黃 元，劉 濤，陳錦良，王曉虎，陳 晶，梁培新，黃 武，向 華

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510640；2.廣東源豐農(nóng)業(yè)有限公司，廣東 陽江 529938；3.廣東宏豐農(nóng)牧有限公司，廣東 英德 513036 ）

塞內(nèi)卡病毒病是由小核糖核酸病毒科塞內(nèi)卡病毒屬的塞內(nèi)卡病毒A（Seneca virus A,SVA）引起的一種主要感染豬的病毒性傳染病。病毒直徑約為25～30 nm，正二十面體結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)為單股正鏈非分段RNA［1］。該病毒可引起豬產(chǎn)生類似水皰樣病變，感染豬的鼻吻、蹄冠等部位［2］，臨床上出現(xiàn)鼻孔囊泡破裂和侵蝕，蹄冠狀動(dòng)脈帶囊泡破裂后會(huì)導(dǎo)致豬只跛行［3］。美國(guó)、巴西等地的臨床研究表明，1周齡仔豬感染SVA后，臨床表現(xiàn)為肥胖、肌無力、食欲不振、嗜睡、唾液分泌過多、皮膚充血、腹瀉，并且有神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，有些仔豬會(huì)突然死亡。臨床癥狀一般持續(xù)3～10 d，然后在存活的仔豬中消失。對(duì)仔豬進(jìn)行常規(guī)剖檢，表現(xiàn)為腎臟淤點(diǎn)出血，舌頭出現(xiàn)潰瘍性損傷［4］。該病本身死亡率不高，但易造成繼發(fā)感染，可致仔豬死亡率高達(dá)30%～70%［5］。由于與口蹄疫等水皰性疾病難以區(qū)分，容易造成恐慌。

塞內(nèi)卡病毒最初引起人們的注意是在胎牛血清或胰酶污染的細(xì)胞培養(yǎng)液中［6］。2008年SVA在美國(guó)的豬群中發(fā)現(xiàn)，繼而席卷美國(guó)、加拿大、巴西、澳大利亞、新西蘭、泰國(guó)、哥倫比亞等國(guó)家［7］，在世界范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注。2015年我國(guó)廣東首次發(fā)現(xiàn)SVA，目前SVA已在我國(guó)多個(gè)省市暴發(fā)［8-10］。但我國(guó)對(duì)SVA的臨床報(bào)道仍然很少，對(duì)其發(fā)病豬群的抗體水平也未見檢測(cè)分析數(shù)據(jù)。

2017年4月，廣東省陽江地區(qū)某豬場(chǎng)發(fā)生疑似塞內(nèi)卡病毒感染癥狀。為進(jìn)一步了解SVA為防控積累數(shù)據(jù)，本研究對(duì)該豬場(chǎng)采集的患病組織和血清進(jìn)行病毒分離，建立了微量血清抗體中和試驗(yàn)方法，并進(jìn)行了抗原和抗體檢測(cè)分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的疑似SVA發(fā)病豬蹄部水泡皮和16份豬血清均來自廣東省陽江地區(qū)某豬場(chǎng)。

主要試劑：TakaRa ExTaq DNA聚合酶、pMD19-T質(zhì)粒和DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；病毒RNA/DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒，購(gòu)自美基生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RT-PCR檢測(cè) 水泡皮研磨后離心10 min（12 000 r/min，4℃）， 取 上 清， 用病毒RNA/DNA提取試劑盒提取病毒總核酸進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。引物按照文獻(xiàn)［11］合成，針對(duì)VP1-2A基因，上游引物序列為5’-TCGGTTTACTCCGCTGATGGTTGG-3’；下游引物序列為5’-AGGACCAGGATTGGTCTCGATATC-3’。RT-PCR反應(yīng)條件：42℃ 30 min；94℃ 5 min；94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1.5 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.2 基因克隆和序列測(cè)定 PCR產(chǎn)物電泳后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收980 bp左右的片段，連接至pMD19-T載體，用質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒提取質(zhì)粒，由華大基因公司測(cè)序。對(duì)核苷酸序列進(jìn)行BLAST在線分析，并用MEGA6軟件與GenBank上下載的參考毒株進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.2.3 病毒分離及滴度測(cè)定 水泡皮研磨后離心10 min（12 000 r/min，4℃），上清液用0.22 μm濾器過濾后接種至PK-15細(xì)胞，培養(yǎng)5 d后若無病變產(chǎn)生則凍融3次再次接種細(xì)胞，產(chǎn)生病變后的培養(yǎng)產(chǎn)物在PK-15細(xì)胞上進(jìn)行病毒傳代，培養(yǎng)產(chǎn)物10倍梯度稀釋后接種96孔板，測(cè)定對(duì)PK-15細(xì)胞的TCID50［7］，72 h后觀察病變，以K?rber法計(jì)算結(jié)果。

1.2.4 微量血清抗體中和試驗(yàn) 按照文獻(xiàn)［12］的方法進(jìn)行微量血清抗體中和試驗(yàn)。將待測(cè)血清于56℃下水浴1 h，以除去血清中的補(bǔ)體及其他干擾物質(zhì)。處理后的待測(cè)血清用含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液進(jìn)行2倍梯度稀釋，然后在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加50 μL；病毒液稀釋至100 TCID50/50μL，每孔加入50 μL，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中放置1 h后加入PK-15細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)立病毒回歸對(duì)照；置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR結(jié)果

從病料提取核酸進(jìn)行RT-PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果觀察到接近1 000 bp的單一條帶（圖1）。將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，其測(cè)序結(jié)果表明，獲得長(zhǎng)度為980 bp的VP1-2A序列。

圖1 SVA VP1-2A的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 VP1-2A核苷酸序列分析

對(duì)本研究獲得的毒株命名為CHGDYJ-2017，將所克隆的VP1-2A基因序列與GenBank上的SVA同區(qū)段序列進(jìn)行比對(duì)分析，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。與 CH-GDYJ-2017同源性最高的是2015年美國(guó)毒株USA/GBI29/2015（KT827251），同源性為99.2%；同源性最遠(yuǎn)的是2008年美國(guó)毒株SVV-001（DQ641257），同源性為91.3%，表明結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1附近仍舊是變異較快的區(qū)域，但并未顯現(xiàn)明顯的時(shí)間或地域相關(guān)的變異特征。

在我國(guó)流行毒株中，與本研究獲得的毒株CH-GDYJ-2017關(guān)系最近的是CH-HN-2017（97.1%），最遠(yuǎn)的是CH-01-2015（92.2%），表明我國(guó)的SVA病毒已經(jīng)在多地流行并且呈現(xiàn)一定的變異趨勢(shì)。

圖2 SVA VP1-2A核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 病毒分離及滴度測(cè)定結(jié)果

將水泡皮處理產(chǎn)物接種PK-15細(xì)胞后，盲傳4代后產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變。在PK-15細(xì)胞上傳代4次后測(cè)定病毒滴度，滴度可達(dá)107TCID50/0.1mL。

2.4 抗體中和試驗(yàn)結(jié)果

從采集的16份血清樣本數(shù)據(jù)來看，無論豬只發(fā)病與否，均有中和抗體出現(xiàn)（表1），說明均有過感染。9頭種豬全部感染SVA，其中6頭發(fā)病，發(fā)病率為66.7%。按抗體效價(jià)大于等于1∶64為陽性計(jì)算［13］，受檢的16份樣品中有11份陽性，總感染率為68.8% 。6頭發(fā)病種豬的中和抗體效價(jià)非常高，3頭臨床未發(fā)病的種豬的抗體效價(jià)也都達(dá)到了1∶1 024以上，最高達(dá)1∶4 096。

表1 抗體中和試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

塞內(nèi)卡病毒（SVA）作為一種新的外來病原，已經(jīng)在我國(guó)部分地區(qū)流行，未來幾年可能會(huì)繼續(xù)呈現(xiàn)蔓延的趨勢(shì)，由于當(dāng)前市場(chǎng)尚無SVA疫苗出售，隨著傳播范圍的擴(kuò)大，必將造成更大的經(jīng)濟(jì)損失［14］。雖然其危害沒有口蹄疫那樣嚴(yán)重，但是由于其臨床癥狀與口蹄疫極其類似，因此，為了鑒別和區(qū)分，避免不必要的恐慌，做好疫病的預(yù)防和監(jiān)控迫在眉睫。相關(guān)部門應(yīng)及時(shí)關(guān)注國(guó)內(nèi)外疫情相關(guān)動(dòng)態(tài)，掌握塞內(nèi)卡病毒的流行趨勢(shì)及其帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，確保第一時(shí)間對(duì)SVA進(jìn)行合理的應(yīng)對(duì)和處置。

本次抽檢的16份血清樣本全部來自廣東陽江某豬場(chǎng)。從中和試驗(yàn)的結(jié)果來看，抗體陽性率為68.8%（≥1∶64）。其中種豬抗體陽性率為100%，抗體效價(jià)均達(dá)到1∶1 024以上，未發(fā)病豬抗體陽性率為50%。說明SVA的免疫原性很強(qiáng)，能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生很高的抗體水平。發(fā)病豬中和抗體效價(jià)非常高，與FMD臨床發(fā)病相比，SVA臨床發(fā)病豬康復(fù)快，與臨床實(shí)際相一致。這次豬場(chǎng)發(fā)病均為種豬，未見哺乳仔豬、保育豬、肥豬發(fā)病。這與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的仔豬死亡率高不一致［4-5］。因此我們檢測(cè)了除母豬以外的其他階段豬的中和效價(jià)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)階段豬均有感染，只是未見臨床表現(xiàn)，后續(xù)將進(jìn)一步加強(qiáng)臨床觀察和深入研究其具體原因。

本研究從廣東陽江地區(qū)某豬場(chǎng)的疑似病料中檢出SVA并進(jìn)行分離，建立了微量血清抗體中和試驗(yàn)方法，為SVA的流行病學(xué)研究提供了工具［15］。對(duì)同為小核糖核酸病毒科的口蹄疫病毒（FMDV）的研究表明，F(xiàn)MDV的抗原具有高度變異性［16-17］，病毒核衣殼的變異順序?yàn)閂P1＞VP2＞VP3＞VP4，由于VP1基因的核苷酸易發(fā)生變異，因此，在分子流行病學(xué)調(diào)查中可通過比較分析VP1基因的核苷酸序列之間的差異來分析各毒株之間的變異情況，為研究不同毒株的親緣關(guān)系奠定基礎(chǔ)［17］。SVA與FMDV同屬小核糖核酸病毒科，在核苷酸序列分析上可以采用同樣的方法［18］。對(duì)VP1基因測(cè)序比對(duì)的結(jié)果表明，分離株與美國(guó)2015年毒株USA/GBI29/2015同源性較高（99.2%），而與我國(guó)毒株同源性最高僅為97.1%（2017年毒株CH-HN-2017）。從系統(tǒng)進(jìn)化樹來看，目前我國(guó)流行毒株已經(jīng)產(chǎn)生多個(gè)分支。這表明SVA可能先后多次傳入我國(guó)［19］。此外，廣東株（CH-01-2015）和湖北株（HB-CH-2016）序列比對(duì)同源性為100%，說明這兩個(gè)地區(qū)之間毒株傳播迅速，短期內(nèi)就已經(jīng)跨越多個(gè)省份，需要更加密切關(guān)注SVA在我國(guó)其他省份的流行情況［20］。我國(guó)對(duì)外來疫病的防控制度和應(yīng)對(duì)措施還需要進(jìn)一步完善［15］。本研究選取不同國(guó)家和我國(guó)不同地區(qū)不同時(shí)間段具有代表性的毒株，對(duì)部分序列遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，如需獲得更加準(zhǔn)確的遺傳進(jìn)化關(guān)系，可對(duì)各流行毒株的全基因組序列進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析。