1%。不同取樣時間下，藍光和紅光光質(zhì)條件中的-N濃度變化不大，培養(yǎng)10 d后去除效率分別為72.4%和66.9%。對比圖1與圖2可知，柵藻在不同光質(zhì)條件下對沼液廢水中-N去除效率與柵藻細胞生長狀況相對應。

2.2 不同-N濃度對柵藻生長的影響

2.3 不同Cu2+濃度對柵藻生長的影響

不同Cu2+濃度對柵藻生長的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4a可知，在培養(yǎng)前4 d內(nèi)柵藻在不同Cu2+濃度下生長速率與正常培養(yǎng)基相差不大。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)10 d時，Cu2+濃度越高柵藻生物產(chǎn)率越低，0.5、1.0、2.0 mg·L-1Cu2+濃度分別為0.18、0.15、0.13 g·L-1·d-1，都低于正常培養(yǎng)下的生物產(chǎn)率0.19 g·L-1·d-1。因此，養(yǎng)豬沼液中存在的金屬Cu2+也是限制藻類生長的重要因素。

2.4 不同Cu2+濃度對柵藻適應NH+4-N的影響

圖1 不同光質(zhì)條件下柵藻在沼液廢水中的生長狀況Figure 1 The growth of Scendesmus dimorphus with different light qualities in swine wastewater

圖2 不同光質(zhì)條件下沼液廢水中-N濃度變化Figure 2 Concentrations and removal efficiency of -N with different light qualities in swine wastewater

圖3 -N對柵藻細胞生長的影響Figure 3 Effects of ammonia nitrogen on growth of Scenedesmus obliquus

以沼液廢水中506 mg·L-1NH+4-N濃度為標準，在BG11培養(yǎng)基中設(shè)置500 mg·L-1的NH+4-N濃度，然后將柵藻分別培養(yǎng)于額外添加Cu2+濃度0.5、1.0、2.0 mg·L-1的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)10 d后，結(jié)果（圖5）表明，添加Cu2+濃度0.5、1.0 mg·L-1的培養(yǎng)液中柵藻生物產(chǎn)率分別為0.18、0.19 g·L-1·d-1，與正常培養(yǎng)基相近。而高Cu2+濃度（2.0 mg·L-1）下，柵藻生長較差，生物產(chǎn)率為0.13 g·L-1·d-1。但將圖 5與圖 4b比較表明，一定的-N存在下，柵藻能耐受較高的Cu2+濃度。

3 討論

光是藻類生長發(fā)育過程中重要的環(huán)境因子之一。本研究將柵藻分別置于不同光質(zhì)條件（白光、紅光、藍光）的沼液廢水中培養(yǎng)，結(jié)果顯示柵藻在白光下生長狀況要顯著優(yōu)于其他兩類光質(zhì)條件。這說明不同波長的光源會影響柵藻細胞組分在沼液廢水中的合成。同樣，相比于其他兩種光質(zhì)，白光條件下柵藻對沼液廢水中NH+4-N去除效率更高。不同光質(zhì)條件對不同藻類的生長影響不同，這主要是因為不同藻種門類其色素體結(jié)構(gòu)與組成不同，微藻光合細胞中捕獲光能主要由光合色素完成，所以光環(huán)境（包括光質(zhì)）的改變對微藻光合色素形成具有重要影響[18-20]?？赡芑诠赓|(zhì)條件對柵藻細胞形態(tài)建成、光合特性及生理代謝等廣泛的調(diào)控作用[21]，柵藻在白光光質(zhì)下培養(yǎng)并處理養(yǎng)豬沼液是相對較好的條件。

圖4 Cu2+對柵藻細胞生長的影響Figure 4 Effects of copper on growth of Scenedesmus obliquus

圖5 -N存在下Cu2+對柵藻生長的影響Figure 5 Effects of copper on growth of Scenedesmus obliquus with ammonia nitrogen coexistence

金屬Cu2+在養(yǎng)豬沼液中存在是因為Cu2+等金屬元素在預防和治療疾病、促進豬生長以及提高飼料利用效率等方面發(fā)揮了顯著的作用，成為養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)不可或缺的金屬元素。然而，豬等畜禽對Cu2+等金屬元素的吸收效率很低，大部分隨尿液排出，這也是養(yǎng)豬沼液中重金屬Cu2+存在的主要原因[16]。在一定濃度范圍內(nèi)，藻類在響應重金屬脅迫過程中，會建立起一系列的適應機制，通過控制重金屬吸收、吸附、轉(zhuǎn)運、解毒，使藻細胞組分中的重金屬維持在正常濃度范圍。但當培養(yǎng)液中金屬濃度過高時就會抑制藻細胞的生長。這也印證了本研究中當培養(yǎng)基Cu2+濃度大于1.0 mg·L-1后，柵藻細胞生長速率變緩，生物產(chǎn)率低于正常培養(yǎng)及低濃度Cu2（+0.5 mg·L-1）下的生物產(chǎn)率（圖4）。

利用藻類培養(yǎng)處理養(yǎng)豬沼液的研究需要考慮眾多因素的影響[26]。本研究主要側(cè)重于沼液中存在的主要物質(zhì)N與Cu2+兩種因素，考察它們同時存在下對藻類培養(yǎng)的影響。通過比較圖3與圖4發(fā)現(xiàn)：相比于單因素金屬Cu2+存在下（圖4），柵藻在含高濃度-N沼液中更能耐受較高的Cu2+濃度。這或許說明一定的-N濃度促進了柵藻對Cu2+的富集或吸收。藻類去除重金屬的機制比較明確，但沼液廢水中存在的一些金屬元素是否影響-N在細胞內(nèi)的代謝目前尚不清楚，后續(xù)還需進一步研究。利用藻類培養(yǎng)處理養(yǎng)豬沼液廢水，既可降低藻類的培養(yǎng)成本，又可凈化廢水，保護生態(tài)環(huán)境，是一條資源化利用的途徑。

4 結(jié)論