馮迪南，王夢瑤，余成鵬，劉瓊光，2

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 廣東省微生物信號與作物病害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

馬鈴薯是我國第四大糧食作物，中國是世界上馬鈴薯第一生產(chǎn)大國。然而，馬鈴薯病害是影響馬鈴薯生產(chǎn)的一大障礙，其中馬鈴薯細(xì)菌性軟腐病是大田生產(chǎn)和貯藏期發(fā)生最普遍且嚴(yán)重的病害之一［1］。引起馬鈴薯腐爛癥狀的病原菌種類主要包括果膠桿菌屬（Pectobacterium）和迪克氏菌屬（Dickeya）中的一些種［2］，其中Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense （簡稱Pcb）分布廣泛，危害嚴(yán)重［3］。馬鈴薯作為廣東省冬種作物，種植面積大。近年來，田間馬鈴薯細(xì)菌性軟腐病逐年加重，病原細(xì)菌可侵染馬鈴薯的塊莖、莖和葉，導(dǎo)致發(fā)病部位變黑、組織軟腐、散發(fā)惡臭味，嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，馬鈴薯軟腐病防治的主要措施是以加強(qiáng)栽培管理為主的農(nóng)業(yè)防治，且防治藥劑種類較少［4］，生產(chǎn)上用于防治植物細(xì)菌病害的化學(xué)藥劑是否對病原細(xì)菌Pcb都有效果，尚不十分清楚，因此，有必要篩選對Pcb有明顯抑菌作用的理想藥劑。此外，生物防治因其對環(huán)境友好、對人畜安全等諸多優(yōu)點(diǎn)受到國際廣泛重視，其中的生防細(xì)菌是防治植物病害的環(huán)保新選擇，并且拮抗菌劑在生產(chǎn)實(shí)踐中也取得了令人矚目的成就，顯示出巨大經(jīng)濟(jì)效益和廣闊應(yīng)用前景［5］，為此，分離篩選有效的拮抗細(xì)菌顯得尤為重要。但是，迄今有關(guān)馬鈴薯軟腐細(xì)菌的拮抗菌篩選以及軟腐病的生物防治研究較少。

本研究以馬鈴薯軟腐病菌Pcb菌株P(guān)o-2為指示菌，通過室內(nèi)平板抑菌試驗(yàn)，篩選對Pcb抑菌作用較好的化學(xué)藥劑，并探索不同藥劑混配的作用效果，進(jìn)一步篩選和鑒定對Pcb有較好抑菌效果的拮抗細(xì)菌，以期為馬鈴薯細(xì)菌性軟腐病的化學(xué)防治和生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病原菌為馬鈴薯軟腐病菌Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis Po-2菌株，分離自廣東省惠東縣馬鈴薯產(chǎn)區(qū)，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)菌研究室保存并提供。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。以不加瓊脂作為液體培養(yǎng)基。普通細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，酵母膏3 g，蛋白胨3 g，硫酸鎂0.25 g，磷酸氫二鉀2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，蔗糖15 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL。供試藥劑選擇國內(nèi)馬鈴薯生產(chǎn)上防治植物細(xì)菌性病害的9種藥劑，見表1。

表1 供試藥劑及其有效成分和廠家

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單一藥劑對馬鈴薯軟腐病菌的平板抑菌試驗(yàn) 各藥劑設(shè)置2個濃度，其中一個是藥劑說明書上的使用濃度，另一個是該濃度的3倍稀釋液，利用平板打孔方法，測定9種藥劑對Pcb的抑菌作用。方法如下：將Po-2單菌落接種于10 mL LB培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)24 h，調(diào)整OD600約為0.5，并取1 mL菌液加入到100 mL融化的（約45℃）LB固體培養(yǎng)基中，充分混勻后，倒入滅菌培養(yǎng)皿中，制成含Pcb指示菌Po-2平板，凝固后用7 mm打孔器在平板上打孔，在孔內(nèi)加入50 μL藥劑，每個藥劑濃度3次重復(fù)，以無菌水作對照。30℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈大小。

1.2.2 混合藥劑對馬鈴薯軟腐病菌的平板抑菌試驗(yàn) 挑選單一藥劑抑菌作用效果較好的藥劑，以1∶1進(jìn)行兩兩混配，進(jìn)行平板抑菌試驗(yàn)，方法同1.2.1。

1.2.3 馬鈴薯軟腐病菌拮抗細(xì)菌分離和篩選土壤細(xì)菌分離 土壤樣本采集于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園及周邊環(huán)境的植物根際，土壤細(xì)菌分離方法為：稱取10 g土壤于錐形瓶中，加入50 mL無菌水，充分?jǐn)嚢瑁o置15～20 min，取上清液進(jìn)行10倍梯度稀釋，而后取100 μL稀釋液均勻涂布在普通細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)24～48 h，挑取不同形態(tài)單菌落，多次純化，備用。

拮抗細(xì)菌平板篩選：將上述已純化的細(xì)菌菌株接種于10 mL LB中，30℃培養(yǎng)24 h，調(diào)整OD600約為0.5，然后取3 μL點(diǎn)接在新制備的Po-2平板上，方法同1.2.1。30℃培養(yǎng)24～48 h，測定抑菌圈大小。

1.2.4 拮抗細(xì)菌16S rDNA初步鑒定 對篩選出的拮抗細(xì)菌，采用細(xì)菌的通用引物E8F/ATCGTGCCCATCGATCACTG和1541R/CATGGATCGTCATAAAGCT，PCR擴(kuò) 增 16S rDNA片段，25 μL PCR反應(yīng)體系為：PCR緩沖 液 2.5 μL、dNTPs 2 μL、引物各1 μL、TaqDNA聚合酶0.4 μL、雙蒸水17.1 μL、模板1.0 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸 1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和純化后，送上海英濰捷基生物技術(shù)公司測序，并將序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行核酸序列Blast比對，選取同源性較高的序列用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬勝清、克菌康、辛菌胺醋酸鹽、金霉唑等藥劑對馬鈴薯軟腐病菌具有較好抑菌作用

平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，9種藥劑中對軟腐病菌Po-2的抑菌作用存在差異，其中萬勝清（20%溴菌腈·5%壬菌銅）800倍抑菌圈直徑最大、平均為24.50 mm，稀釋2 400倍后抑菌圈直徑仍有19.33 mm；克菌康（3%中生菌素）600倍的抑菌圈直徑5.92 mm，稀釋1 800倍后抑菌圈直徑為3.67 mm；1.2%辛菌胺醋酸鹽稀釋200倍和600倍，其抑菌圈直徑分別為7.58和3.58 mm；金霉唑（1.5%噻霉酮）稀釋600倍和1 800倍，其抑菌圈直徑分別為6.08和2.25 mm。然而，碧生（20%噻唑鋅）、龍克菌（20%噻菌銅）、興農(nóng)（33.5%喹啉銅）、可殺得叁仟（46%氫氧化銅）和銅高尚（27.12%堿式硫酸銅）等5種藥劑，在它們最小稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)對Po-2均沒有抑菌作用，抑菌圈直徑均為0.00 mm（表2）。4種藥劑最大稀釋度的抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，對馬鈴薯軟腐病菌的抑菌效果表現(xiàn)為萬勝清＞克菌康＞辛菌胺醋酸鹽＞金霉唑。

圖1 藥劑萬勝清在Po-2平板上產(chǎn)生的抑菌圈

表2 9種藥劑對馬鈴薯Pcb菌株P(guān)o-2的平板抑菌圈直徑

2.2 辛菌胺醋酸鹽和萬勝清混配對馬鈴薯軟腐病菌的抑菌效果

將抑菌效果較好的辛菌胺醋酸鹽和萬勝清兩種藥劑混配，平板上測定對馬鈴薯軟腐病菌Po-2的抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辛菌胺醋酸鹽和萬勝清混配后抑菌圈直徑為25.67 mm，而單獨(dú)辛菌胺醋酸鹽抑菌圈直徑為9.17 mm，單獨(dú)萬勝清抑菌圈直徑為26.42 mm，表明這兩種藥劑混配后并不能提高抑菌效果。

2.3 馬鈴薯軟腐細(xì)菌拮抗細(xì)菌的分離和拮抗效果測定

從不同植物根際土壤中共分離出150個細(xì)菌菌株，通過平板抑菌試驗(yàn)，得到5個細(xì)菌菌株對馬鈴薯軟腐細(xì)菌Po-2有抑菌作用，其抑菌圈直徑在2.75～3.83 mm之間（表3），其中拮抗菌RFjk2的抑菌作用最明顯（圖2）。

表3 5個拮抗細(xì)菌對軟腐病菌Po-2的平板抑菌圈大小

圖2 拮抗細(xì)菌RFjk2和RFjk3對馬鈴薯軟腐病菌Po-2的平板抑菌作用

2.4 5個拮抗細(xì)菌16S rDNA序列分析和初步鑒定

進(jìn)一步對這5個菌株進(jìn)行16S rDNA測序，采用細(xì)菌通用引物E8F/1541R PCR擴(kuò)增16S rDNA片段，其目的片段大小均為1.5 kp大小。擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，將獲得的序列在NCBI網(wǎng) 站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 進(jìn)行BLAST同源性檢索，計(jì)算所測定的5個菌株的16S rDNA全序列遺傳距離，對5個菌株經(jīng)MEGA4軟件統(tǒng)計(jì)，采用鄰接法（NJ法）分別構(gòu)建5個拮抗細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3～圖7）。

表4 5個拮抗細(xì)菌16S rDNA序列BLAST和初步鑒定結(jié)果

結(jié)果表明，拮抗菌RFjk1與菠蘿泛生菌Pantoea ananatis 菌株SGAir0210（基因編號：CP028033.1）的16S rDNA序列同源性為99%，初步鑒定為泛生菌屬（Pantoea）（圖3、表4）；拮抗菌RFjk2與粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens 菌株EG5（基因編號：KU321349.1）的16S rDNA序列同源性為100%，鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）（圖4、表4）；拮抗菌RFjk3與殺變形假單胞菌Pseudomonas plecoglossicida RD_MAAMIA_05（基因編號：KU597532.1）的16S rDNA序列同源性為99%，初步鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas）（圖5、表4）；拮抗菌RFjk4和RFjk5與松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuri（基因編號：LS483305.1和JX134627.1）的16S rDNA序列同源性為99%，初步鑒定為葡萄球菌屬（Staphylococcus）（圖6～圖7、表4）。

圖3 拮抗細(xì)菌RFjk1基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 拮抗細(xì)菌RFjk2基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 拮抗細(xì)菌RFjk3基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 拮抗細(xì)菌RFjk4基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 拮抗細(xì)菌RFjk5基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

迄今，國內(nèi)外防治作物細(xì)菌性病害的新型化學(xué)藥劑種類較少，且大多數(shù)以銅制劑為主［6］，然而，同一成分的殺細(xì)菌劑并非對所有植物病原細(xì)菌都有抑菌或殺菌作用。本研究通過室內(nèi)平板抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)市場上使用的9種殺細(xì)菌藥劑對馬鈴薯軟腐病菌Pcb的抑菌效果差異較大，其中萬勝清（20%溴菌腈·5%壬菌銅）、克菌康（3%中生菌素）、辛菌胺醋酸鹽、金霉唑（1.5%噻霉酮）等4種藥劑對Pcb菌株P(guān)o-2抑菌效果較好，而碧生（20%噻唑鋅）、龍克菌（20%噻菌銅）、興農(nóng)（33.5%喹啉銅）、可殺得叁仟（46%氫氧化銅）、銅高尚（27.12%堿式硫酸銅）等5種藥劑在其使用濃度范圍內(nèi)對Po-2均沒有抑菌作用。

噻霉酮主要用于防治真菌病害，未報(bào)道其對軟腐病細(xì)菌有作用，本研究發(fā)現(xiàn)，1.5%噻霉酮對馬鈴薯軟腐菌Pcb具有抑菌效果。辛菌胺醋酸鹽是一種廣譜性殺菌劑，對一些真菌、細(xì)菌及病毒病害均有一定的防治效果［7-9］，中生菌素和溴菌·壬菌銅較多地應(yīng)用于植物細(xì)菌病害防治［10-11］。由此，我們認(rèn)為，田間防治Pcb引起的作物細(xì)菌性軟腐病，可推薦使用萬勝清（20%溴菌腈·5%壬菌銅）、中生菌素、辛菌胺醋酸鹽和金霉唑（1.5%噻霉酮）等藥劑，萬勝清和辛菌胺醋酸鹽混配并不能提高抑菌效果，不建議在生產(chǎn)上混合使用，但可以輪換使用，還需要進(jìn)一步的田間試驗(yàn)。

噻唑鋅是新一代高效、低毒、安全的有機(jī)鋅殺菌劑，20%噻唑鋅對水稻黃單胞桿菌（Xanthomonas oryzae）、大白菜軟腐病菌（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovora）有較好的抑菌作用和病害防治效果［12-13］；噻菌銅可用于煙草野火病、柑桔潰瘍病、姜瘟病等細(xì)菌病害的防治［14-15］；喹啉銅則可用于防治黃瓜細(xì)菌性角斑病，且與烯酰嗎啉混和使用，效果更佳［16］；其他幾種銅制劑，如可殺得三仟、銅高尚等有報(bào)道用來防治水稻白葉枯病、水稻細(xì)菌性條斑病和稻曲病等［17-19］。然而，本研究卻發(fā)現(xiàn)，噻菌銅、喹啉銅、氫氧化銅和堿式硫酸銅等銅制劑，在它們的使用濃度范圍內(nèi)，均不表現(xiàn)對馬鈴薯軟腐細(xì)菌Pcb的平板抑菌和殺菌作用，原因可能由于這些銅制劑本身對Pcb作用效果差，也可能生產(chǎn)上大量使用這些銅制劑，病菌已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性，需要進(jìn)一步研究。

目前，針對由Pcb引起的細(xì)菌性軟腐病的生物防治研究極少，本研究從土壤中分離獲得5個對軟腐細(xì)菌Pcb具有抑菌效果的拮抗細(xì)菌，16S rDNA序列分析表明，它們分別與菠蘿泛生菌（Pantoea ananatis）、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）、變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）及松鼠葡萄 球 菌（Staphylococcus-sciuri） 的 16SrDNA序列相似性在99%以上。有研究表明，泛生菌屬Pantoea細(xì)菌對茄鏈格孢（Alternaria solani）、辣椒枝孢（Cladosporium capsici）、稻梨孢菌（Pyricularia oryzae）、甘薯長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata）、西瓜殼二孢（Ascochyta citrullina）等病原真菌有抑菌效果［20］，成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）對志賀氏菌（Shigella castellani）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（salmonella enteritidis）等病原細(xì)菌有抑制作用［21］。本研究分離得到的拮抗菌RFjk1初步鑒定為菠蘿泛生菌（Pantoea ananatis），該細(xì)菌可引起多肉葉片細(xì)菌性褐腐?。?2］，但鮮見有抑菌作用的報(bào)道；拮抗菌RFjk3、RFjk4和RFjk5初步鑒定為變形假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）和松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri），變形假單胞菌作為自然界的常見菌，對多種污染物有較強(qiáng)的分解能力，常被用于污水處理［23］，同時也引起大黃魚疾?。?4］；松鼠葡萄球菌廣泛分布于自然界，為條件性致病菌，可感染人及多種動物［25］，較少報(bào)道對植物病原細(xì)菌具有抑菌作用，這3個拮抗菌能否有效用于馬鈴薯軟腐病的生物防治，以及它們對環(huán)境的潛在風(fēng)險(xiǎn)性，需要進(jìn)一步研究。

有報(bào)道顯示，粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）對尖孢鐮刀菌引起的黃瓜枯萎病有防治效果［26］，從魔芋中分離的粘質(zhì)沙雷氏菌對魔芋軟腐病菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora和Pectobacterium chrysanthemi）有拮抗作用［27］，因此，粘質(zhì)沙雷氏菌用于植物病害生物防治具有較大潛力。本研究分離獲得的具有最大抑菌圈的拮抗細(xì)菌RFjk2屬于粘質(zhì)沙雷氏菌，這將為馬鈴薯軟腐病的生物防治應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。