劉加 梁官釗 劉維達

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所 中國醫(yī)學真菌菌種保藏管理中心,南京 210042)

皮膚癬菌是臨床最常見的病原真菌，包括表皮癬菌屬、小孢子菌屬及毛癬菌屬，因其具有嗜角蛋白的特性，可引起人類頭發(fā)、光滑皮膚及指趾甲的感染，全球發(fā)病率約為20%～25%[1]。盡管皮膚癬菌病不少見，但一方面因為皮膚癬菌多感染皮膚角質(zhì)層及甲，部分人僅因為美觀而非醫(yī)療問題就診；另一方面則因為皮膚癬菌對常用抗真菌藥敏感，耐藥少見，因此目前有關(guān)皮膚癬菌的研究甚少[2]。表皮癬菌屬中則只有絮狀表皮癬菌引起人類致病，多感染皮膚及指趾甲，頭發(fā)感染甚為少見，說明絮狀表皮癬菌與紅色毛癬菌、犬小孢子菌等具有不同的特征，但是目前相關(guān)研究少見。因經(jīng)濟條件的改善，衛(wèi)生設(shè)施的完善，絮狀表皮癬菌的流行分布、易感人群等特征較前已發(fā)生了變化。隨著基因組學的研究，以前未被發(fā)現(xiàn)的基因缺陷或者突變與宿主易感性也有重要的相關(guān)性。因此有關(guān)絮狀表皮癬菌的基礎(chǔ)和臨床研究已發(fā)生了較大的變化。

1 基礎(chǔ)研究

1.1 分子生物學研究

對皮膚癬菌的鑒別和分析，傳統(tǒng)的方法是基于菌落的形態(tài)學特征，絮狀表皮癬菌的培養(yǎng)可在17 d內(nèi)完成[3]。為了縮短檢驗的時間，提高檢驗的準確性，基于核苷酸序列的方法已用來鑒別皮膚癬菌[4,5]。劉昕等[6]對任意聚合酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)、巢式PCR、多引物聚合酶鏈式反應(yīng)等鑒別皮膚癬菌的方法已進行系統(tǒng)綜述，本文著重論述有關(guān)絮狀表皮癬菌近幾年來分子生物學鑒別的研究進展。

自Makimura等[7]于1999年提出用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)來鑒別皮膚癬菌以來，這種方法目前已被許多實驗室所采用。但近年研究者提出ITS序列不能將部分在生態(tài)學及流行病學上有差異的菌區(qū)別開來，如須癬毛癬菌與趾間毛癬菌[8]，越來越多的研究者傾向依據(jù)ITS序列、菌株的形態(tài)學和生理學特性、親人或動物等特性來綜合判斷[9]。Normand等[10]對292株臨床來源的皮膚癬菌進行ITS2序列擴增，將所得序列與5大DNA數(shù)據(jù)庫(NCBI、CBS、ISHAM、FunBold、UNITE)進行比對，發(fā)現(xiàn)幾大數(shù)據(jù)庫之間存在不一致的情況，比對結(jié)果差異性多存在于毛癬菌屬，而表皮癬菌屬和小孢子菌屬比對一致性較高。也有研究者利用其他DNA標記如D1/D2、延長因子(TEF1)、β-tubulin(BT2)等來鑒別包括絮狀表皮在內(nèi)的皮膚癬菌，研究者們多認為單個基因不足以完全界定各菌種間的關(guān)系，需要綜合多因素考慮[11]。

實時PCR(RT-PCR)方法具有污染風險小、不需后續(xù)處理等優(yōu)點，Sherman[12]等設(shè)計了針對絮狀表皮癬菌、犬小孢子菌、須癬毛癬菌、石膏樣小孢子菌的引物和探針，提取臨床樣本如皮屑、甲屑、頭發(fā)的真菌DNA后在同一體系中進行多重RT-PCR試驗，并將結(jié)果與傳統(tǒng)如鏡檢、培養(yǎng)等方法進行比較。發(fā)現(xiàn)多重RT-PCR比傳統(tǒng)方法的檢出率明顯提高，反應(yīng)可在4h內(nèi)結(jié)束，一次實驗便可以完成對44種臨床樣本的鑒定。Motamedi等[13]通過兩種方法對比發(fā)現(xiàn)RT-PCR對皮膚來源樣本的準確率要高于來源于甲的樣本，存在一定的假陽性率和假陰性率，故認為RT-PCR方法在臨床上尚不能完全取代傳統(tǒng)的檢驗方法。

Ahmadi等[14]通過對鈣調(diào)基因進行分析，發(fā)現(xiàn)絮狀表皮癬菌和親土的庫克小孢子菌組成同一類群(自展值為100%)，說明了絮狀表皮癬菌和小孢子菌屬有密切的聯(lián)系。Garcia等[15]通過擴增皮膚癬菌PRP8蛋白內(nèi)含子序列成功地將絮狀表皮癬菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌、犬小孢子菌、阿耶洛毛癬菌、奧杜盎小孢子菌等鑒別。同時通過對歸巢內(nèi)切酶(HE)區(qū)域及dS/dN比值的分析證實了絮狀表皮癬菌和石膏樣小孢子菌為同一個起源的可能性。

表面增強拉曼光譜(SERS)是一種高靈敏度和特異性的光譜學方法。目前已有研究者將此法應(yīng)用于曲霉和酵母菌的研究[16]，Witkowska等[17]采用表面增強拉曼光譜聯(lián)合主成分分析(SERS-PCA)的方法實現(xiàn)了對絮狀表皮癬菌、犬小孢子菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌等皮膚癬菌的鑒別，總體準確率為98%。與MOLDI-TOF相比，SERS具有價格便宜，不受培養(yǎng)條件影響等優(yōu)點，在臨床上可能具有更大的應(yīng)用前景。

1.2 致病機制

皮膚癬菌最重要的特征為產(chǎn)生蛋白酶分解角蛋白，其感染過程包括黏附、出芽、產(chǎn)生菌絲、侵襲等階段。研究表明絮狀表皮癬菌與紅色毛癬菌等在頭發(fā)作為誘導(dǎo)物的時候，絮狀表皮癬菌分泌的蛋白酶活性要低于紅色毛癬菌等引起毛發(fā)感染的皮膚癬菌，解釋了為什么絮狀表皮癬菌不引起頭發(fā)感染的部分原因[18]。在底物不同的時候，皮膚癬菌也能產(chǎn)生磷脂酶磷脂酶、白明膠酶和彈性蛋白酶，這些都被證實與其致病性相關(guān)[19]。

由于缺乏可靠的皮膚癬菌感染模型，其具體致病機制到目前尚未研究透徹。固有免疫在皮膚癬菌感染中的作用已被證實，近年來研究者們主要探討適應(yīng)性免疫在真菌感染中的作用。細胞介導(dǎo)的免疫在臨床痊愈和預(yù)防再感染均有重要作用，其中CD4+T淋巴細胞被認為是機體抵抗皮膚癬菌感染的最重要成分[20]。Heinen等[21]通過動物實驗證實TCR介導(dǎo)的免疫是控制皮膚癬菌感染的關(guān)鍵。Th1和Th17在適應(yīng)性免疫中起到了重要的作用，Th17主要作用為清除病原真菌，Th1在病原菌清除和下調(diào)Th17誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中均起作用。Heinen等[20]認為Th17信號通路的激活和IL-17的合成也有可能是機體固有免疫的一部分。

雖然皮膚癬菌多引起淺表感染，但能夠引發(fā)宿主復(fù)雜的免疫反應(yīng)，炎癥因子在致病過程中也起到了重要的作用，且其種類及量不同影響了患者的臨床表現(xiàn)。體內(nèi)外實驗證實親人性皮膚癬菌如絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌等主要誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞分泌IL-6、IL-8、IL-1β等細胞因子，引起的炎癥反應(yīng)相對較輕。而親動物性皮膚癬菌如犬小孢子菌等除了誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞分泌上述細胞因子外，還能刺激IL-10、IL-2、IL-15、TGF-β等的產(chǎn)生，引起強烈的炎癥反應(yīng)[22]。

基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)在炎癥介質(zhì)的刺激下產(chǎn)生，在組織的修復(fù)中具有重要作用，Warner等[23]認為MMP-9可以作為急性炎癥的一個分子標記。Kitisin等[24]研究了絮狀表皮癬菌在感染人包皮成纖維細胞時，發(fā)現(xiàn)在MMP-9抑制劑SB-3CT存在的條件下MMP-9的分泌有所減少，包皮成纖維細胞的活性相應(yīng)地有所改善，因此在一定程度上減少MMP-9的分泌可以保護組織細胞免受絮狀表皮癬菌的感染。

對于人類而言，表皮屏障受損如皮膚劃傷、甲改變、青春期皮脂腺未完全發(fā)育等，以及環(huán)境濕度的增加均是皮膚癬菌容易感染的因素[25]。糖尿病患者皮膚癬菌感染率為正常人感染的3倍，尤其以足癬和甲癬多見[9]。

1.3 基因組學研究

線粒體DNA在每個細胞內(nèi)均有大量的拷貝，具有保守區(qū)和可變區(qū)，可以作為分子標記來以利于研究種群的結(jié)構(gòu)及其多樣性[26]。如前所述利用單個基因來進行系統(tǒng)進化分析容易出現(xiàn)差錯，而線粒體基因組則可以避免這種偏移。Tambor等[26]報道了絮狀表皮癬菌線粒體基因組序列(30.9kb)，并與紅色毛癬菌、構(gòu)巢曲霉、馬爾尼菲籃狀菌的線粒體基因組進行比對，發(fā)現(xiàn)絮狀表皮癬菌和紅色毛癬菌具有高度的相似性，所得結(jié)論與系統(tǒng)進化發(fā)育具有一致性。Wu等[27]進一步對絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌等皮膚癬菌的線粒體基因組進行比較分析，發(fā)現(xiàn)6種菌的線粒體基因組具有相同的排列順序，通過系統(tǒng)進化發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)皮膚癬菌的分化要晚于其他致病真菌，并進一步證明了皮膚癬菌內(nèi)部在進化上具有緊密聯(lián)系，但是線粒體基因組分析未能說明絮狀表皮癬菌和其他皮膚癬菌在進化上的相互關(guān)系。

自20世紀90年代以來，越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)皮膚癬菌感染具有一定的宿主遺傳易感性[28]。Ferwerda等[29]發(fā)現(xiàn)患者CLEC7A基因的突變，能夠影響與真菌β-葡聚糖結(jié)合的Dectin-1蛋白的生成，從而影響宿主對病原真菌的識別過程。Jaradat等[30]發(fā)現(xiàn)編碼抗微生物肽β防御素-2的DEFB4基因拷貝數(shù)下降的時候，宿主對皮膚癬菌的敏感性增加；且皮膚癬菌病患者基因組中DEFB4拷貝數(shù)要顯著低于健康對照組，血清hBD-2、IL-22水平要高于對照組，表明基因和細胞因子的相互作用在皮膚癬菌的感染中也起到了一定的作用。

宿主抗真菌免疫應(yīng)答通路的突變?nèi)鏑ARD9、STAT3等已有報道[31]。Vaezi等[32]總結(jié)了既往報道的由CARD9缺陷導(dǎo)致的真菌感染病例，對發(fā)病率、地域分布及突變類型進行分析，亞洲因人口眾多，CARD9突變率要高于非洲及其他國家，CARD9突變類型可能也具有一定的地域性，所有60例突變患者中，皮膚癬菌感染者占37.3%，尚未見絮狀表皮癬菌感染的報道。

2 臨床研究

2.1 流行現(xiàn)狀

皮膚癬菌病近年來有上升趨勢，其發(fā)病率與氣候、經(jīng)濟條件及性別年齡等均有很大的關(guān)系。Zhan等[1]報道近100年以來，皮膚癬菌的分布也發(fā)生了較大的變化，絮狀表皮癬菌、許蘭毛癬菌、奧杜盎氏小孢子菌、鐵銹色小孢子菌發(fā)病率有所下降，目前多見于發(fā)展中國家。Zamani等[33]對伊朗德黑蘭某真菌科2010至2014年間皮膚癬菌感染患者進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明絮狀表皮癬菌發(fā)病率位列第一(31%)，紅色毛癬菌(26.2%)和須癬毛癬菌(20.3%)次之。Nweze等[34]和Coulibaly等[35]對非洲皮膚癬菌病進行系統(tǒng)回顧，其發(fā)病率可高達95%，致病菌的分布有地域和感染部位的差異，總體而言絮狀表皮癬菌在體癬中發(fā)病率最高達16%，而在甲癬中的發(fā)病率最高為9%。而在相對發(fā)達的希臘克里特島和巴西，Didehdar等[36]和Heidrich等[37]報道絮狀表皮癬菌的發(fā)病率分別為2.5%和1.5%，次于紅色毛癬菌、須癬毛癬菌和犬小孢子菌的發(fā)病率。說明絮狀表皮癬菌的感染與經(jīng)濟條件、衛(wèi)生狀況等關(guān)系密切。

2.2 治 療

目前唑類和特比萘芬為治療嚴重皮膚癬菌感染的常用藥物。Badali等[38]對臨床分離的57株毛癬菌和11株絮狀表皮癬菌進行體外藥敏試驗，藥物主要包括兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、艾沙康唑、特比萘芬、阿尼芬凈、卡泊芬凈。結(jié)果表明對于絮狀表皮癬菌，特比萘芬的MIC值最低(0.03mg/L)，除伏立康唑外，其余的藥均有一定的抗菌作用。傳統(tǒng)抗真菌藥作用靶點有限，雖然皮膚癬菌耐藥少見，但是隨著真菌的代償性應(yīng)激反應(yīng)，參與藥物外排、細胞解毒的基因過表達、編碼靶酶的基因突變等均可能引起藥物耐受[39]。現(xiàn)已有研究作用于新的靶點的抗真菌藥，如抑制乙醛酸循環(huán)、嘧啶合成、細胞色素P450途徑、鐵代謝等代謝通路，以及在表觀遺傳學水平抑制轉(zhuǎn)錄因子等[40]，但這些藥物試驗主要集中于隱球菌、曲霉、念珠菌等能引起系統(tǒng)感染的菌種，有關(guān)皮膚癬菌的臨床試驗較少。

VT-1161為一種新型的細胞色素P450依賴酶-14α-羊毛脂醇脫甲基酶(cyp51)抑制劑，當藥物濃度<1 nmol/L時能夠選擇性作用于真菌的CYP51[41]。Garvey等[42]報道了VT-1161體外抗皮膚癬菌活性，其中在絮狀表皮癬菌中VT-1161的MIC值(<0.016～0.03 μg/mL)要低于伊曲康唑(0.03～0.12 μg/mL)。且VT-1161半衰期較長，每周一次給藥可以達到與每日給藥一次相近的血漿及皮膚的藥物濃度，被認為比伊曲康唑服用更加方便。

姜黃素不僅是一種安全可食用的香料，其作為一種光敏性物質(zhì)在抗菌方面的作用也逐漸被發(fā)掘[43]。Brasch等[44]在體外觀察光動力聯(lián)合姜黃素對皮膚癬菌包括絮狀表皮癬菌生長的影響。結(jié)果表明絮狀表皮癬菌對姜黃素最敏感，僅用0.2 μg/mL的姜黃素即可檢測到明顯的抑制作用，對其余皮膚癬菌如紅色毛癬菌、須癬毛癬菌、犬小孢子菌等的抑制濃度為0.6 μg/mL，但其抑制機制目前尚未闡明。

外用抗真菌藥難以滲透甲板，因此甲癬治療較體癬、股癬要困難，復(fù)發(fā)率高，往往需要聯(lián)合口服藥物才能達到治療效果。NO具有擴張血管、傳遞神經(jīng)信號、促進傷口愈合等作用，NO在抵抗病原微生物的先天性免疫中也起到了一定的作用[45]。NVN1000為一種可以穩(wěn)定提供治療劑量NO的聚硅氧烷分子。Stasko等[46]研究發(fā)現(xiàn)絮狀表皮癬菌、紅色毛癬菌、須癬毛癬菌對NVN1000敏感，在2mg/mL的NVN1000(302 μg/mL NO)的作用下，4 h后99.9%的真菌被抑制。NO及其相關(guān)氣體能夠快速通過甲板和微生物脂膜，為臨床高效地局部治療甲真菌病提供了一種有效地方法。

Zhang等[47]經(jīng)體外試驗發(fā)現(xiàn)特比萘芬或聯(lián)苯芐唑聯(lián)合他克莫司時在抑制絮狀表皮癬菌時具有協(xié)同作用，但是在聯(lián)合曲安奈德時則沒有類似作用。此外也有研究者報道次級地衣化合物如地衣酸[48]、百香油[49]等對絮狀表皮癬菌也有抑制作用。

3 小 結(jié)

隨著經(jīng)濟條件的改善，皮膚癬菌的流行情況不斷發(fā)生著變化，絮狀表皮癬菌的發(fā)病率較前已有所下降，但是在發(fā)展中國家如非洲等發(fā)病率仍可高達95%，需引起我們的注意。隨著分子生物學技術(shù)和基因組學的發(fā)展，現(xiàn)已有不少文獻報道了新的檢測分類方法及與宿主易感性相關(guān)的基因，為了解其致病機制和臨床的診治提供了重要的方向。人們對美觀較前有更高的要求，而絮狀表皮癬菌感染皮膚、甲等暴露部位，在一定程度上可給患者帶來沉重的心理負擔，需要我們臨床醫(yī)生更全面掌握相應(yīng)的臨床及基礎(chǔ)知識以提供更精細、針對性的治療。因皮膚癬菌治療療程長及藥物的不良反應(yīng)，患者易忽略或放棄治療，在一定程度上可能誘導(dǎo)耐藥菌的形成，因此針對不同靶點的新藥研發(fā)也具有重大意義。