孫 輝，程?hào)|美

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225）

放線菌是一類能產(chǎn)生重要活性代謝產(chǎn)物以及具有巨大商業(yè)價(jià)值的微生物類群。約有70%的抗生素類物質(zhì)來源于放線菌，主要用于醫(yī)藥以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［1-2］。放線菌多數(shù)為革蘭氏陽性細(xì)菌，菌落呈放射狀，能產(chǎn)生絲狀菌絲體［3］，已記錄的屬超過140個(gè)，產(chǎn)生超過20 000種重要的代謝產(chǎn)物，鏈霉菌屬產(chǎn)物則囊括了其中的80%［4］。

放線菌在自然界中分布廣泛，能產(chǎn)生各種大量的代謝產(chǎn)物，尤其定殖在植物根圍土壤中的菌群，能有效地抑制植物病原菌的活性［5］。在農(nóng)業(yè)生物防治應(yīng)用中，放線菌及其代謝產(chǎn)物均能有效抑制危害農(nóng)作物的真菌、細(xì)菌、病毒和線蟲等植物病害。史冊(cè)等［6］研究了分離自人參根際的4株放線菌，對(duì)人參常見病原真菌的抑菌效果明顯，對(duì)毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和人參核盤菌（Sclerotinia ginseng）的抑制率都達(dá)到90%以上。Karkouri等［7］分離到一株放線菌Streptomyces cinereoruber，經(jīng)研究證實(shí)該菌株發(fā)酵濾液對(duì)Erwinia chrysanthemi具有較好的抑菌活性。Yeo［8］研究了放線菌B25菌株產(chǎn)生的抗毒物質(zhì)ASA，能被植物內(nèi)吸并在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)移，對(duì)TMV、CMV等有抑制作用。魏華等［9］從海南東寨港紅樹林的土壤樣品中分離到具有殺線蟲活性的放線菌Saccharopolyspora jiangxiensis，菌株發(fā)酵液稀釋20倍后，抗根結(jié)線蟲校正死亡率高達(dá)70.5%。

本研究土壤樣本采自于深圳市赤坳水庫(kù)原生態(tài)樹林芒萁根部，從中分離得到放線菌菌株A50，對(duì)該菌株的形態(tài)特性、培養(yǎng)特征、生理生化特征、16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育等方面進(jìn)行研究分析，確定其分類地位，并初步測(cè)定其對(duì)部分植物病原菌的抑菌活性。本研究旨在發(fā)現(xiàn)土壤中新的生防放線菌資源，為豐富植物病害生物農(nóng)藥種類提供實(shí)踐材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土樣于2015年6月采自深圳市龍崗區(qū)赤坳水庫(kù)生態(tài)保護(hù)林地，采用五點(diǎn)取樣，鏟去表層土，采土深度為10～20 cm。

供試病原真菌菌株：玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、花生白絹病菌（Sclerotium rolfsii）、 柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosprioides）、花生黑腐病菌（Cylindrocladium parasiticum），均由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 放線菌的分離純化 土樣在室溫下自然干燥20 d，過0.425 mm篩。采用稀釋平板法［10］在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上涂布分離，挑取單菌落，經(jīng)多次純化后斜面保存于4℃。

1.2.2 放線菌A50的鑒定 形態(tài)特征采用插片法［11］，并結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［12］和《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》［13］。

生理生化特征測(cè)試：分別對(duì)菌株的碳源利用、纖維素水解、淀粉水解、明膠液化、牛奶凝固和胨化等方面進(jìn)行生理生化測(cè)試［14］。

16S rDNA 測(cè)定：用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取A50的基因組DNA。用細(xì)菌16S rDNA通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2 × Taq PCR MasterMix 12.5 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，模板DNA 1 μL，加滅菌dd H2O補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃變性4 min；94℃變性45 s，55℃復(fù)性60 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至華大基因公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用NCBI的Blast進(jìn)行同源性檢索，從GenBank中檢索同源性高的菌株用于系統(tǒng)發(fā)育分析，序列分析采用Mega 5.0軟件，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和同源性比較。

1.2.3 拮抗放線菌的皿內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn) 采用平板對(duì)峙法對(duì)放線菌的抑菌譜進(jìn)行皿內(nèi)測(cè)定。將供試病原真菌接種在PDA培養(yǎng)基平板上擴(kuò)大培養(yǎng)備用。用接種環(huán)挑取放線菌，點(diǎn)接種于PDA培養(yǎng)基中心點(diǎn)，距中心點(diǎn)3 cm，呈等邊三角形頂點(diǎn)放置植物病原菌菌餅，有菌絲的一面朝下。置28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后觀察結(jié)果。

1.2.4 放線菌A50的液體培養(yǎng) 將放線菌菌株A50接種到高氏1號(hào)固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)5 d。每瓶高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基接種2環(huán)放線菌A50，28℃、160 r/min下培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液于8 000 r/min離心20 min，取上清液備用。

1.2.5 放線菌A50發(fā)酵液對(duì)花生白絹病菌核的抑菌活性測(cè)定 取液體發(fā)酵放線菌A50離心后上清液，無菌條件下配制成原液、2倍、5倍、10倍、20倍5個(gè)濃度梯度。分別吸取1 mL上述梯度溶液加入滅菌Eppendorf管，每管加入20個(gè)菌核。28℃條件下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h取樣，取出菌核置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，以清水為對(duì)照。28℃條件下分別培養(yǎng)5 d，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算放線菌A50不同濃度發(fā)酵液對(duì)花生白絹病菌菌核的抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 A50菌株形態(tài)特征觀察

A50菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。氣生菌絲灰白色，較發(fā)達(dá)，有分枝，孢子絲柔曲或松螺旋，孢子長(zhǎng)橢圓形，表面光滑，能分泌液滴。基內(nèi)菌絲少分枝、無橫隔。菌落圓形，干燥，呈灰黃色（圖1）。

圖1 A50菌株孢子形態(tài)和菌落特征

2.2 生理生化特征測(cè)定

對(duì)A50菌株進(jìn)行生理生化特性測(cè)定，A50菌株可利用葡萄糖、木糖、肌醇、甘露醇、和果糖作為碳源，可使明膠液化，水解淀粉，牛奶凝固和胨化，能分解纖維素，能還原硝酸鹽，不產(chǎn)生硫化氫。

2.3 放線菌A50的16S rDNA 擴(kuò)增

用DNA 提取試劑盒提取A50菌株基因組DNA，適度調(diào)整蛋白酶K加入量，成功提取到DNA，圖2顯示提取的DNA 質(zhì)量較好，可以直接用于PCR 擴(kuò)增。用細(xì)菌的通用引物27F/1492R進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖2B，其目標(biāo)片段大小約為1 500 bp。

圖2 A50菌株 16S rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果

2.4 16S rDNA分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

以A50菌株全基因組DNA為模板，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，測(cè)序得到1364 bp DNA序列。將擴(kuò)增產(chǎn)物序列在GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明，與A50菌株相似性較高的均為鏈霉菌屬成員，同源性均達(dá)到99%以上。利用Mega5 軟件對(duì)A50菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并用鄰接法（Neighbour-Joining，NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），A50菌株與Streptomyceyes nodosus EU273535位于同一分支，但自展支持率只有65%。結(jié)合菌株的培養(yǎng)特征以及生理生化特征，將其鑒定為結(jié)節(jié)鏈霉菌（Streptomyceyes nodosus）。

圖3 基于16S rDNA的放線菌A50的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 放線菌A50對(duì)靶標(biāo)植物病原真菌的皿內(nèi)抑菌活性

A50菌株對(duì)供試的5株靶標(biāo)植物病原真菌的皿內(nèi)抑菌活性如圖4所示。A50菌株在皿內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)，對(duì)玉米小斑病菌（B. maydis）、柑橘炭疽病菌（C. gloeosprioides）、花生黑腐病菌（C.parasiticum）表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，對(duì)峙邊緣都出現(xiàn)了明顯的抑菌帶，其中與玉米小斑病菌之間的抑菌帶寬度最大，達(dá)到1.5 cm，對(duì)花生白絹病菌（S. rolfsii）則幾乎沒有抑制作用。

圖4 A50菌株對(duì)植物病原菌的抑制作用

2.6 A50發(fā)酵液對(duì)花生白絹病菌核的抑菌作用

用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定A50發(fā)酵液對(duì)花生白絹病菌的抑制活性，結(jié)果（圖5）表明，放線菌A50發(fā)酵液濃度越高，花生白絹病菌核菌絲擴(kuò)展受到的抑制作用越大，菌落小，且菌絲稀疏。反之，A50發(fā)酵液濃度越低，抑制作用越小，則菌落大，且菌絲延伸長(zhǎng)、也越濃密。隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，各濃度處理抑制率都呈升高趨勢(shì)。

圖5 A50發(fā)酵液對(duì)花生白絹病菌核的抑制作用

3 結(jié)論與討論

放線菌是重要的生物活性物質(zhì)產(chǎn)生者。由于種種原因，人們只分離到土壤中大約10%～20%的放線菌［15］。土壤是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要基質(zhì)，且大多數(shù)放線菌均來自土壤。放線菌對(duì)于植物根部土壤的生態(tài)平衡起著重要作用，并確保植物健康生長(zhǎng)。應(yīng)用放線菌這種天然生防菌劑，可有效減少對(duì)化學(xué)藥劑的使用，符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展的要求以及人們對(duì)健康、無公害農(nóng)產(chǎn)品的需求［16］。因此，從土壤中分離放線菌對(duì)于植物病害的防治具有重要的生態(tài)意義。

本研究從芒箕根部土壤中分離到一株對(duì)植物病原菌有顯著拮抗作用的放線菌菌株A50，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定及16S rDNA序列分析，結(jié)合上述各方面要素初步確定放線菌A50為鏈霉菌屬的結(jié)節(jié)鏈霉菌（Streptomyceyes nodosus）。將放線菌A50序列與相近序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹未有直接得到很高的自展支持率，因此，借助于形態(tài)學(xué)特征以及生理生化測(cè)定對(duì)于菌種的鑒定也具有重要的支撐作用［17］。

對(duì)5種植物病原菌進(jìn)行皿內(nèi)抑菌測(cè)定，放線菌A50對(duì)花生黑腐病菌、柑橘炭疽病菌、玉米小斑病菌均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用，其中，對(duì)玉米小斑病菌的抑菌帶寬度達(dá)到了1.5 cm，對(duì)花生白絹病菌則沒有抑制現(xiàn)象。但是，采用A50發(fā)酵液測(cè)定其對(duì)花生白絹病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，尤其是發(fā)酵原液，抑制率達(dá)到60%以上，表明放線菌A50能分泌對(duì)白絹病菌的抑菌物質(zhì)，但抑菌成分尚未可知，其在不同狀態(tài)的基質(zhì)中分泌產(chǎn)生的差異性還有待于進(jìn)一步研究。因此，在放線菌菌株的進(jìn)一步應(yīng)用研究過程中，應(yīng)通過不同的培養(yǎng)、測(cè)試方法，盡可能深度發(fā)掘菌株的生防潛力［18-19］。同時(shí)，還應(yīng)盡量擴(kuò)大生防菌的抑菌譜，如除了真菌病害以外的細(xì)菌病害等［20］，對(duì)生防菌株進(jìn)行全面評(píng)估，對(duì)其應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行科學(xué)論證。