劉星雨 李春暉 田晶晶，2 邵向麗，2 羅云波，2 許文濤，2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083）

熒光銅納米簇生物傳感器大約在10年前興起，這種傳感器的工作原理是以DNA為模板，以Cu2+為前體、以抗壞血酸等為還原劑，在DNA片段的大溝結(jié)構(gòu)上生成納米級(jí)銅顆粒，再通過聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）實(shí)現(xiàn)待測(cè)信號(hào)的放大，最后依賴銅納米簇的熒光特性實(shí)現(xiàn)信號(hào)輸出。熒光銅納米簇生物傳感器初期發(fā)展主要以反應(yīng)原理、熒光銅納米簇性質(zhì)、模板多樣性等內(nèi)容為主，自2012年，研究開始向熒光銅納米簇生物傳感器的應(yīng)用方向延伸，其重要的發(fā)現(xiàn)如圖1所示。

圖1 熒光銅納米簇生物傳感器重要研究進(jìn)展時(shí)間軸

根據(jù)靶標(biāo)性質(zhì)分化設(shè)計(jì)，熒光銅納米簇生物傳感器可以檢測(cè)生物體內(nèi)特定酶的活性、某一段基因序列、環(huán)境中重金屬污染等多種靶標(biāo)分子，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域都有較好的發(fā)展前景。

目前，對(duì)于熒光銅納米簇的生成原理、性質(zhì)等方面的研究框架已經(jīng)比較完善，應(yīng)用于靶物質(zhì)的信號(hào)捕捉、信號(hào)放大、信號(hào)輸出方面也分別演化出了許多設(shè)計(jì)精巧的方法。這些設(shè)計(jì)經(jīng)過優(yōu)化和擴(kuò)展，在未來將可能實(shí)際服務(wù)于各領(lǐng)域的檢測(cè)工作。

1 熒光銅納米簇的基本性質(zhì)

1.1 熒光銅納米簇的形成機(jī)制

熒光銅納米簇的形成要經(jīng)歷銅離子與DNA分子結(jié)合、二價(jià)銅離子在DNA相應(yīng)位點(diǎn)上還原為零價(jià)銅原子兩個(gè)過程。二價(jià)銅離子還原形成納米顆粒是在抗壞血酸的作用下完成的。硫酸銅或硝酸銅溶液中的二價(jià)銅離子被抗壞血酸還原為一價(jià)銅，再由一價(jià)銅還原為零價(jià)金屬后，在DNA上形成納米級(jí)顆粒［1］。CuNCs的熒光原理是由于其具有很少的表面缺陷，導(dǎo)致非輻射電子弛豫效果較差，形成熒光性提高。

目前，DNA模板影響熒光銅納米簇形成的具體原理尚不是完全清楚，其生成的有效模板一般是采用雙鏈poly（AT）序列和單鏈polyT序列兩種。

根據(jù)現(xiàn)有的研究，一個(gè)普遍接受的雙鏈poly（AT）作為模版的熒光銅納米簇反應(yīng)原理是，鳥嘌呤中的N7/O6以及胞嘧啶中的N3都由于在中性條件下的靜電作用和氧化作用而形成了Cu2+有較高的親和性，導(dǎo)致G-C對(duì)Cu2+具有較強(qiáng)的配位絡(luò)合作用從而不利于Cu2+的還原反應(yīng)，所以A-T堿基互補(bǔ)配對(duì)可以增強(qiáng)Cu2+的還原作用［2］。當(dāng)銅離子被還原為銅原子后，這些銅原子會(huì)在dsDNA的大溝中形成熒光銅納米簇。

而對(duì)于單鏈polyT序列，推測(cè)polyT介導(dǎo)CuNCs的形成是由于胸腺嘧啶和Cu2+之間的結(jié)合相互作用，被胸腺嘧啶復(fù)合的Cu2+沿著poly T模板被抗壞血酸還原成CuO。而polyT序列只支持單鏈形態(tài)作為模版的原因，推斷是由于dsDNA和Cu原子之間的強(qiáng)烈相互作用，導(dǎo)致 dsDNA幾何結(jié)構(gòu)使生成的CuNCs發(fā)生了光學(xué)變化。

由于DNA分子可以通過人為編碼堿基序列的方式雜交形成線性或立體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，所以用Cu2+在DNA分子上沉降覆蓋，形成涂膜，就可實(shí)現(xiàn)利用DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)而誘導(dǎo)熒光同納米簇的可控生成。

1.2 基于核酸生成的熒光銅納米簇的作用規(guī)律

要得到生成不同金屬納米粒子的模板，需要從大量隨機(jī)序列DNA片段當(dāng)中分別篩選。對(duì)于金屬銅而言，并非所有隨機(jī)的DNA序列都可以成為熒光銅納米簇的模板，能有效生成銅納米簇的模板區(qū)段主要有polyT單鏈序列和poly（AT）雙鏈序列兩種。模板的性質(zhì)對(duì)產(chǎn)生銅納米簇的效果起著很大影響，二者之間的大致規(guī)律可以描述為［3-4］：（1）模板區(qū)段越長(zhǎng)，產(chǎn)生銅納米熒光越強(qiáng)；但當(dāng)CuNCs達(dá)到一定尺寸后，形成的靜電屏障作用太大，會(huì)阻止CuNCs的繼續(xù)形成；（2）模板區(qū)段聚合度越高，產(chǎn)生銅納米熒光越強(qiáng)。

1.3 熒光銅納米簇的表征

熒光銅納米簇可以用熒光分光光度計(jì)來測(cè)量它的熒光特性。其激發(fā)光在340 nm，最大發(fā)射光的波長(zhǎng)與生成銅納米簇的模板序列以及其他實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)，通常位于500-660 nm。通過高分辨率透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope，TEM），可以觀察熒光銅納米簇的大小、形狀等表征，探究反應(yīng)條件和熒光銅納米簇性質(zhì)之間的關(guān)系；也可研究其在DNA模板上的形成位置和特點(diǎn)，了解熒光銅納米簇形成機(jī)制。

2 基于不同物質(zhì)與核酸作用方式的熒光銅納米簇生物傳感器

2.1 金屬離子介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器

2.1.1 鉛離子介導(dǎo)熒光銅納米簇生物傳感器 Chen等［5］在研究鉛離子檢測(cè)技術(shù)的過程中，發(fā)現(xiàn)鉛離子通過與熒光銅納米簇形成的中間形態(tài)一價(jià)銅反應(yīng)，

可以導(dǎo)致二價(jià)銅離子無法正常轉(zhuǎn)化為零價(jià)銅，從而淬滅dsDNA-CuNCs的熒光，反應(yīng)過程，如圖2-A所示。通過測(cè)定銅納米簇?zé)晒獾臏p弱程度，即可反映體系中鉛離子的濃度，檢出限為5 nmol/L。

2.1.2 汞離子介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 Qing等［6］利用Hg2+離子與胸腺嘧啶絡(luò)合形成T-Hg2+-T錯(cuò)配堿基對(duì)的性質(zhì)，設(shè)計(jì)出DNA-CuNCs為探針檢測(cè)Hg2+的方法。如圖2-B所示，對(duì)引物進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)，使其3′端與母鏈形成T-T錯(cuò)配，則錯(cuò)配的末端無法在DNA聚合酶的作用下正常延伸生成互補(bǔ)鏈，無法得到熒光銅納米粒子的模板dsDNA，不產(chǎn)生熒光。但在Hg2+存在時(shí)，T-Hg2+-T錯(cuò)配堿基能夠允許DNA聚合酶催化互補(bǔ)鏈的形成，從而得到dsDNA，隨后在CuSO4和抗壞血酸的反應(yīng)下得到熒光銅納米簇，檢測(cè)到熒光。此外，利用這個(gè)原理，也可檢測(cè)其他與Hg2+特異結(jié)合的分子，如半胱氨酸、谷胱甘肽和同型半胱氨酸，它們與汞離子結(jié)合后，破壞T-Hg2+-T堿基配對(duì)，使通過汞離子結(jié)合的兩條單鏈polyT-ssDNA分子形成的dsDNA解離，游離出polyT序列，發(fā)生熒光銅納米簇生成反應(yīng)，檢測(cè)到熒光信號(hào)［7］。

2.1.3 二價(jià)錳離子介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 Mn2+可以使CuNCs的最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移。如圖2-C所示，Han等［8］據(jù)此設(shè)計(jì)的傳感器利用單個(gè)堿基T生成CuNCs，發(fā)射黃色熒光，Mn2+存在時(shí)，變色為紅色熒光。此方法對(duì)Mn2+的檢出限可達(dá)10 μmol/L。

三種金屬離子介導(dǎo)的生物傳感器各有優(yōu)勢(shì)，而且原理都比較簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，不需耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間。其中Hg2+介導(dǎo)的生物傳感器由于應(yīng)用較廣泛，在近幾年的研究中被較頻繁地應(yīng)用。Mn2+介導(dǎo)的生物傳感器則可以實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)，也有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

2.2 非金屬介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器

許多非金屬可以通過與熒光銅納米簇的反應(yīng)原料Cu2+或CuNCs本身發(fā)生反應(yīng)，淬滅其熒光。例如，Liu等［9］利用圖3所示的S2-和CuNCs結(jié)合后淬滅熒光的性質(zhì)，發(fā)展出以dsDNA-CuNCs作為探針檢測(cè)環(huán)境和水體中S2-含量的方法。熒光減弱的程度與檢體中S2-的含量程正相關(guān)。檢測(cè)可在5 min內(nèi)完成，檢出限80 nmol/L。又如，CuNCs作為納米級(jí)顆粒具有很大的表面積，并有雙電層，能夠吸引I-，在反應(yīng)體系中過量Cu2+的存在下，發(fā)生反應(yīng)Cu2++Cu+2I-→2CuI。Chen等［10］利用I-瞬時(shí)淬滅CuNCs熒光的性質(zhì)，發(fā)展出一個(gè)以polyT-ss DNA分子為模板的熒光銅納米簇生物傳感器以檢測(cè)I-的含量，檢出限可達(dá)15 nmol/L。此外，曲酸（Kojic acid）與Cu2+之間存在較強(qiáng)結(jié)合。據(jù)此，可以利用其阻礙CuNCs形成的性質(zhì)，以熒光信號(hào)消失作為曲酸存在的檢測(cè)標(biāo)志。

非金屬離子介導(dǎo)的生物傳感器原理簡(jiǎn)單，檢出限低，可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測(cè)，但由于其本身原理的局限性，應(yīng)用廣泛性不是很強(qiáng)，想要將其延伸至其他物質(zhì)的檢測(cè)，仍需更加精巧和周密的設(shè)計(jì)。

圖2 金屬離子介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器示意圖

圖3 非金屬介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器

2.3 基于等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的熒光銅納米簇生物傳感器

2.3.1 HCR（Hybridization chain reaction 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 HCR的基本過程主要包括captureDNA的固定、探針DNA與captureDNA部分雜交結(jié)合、探針DNA粘性末端觸發(fā)HCR反應(yīng)的開始，并形成一個(gè)由發(fā)夾結(jié)構(gòu)H1、H2共存而成的dsDNA，以及dsDNA聚合物作為模板生成CuNCs的過程。

Zhao等［11］設(shè)計(jì)了一個(gè)復(fù)雜機(jī)理的HCR觸發(fā)反應(yīng)體系，如圖4-A所示。此HCR介導(dǎo)的生物傳感器是以葉酸受體作為靶標(biāo)，并通過電化學(xué)輸出信號(hào)工作的。在單鏈探針DNA 3′端修飾一個(gè)葉酸分子。在葉酸受體FR的保護(hù)下，DNA免受Exo I的水解，于是與電極上的captureDNA部分雜交結(jié)合固定。然后單鏈探針5′端再通過觸發(fā)HCR反應(yīng)結(jié)合發(fā)夾H1、H2，在此電極表面形成的dsDNA并生成CuNCs。之后CuNCs酸水解，解離出的銅離子催化OPD氧化成DAP，釋放電化學(xué)信號(hào)。Zhao等通過對(duì)電化學(xué)信號(hào)的檢測(cè)，證實(shí)了由探針DNA觸發(fā)的HCR反應(yīng)是信號(hào)變化的關(guān)鍵。

Song等［12］利用HCR，將captureDNA通過生物素-鏈霉親和素的相互作用結(jié)合到用鏈霉親和素修飾的磁柱上，然后用靶標(biāo)DNA觸發(fā)HCR反應(yīng)并生成CuNCs，最后通過熒光傳感法輸出信號(hào)。這種方法能夠有效放大待檢DNA分子的信號(hào)，并可以應(yīng)用于單核苷酸錯(cuò)配的檢驗(yàn)。

2.3.2 發(fā)夾-DNA聯(lián)級(jí)放大系統(tǒng)（Hairpin-DNA cascade amplification，HDCA）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 HDCA系統(tǒng)也是一種信號(hào)放大系統(tǒng)，主要利用DNA的遞推鏈置換的原理實(shí)現(xiàn)。如圖4-B所示，少量靶標(biāo)可以將HDCA系統(tǒng)的啟動(dòng)因子trigger從復(fù)合物中釋放出來，解放的trigger與其中一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)部分區(qū)域結(jié)合并逐漸引發(fā)連置換，雜交成為一個(gè)中間體。中間體又可以與另一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)鏈置換并結(jié)合，形成發(fā)夾復(fù)合物并將tigger從中間體中置換下來，引發(fā)另一輪鏈置換，由此實(shí)現(xiàn)一個(gè)單一trigger分子觸發(fā)的多輪HDCA循環(huán)。其中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)之間的結(jié)合形式可能成為某種信號(hào)的輸出形式，如設(shè)計(jì)發(fā)夾復(fù)合物作為CuNCs的模板，以熒光信號(hào)輸出。

2.3.3 滾環(huán)復(fù)制（Rolling circle replication，RCA）技術(shù)介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 Xu等［13］為解決用普通單鏈模板生成熒光銅納米簇時(shí)穩(wěn)定性不好、熒光弱的問題，引入RCA復(fù)制模式，如圖4-C所示。RCA是一種等溫復(fù)制技術(shù)，應(yīng)用于熒光銅納米簇生物傳感器時(shí)，將模板設(shè)計(jì)為包含R、H兩個(gè)功能區(qū)的環(huán)狀單鏈DNA分子。其中R區(qū)包括引物識(shí)別、結(jié)合序列；H區(qū)是雜交區(qū)域，其序列與互補(bǔ)鏈形成dsDNA后可以作為CuNCs的生成模板。引物可連續(xù)復(fù)制環(huán)狀DNA模板，形成一個(gè)由許多R、H短片段交替首尾串聯(lián)而成的長(zhǎng)鏈ssDNA分子。隨后H區(qū)段全部與互補(bǔ)鏈雜交，并參與后續(xù)CuNCs的生成反應(yīng)。由此可實(shí)現(xiàn)幾千個(gè)dsDNA單元的串聯(lián)，顯著提高熒光水平，從而為開發(fā)基于CuNCs的、針對(duì)可直接或間接引發(fā)RCR的各種靶標(biāo)的檢測(cè)方法提供機(jī)會(huì)。

2.3.4 靶觸發(fā)等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（Target- triggered isothermal exponential amplification reaction，TIEAR）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 TIEAR是一種等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)，它以具有5個(gè)區(qū)域（AXAXB）的單分子DNA寡聚體作為擴(kuò)增模板，聚合酶和切口內(nèi)切核酸酶作為催化劑，并且使用miRNA靶標(biāo)作為觸發(fā)因子。兩個(gè)重復(fù)A區(qū)是靶T的結(jié)合序列。兩個(gè)重復(fù)X區(qū)是切口內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)。B區(qū)是熒光銅納米簇合成區(qū)域。如圖4-D所示，Wang等［14］據(jù)此設(shè)計(jì)的熒光銅納米簇生物傳感器可以檢測(cè)在靶標(biāo)miRNA。靶標(biāo)出現(xiàn)后，TIEAR被miRNAs與區(qū)域A的結(jié)合啟動(dòng)，然后在polymerase/dNTPs 環(huán)境下雙鏈形成并延伸，形成一個(gè)穩(wěn)定的含有兩個(gè)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的dsDNA。第一個(gè)位點(diǎn)的切割導(dǎo)致了第二輪復(fù)制循環(huán)的開始，而第二個(gè)位點(diǎn)的切割使大量reporterR合成，R與cDNA結(jié)合成復(fù)合物，經(jīng)過二價(jià)銅離子的還原生產(chǎn)熒光性的銅納米顆粒，由此實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增循環(huán)和信號(hào)放大。

用等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的PCR，可以大大提升信號(hào)放大的倍數(shù)以降低檢出限，而且免去PCR的變溫過程，對(duì)于體系中含有對(duì)溫度敏感的靶標(biāo)或修飾分子，此方法有較強(qiáng)的利用價(jià)值。尤其是HCR技術(shù)，對(duì)其中的探針可做不同修飾，就可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)多種靶標(biāo)對(duì)檢測(cè)，應(yīng)用性非常好，在許多研究中都發(fā)揮了重要作用。但是等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的原理也相對(duì)較為復(fù)雜，要求設(shè)計(jì)和操作的相對(duì)精準(zhǔn)。

2.4 核酸酶介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器

2.4.1 S1核酸外切酶（S1 nuclease）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 利用隨機(jī)序列的雙鏈DNA可以生成熒光銅納米簇而單鏈DNA無法生成的簡(jiǎn)單原理，體系中nuclease的存在使母鏈DNA分解成小片段，無法與互補(bǔ)鏈雜交為熒光銅納米簇的雙鏈模板，即無法檢測(cè)到熒光［15］檢出限0.3 U/ mL。也可以利用30mer-polyT作為熒光銅納米簇模模板，當(dāng)nuclease將模板水解為小片段后，也無法檢測(cè)到熒光，實(shí)現(xiàn)將nuclease的存在轉(zhuǎn)化為熒光消失信號(hào)。檢出限 5 × 10-7units/μL。

2.4.2 外切核酸酶III（Exonuclease，Exo III）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 Zang等［16］利用Exo III從3′-5′切割DNA的特性，用熒光銅納米簇生物傳感器定量檢測(cè)Exo III。當(dāng)檢測(cè)體系中存在Exo III時(shí)，作為模板的dsDNA被酶解成小分子，阻止了熒光銅納米的產(chǎn)生。此方法檢出限可達(dá)0.02 U/mL（圖5-A）。

2.4.3 外切酶（Exonucleaseλ，Exoλ）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 λ外切酶可逐步切去雙鏈DNA 5′單核苷酸，沿5′-3′方向催化雙鏈 DNA 5′端單核苷酸的移除。但Exoλ的作用對(duì)于5′端羥基作用無效，只能催化5′端帶有磷酸基團(tuán)的核苷酸移除。

Zhang等［17］利用Exoλ的性質(zhì)，設(shè)計(jì)圖5-B所示的Exoλ介導(dǎo)的基于熒光銅納米簇的生物傳感器，以檢測(cè)靶標(biāo)PNK。PNK的作用是將5′-OH轉(zhuǎn)化為5′-P。雙鏈DNA既作為熒光銅納米簇的生成模板，又作為酶的作用底物。如果無PNK存在，則Exoλ無法消化5′端羥基化的DNA分子，在dsDNA上可正常形成熒光銅納米簇；當(dāng)存在PNK將dsDNA模板磷酸化后，Exoλ即可消化dsDNA模板，由于缺少dsDNA模板而無法形成熒光銅納米簇，因此不能檢測(cè)到明顯的熒光。

圖4 基于等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的熒光銅納米簇生物傳感器

2.4.4EcoR I（限制性內(nèi)切酶）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶。在EcoRI存在下，雙鏈DNA被切割，由于缺少雙鏈DNA模板，Cu2+和抗壞血酸不能形成熒光CuNCs。如果存在限制性內(nèi)切酶抑制劑，阻礙其水解DNA的作用，則能夠檢測(cè)到熒光。

Zhao等［18］利用此原理設(shè)計(jì)了如圖5-C所示的熒光銅納米簇生物傳感器，并檢驗(yàn)了其工作性能。其中，他們用到的限制性內(nèi)切酶抑制劑是α4肽。抑制劑是各種抗微生物和抗病毒藥物的潛在候選物，因此，EcoR I介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器也可以應(yīng)用于檢測(cè)其抑制劑，在醫(yī)學(xué)上有較強(qiáng)的應(yīng)用性。

2.5 復(fù)合酶介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器

2.5.1 T4 PNK（T4 Polynucleotide kinas：T4多核苷酸激酶）和T4 Ligase（T4連接酶）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 用帶有一個(gè)堿基位缺口的DNA為模板，無法產(chǎn)生熒光銅納米簇，此缺陷模板在T4 PNK的作用下使缺口處5′-OH磷酸化，并在T4 Ligase的作用下連接缺口，從而修復(fù)缺裂的DNA，使之成為完整的雙鏈模板，能正常生成熒光銅納米簇［19］，其原理如圖6-A所示。兩種酶也可分別介導(dǎo)熒光銅納米簇生物傳感器，利用其原理也可以實(shí)現(xiàn)兩種酶的抑制劑的測(cè)定。

圖5 核酸酶介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器［18］

2.5.2 雙鏈特異性核酸酶（Duplex-specific nuclease，DSN）和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 DSN是一種能高效識(shí)別并酶切完全互補(bǔ)配對(duì)的DNA雙鏈或者DNA/RNA 雜交雙鏈中的DNA鏈，而對(duì)單鏈DNA和單/雙鏈RNA幾乎沒有作用的核酸。TdT是一種無需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA分子的3′羥基端，但對(duì)于磷酸化的末端則沒有活性。Xu等［20］利用DSN和TdT兩種酶設(shè)計(jì)的熒光銅納米簇生物傳感器檢測(cè)miRNA的工作原理如圖6-B所示，3′端磷酸化的的小型單鏈隨機(jī)序列DNA探針既無法被DSN酶識(shí)別，又無法被TdT識(shí)別，所以在抗壞血酸和Cu2+的作用下無法生成熒光銅納米簇顯熒光。但當(dāng)靶標(biāo)miRNA存在時(shí)，探針的3′端磷酸基團(tuán)與靶標(biāo)RNA結(jié)合，形成復(fù)合物，成為DSN的底物。復(fù)合物被DSN切割后一方面觸發(fā)了更多靶標(biāo)-探針的結(jié)合反應(yīng)，形成循環(huán)，同時(shí)也游離出帶有3′端羥基的小型DNA片段。此片段在TdT酶的作用下延伸，形成一段可以作為熒光銅納米簇生物傳感器模版的單鏈polyT長(zhǎng)鏈，從而在抗壞血酸和Cu2+的存在下發(fā)生反應(yīng)，顯示熒光。

2.6 其他酶介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器

2.6.1 DNA聚合酶（DNA polymerase）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 Qing等［21］利用雙鏈DNA可作為熒光銅納米簇生成模板的性質(zhì)，發(fā)展了一種以銅納米的熒光信號(hào)作為顯色物質(zhì)輸出信號(hào)的DNA聚合酶檢驗(yàn)方法。體系中含有單鏈DNA分子、對(duì)應(yīng)的引物和脫氧核糖核苷酸（dNTPs）。當(dāng)DNA聚合酶存在與檢體中時(shí)，互補(bǔ)鏈合成反應(yīng)被啟動(dòng)，形成的雙鏈DNA分子可以作為后續(xù)熒光銅納米的生成模板。

2.6.2 胰蛋白酶介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 Ou等［22］發(fā)現(xiàn)，Cytc c淬滅CuNCs熒光的原理除了過去已經(jīng)認(rèn)識(shí)到的與CuNCs之間電子轉(zhuǎn)化的原理，還可以是因?yàn)槠浔灰鹊鞍酌杆舛┞冻隽擞坞x的半胱氨酸殘基，殘基上的硫原子與熒光銅納米簇的銅原子通過金屬-配體鍵結(jié)合為一個(gè)非熒光的絡(luò)合物，從而造成熒光信號(hào)減弱或消失，反應(yīng)原理如圖7-A所示。據(jù)此可檢測(cè)胰蛋白酶，檢出限為42 ng/mL。

圖6 復(fù)合酶介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器

Wang等［23］發(fā)現(xiàn)，使用dsDNA作模板生成熒光銅納米簇時(shí)，加入魚精蛋白可以形成精蛋白/DNA復(fù)合物，從而增強(qiáng)熒光，其原理如圖7-B所示。如果加入胰蛋白酶水解精蛋白，則熒光明顯淬滅。用這種方法檢測(cè)胰蛋白酶，檢出限可達(dá)0.048 ng/mL。

2.6.3 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 Zhang等［24］受焦磷酸（Pyrophosphoric acid，簡(jiǎn)稱PPi）與Cu2+具有強(qiáng)親和力的事實(shí)的啟發(fā)，推測(cè)PPi和Cu2+之間的螯合會(huì)導(dǎo)致Cu2+合成CuNCs過程中Cu2+向CuO的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致低熒光。如圖7-C所示，經(jīng)AlP處理后，PPi水解為Pi，使Cu2+和PPi之間的絡(luò)合失活，以dsDNA或polyT30［25］為模板，Cu2+正常被抗壞血酸經(jīng)Cu+還原為零價(jià)銅產(chǎn)生熒光銅納米簇。因此，可通過測(cè)定熒光強(qiáng)度的恢復(fù)和增強(qiáng)反映ALP濃度。檢出限可達(dá)0.1 nmol/L。

2.6.4 TdT介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 Chi等［26］利用 KF 外切酶（Klenow fragment exo，KFexo）和TdT，設(shè)計(jì)圖7-D所示的以miRNA（Micro ribonucleic acid）為靶標(biāo)的熒光銅納米生物傳感器。首先，靶標(biāo)miRNA與探針DNA雜交形成引物（miRNA）-模板復(fù)合物。然后，KFexo催化引物延伸，產(chǎn)生與探針DNA互補(bǔ)的短DNA鏈。隨后TdT直接催化短DNA鏈的3′-OH延伸，形成polyT模板。至此，一個(gè)短的miRNA可以被有效地轉(zhuǎn)換成一個(gè)長(zhǎng)的polyT序列，它可以作為模板形成熒光銅納米簇。Chen等［27］利用TdT，設(shè)計(jì)以核酸酶為靶標(biāo)的熒光銅納米簇生物傳感器。該傳感器用具有3′端磷酸化的發(fā)夾DNA作為底物，其無法在TdT的作用下延伸出polyT序列，無法生成CuNCs。但當(dāng)核酸酶存在時(shí)，發(fā)夾DNA被水解為大量單鏈片段。該片段作為引物，TdT引發(fā)的鏈延伸啟動(dòng)，形成一長(zhǎng)鏈polyT序列，作為CuNCs生成的模板，顯示熒光。利用這個(gè)生物傳感器，將發(fā)夾DNA設(shè)計(jì)為不同核酸酶的適當(dāng)?shù)孜?，可以檢測(cè)不同種類的核酸酶。Chen等已用Exo III和EcoR V作為靶標(biāo)驗(yàn)證。

以酶介導(dǎo)的銅納米核酸生物傳感器最基礎(chǔ)的應(yīng)用就是在細(xì)胞提取物體系中檢測(cè)靶標(biāo)酶的活性，由于其傷害小，不引入污染，未來在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景，可能直接發(fā)展為一種體內(nèi)檢測(cè)酶活性的無損方法，這對(duì)癌癥的提前發(fā)現(xiàn)、DNA損害原因鑒別都有較大幫助。此外，TdT介導(dǎo)的納米核酸生物傳感器在近年來應(yīng)用十分廣泛，利用其直接誘導(dǎo)脫氧核苷酸在模板末端結(jié)合延伸的性質(zhì)可以方便可控地制作熒光銅納米簇模板，原理簡(jiǎn)單，非常具有突破性。另外，以酶介導(dǎo)的同納米核酸生物傳感器在工作時(shí)，要注意不同酶工作的條件范圍和最適條件，避免酶失活。

2.7 生物小分子介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器

圖7 酶介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器

2.7.1 小分子元件介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 Wang等［28］在實(shí)驗(yàn)中以polyT為模板，在其3′端連接一個(gè)小分子識(shí)別元件，此時(shí)加入硫酸銅溶液和抗壞血酸進(jìn)行反應(yīng)，模板正常產(chǎn)生熒光銅納米簇。如圖8-A所示，若體系中沒有和小分子識(shí)別元件結(jié)合的蛋白質(zhì)，則在ExoI酶的作用下，polyT模板水解，熒光消失。若體系中存在這種結(jié)合蛋白，就會(huì)形成蛋白質(zhì)/小分子-polyT的雜合結(jié)構(gòu)，由于蛋白質(zhì)的空間位阻作用，阻礙了ExoI酶靠近模板，保護(hù)polyT模板不被水解，銅納米粒子正常產(chǎn)生，可以檢測(cè)到熒光。

2.7.2 克萊多巴胺（Ractopamine，RAC）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 Sheng等［29］以克萊多巴胺為測(cè)定靶標(biāo)，巧妙地設(shè)計(jì)了一個(gè)由RAC介導(dǎo)的循環(huán)擴(kuò)增-信號(hào)放大系統(tǒng)（圖4-B），其中包括一個(gè)A-T復(fù)合物，它是由一個(gè)能觸發(fā)HDCA循環(huán)系統(tǒng)的trigger序列和一個(gè)能與靶標(biāo)克萊多巴胺結(jié)合以捕捉靶標(biāo)信號(hào)的適體A組成的。

兩個(gè)DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)HP1和HP2最初不互相雜交，但在加入靶標(biāo)RAC后，適體（A）和靶標(biāo)RAC之間的特異性結(jié)合導(dǎo)致A-T復(fù)合物的解離。隨后，HP1的暴露的突出結(jié)構(gòu)a和Ttigger的f區(qū)域雜交逐漸引發(fā)鏈置換，從而通過結(jié)構(gòu)域雜交（a，b和f，g）產(chǎn)生HP1-T中間體。HP1-T具有暴露的ssDNA結(jié)構(gòu)域d，能夠與HP2中的結(jié)構(gòu)域d *雜交。因此，d和d *雜交后，序列b將發(fā)生分支遷移并置換T序列（g）形成HP1-2雙鏈體（bcd和b * c * d *），T被HP1置換下來后，HP1和HP2的進(jìn)一步雜交可實(shí)現(xiàn)下一輪催化循環(huán)。poly（AT）序列設(shè)計(jì)在HP1-HP2的結(jié)構(gòu)域b c d和b * c * d *上。在Cu2+和抗壞血酸鈉的存在下，在HP1-HP2的dsDNA結(jié)構(gòu)上可以形成CuNP，最后以電化學(xué)信號(hào)的輸出形式來反映檢體中克萊多巴胺的含量。

RAC靶標(biāo)可以在重復(fù)循環(huán)中催化多個(gè)HP1-HP2雙鏈體的再生，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的循環(huán)放大。Sheng等已用加標(biāo)動(dòng)物尿樣來檢驗(yàn)HDCA系統(tǒng)對(duì)靶標(biāo)RAC的檢測(cè)效果，檢出限低至0.3 pmol/L。

2.7.3 多巴胺介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 如圖8-B所示，Wang等［30］利用多巴胺與CuNCs之間存在光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移從而淬滅熒光的作用，使用隨機(jī)序列雙鏈DNA分子作為模板發(fā)展出多巴胺的檢測(cè)方法。檢出限可達(dá)20 pmol/L。

2.7.4 三聚氰胺介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器Zhu等［31］發(fā)現(xiàn)三聚氰胺可以和胸腺嘧啶通過氫鍵穩(wěn)定結(jié)合，由此他們利用單鏈polyT序列作為模板生成熒光銅納米簇，如圖8-C所示，如果檢測(cè)體系中存在三聚氰胺，則可以將兩條單鏈polyT序列用氫鍵結(jié)合成雙鏈，此時(shí)熒光成倍增長(zhǎng)。檢出限可達(dá)95 nmol/L。

2.7.5 谷胱甘肽（Glutathione，GSH）介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器 谷胱甘肽和Cu2+之間有強(qiáng)結(jié)合作用。谷胱甘肽的存在會(huì)導(dǎo)致Cu2+無法與dsDNA模版結(jié)合，從而無法生成CuNCs。Wang等［32］基于谷胱甘肽介導(dǎo)的熒光銅納米生物傳感器，并用電化學(xué)輸出信號(hào)檢測(cè)谷胱甘肽的含量。如圖8-D所示，作為模板的dsDNA被通過金-硫化學(xué)鍵固定在金電極上，如果有CuNCs生成，則會(huì)引發(fā)DPV顯著信號(hào)響應(yīng)。當(dāng)谷胱甘肽存在時(shí)，谷胱甘肽-Cu2+復(fù)合物形成，導(dǎo)致能夠到達(dá)電極上的dsDNA的Cu2+數(shù)量急劇下降，電化學(xué)信號(hào)隨之減弱。

小分子介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器一般利用小分子與反應(yīng)體系中模板或產(chǎn)物之間的特異性反應(yīng)工作，針對(duì)小分子本身為靶標(biāo)的檢測(cè)具有靈敏度極高（可達(dá)pmol/L級(jí)）、響應(yīng)迅速、定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但由于工作原理是利用二者之間的特異性反應(yīng)，所以難以應(yīng)用到其他靶標(biāo)上。

2.8 基于電化學(xué)信號(hào)的熒光銅納米簇生物傳感器

由于CuNCs在酸性環(huán)境下有水解的特性，可釋放出銅離子，能通過電信號(hào)輸出并測(cè)量。其中，由于大部分檢體中待檢物質(zhì)含量均不高，無法保證每個(gè)檢測(cè)體系最終都能生成足夠的CuNCs，釋放足夠的銅離子并直接引發(fā)可觀察到的電信號(hào)變化。因此，熒光銅納米簇介導(dǎo)的生物傳感器用電化學(xué)信號(hào)表達(dá)檢體含量時(shí)，為了保證少量的檢體生成的CuNCs可以引發(fā)程度足夠大的電化學(xué)信號(hào)變化，我們一般不以酸水解釋放的銅離子直接作為電極檢測(cè)的目標(biāo)，而是將銅離子作為催化劑，催化某一種可以較劇烈引發(fā)電化學(xué)信號(hào)變化的物質(zhì)（如將銅離子作為OPD氧化成DAP的催化劑），再測(cè)定生成物的電信號(hào)，并可采用等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，以此實(shí)現(xiàn)信號(hào)的逐級(jí)放大，提高傳感器的靈敏度。

圖8 生物小分子介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器

目前基于CuNCs酸水解的電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)，主要包括電化學(xué)阻抗信號(hào)譜（Electrochemical impedance signal spectrum，EIS）法、循環(huán)伏安（Cyclic voltammetry，CV）法、差分脈沖伏安（Differential pulse volt-ampere，DPV）法等。

2.9 基于熒光信號(hào)的熒光銅納米簇生物傳感器

熒光信號(hào)是熒光銅納米簇生物傳感器最常用、最傳統(tǒng)的信號(hào)輸出方式。CuNCs的生成可實(shí)現(xiàn)在室溫下、15 min內(nèi)完成，直接以反應(yīng)體系中的溶液為樣品，通過熒光分光光度計(jì)即可測(cè)定CuNCs的熒光吸收、發(fā)射波長(zhǎng)及熒光強(qiáng)度，具有反應(yīng)簡(jiǎn)易、定量方便、響應(yīng)迅速、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)。

2.10 可視化的熒光銅納米簇生物傳感器

通過紫外燈或紫外透照器可以直接觀測(cè)CuNCs體系的熒光特性，適于定性地檢測(cè)靶標(biāo)物質(zhì)，可視化檢測(cè)可以粗略地比對(duì)熒光相對(duì)強(qiáng)弱，并且在一些通過靶標(biāo)使熒光發(fā)生顏色變化來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)工作的傳感器上有獨(dú)特的應(yīng)用，近年來的研究也比較多?？梢暬僮饔捎诰哂新阊塾^測(cè)、操作方便的優(yōu)勢(shì)，也有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，但在研究中，由于無法精準(zhǔn)定量，只能作為輔助手段檢驗(yàn)熒光銅納米簇生物傳感器工作效果。

3 不同物質(zhì)介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器工作性能對(duì)比

現(xiàn)將各生物傳感器的工作性能總結(jié)如表1，可以看出，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器由于具有很強(qiáng)的信號(hào)放大功能，故而明顯較其他傳感器靈敏，檢出限至少可達(dá)pmol/L級(jí)。此外，小分子元件介導(dǎo)的生物傳感器也有較為靈敏的檢測(cè)效果。

4 熒光銅納米簇生物傳感器的應(yīng)用

由于形成熒光銅納米簇的反應(yīng)所需時(shí)間短、對(duì)人體和環(huán)境毒性小、無需使用特殊標(biāo)記的配體或復(fù)雜的配體設(shè)計(jì)，故用熒光銅納米簇作為檢測(cè)物質(zhì)的輸出信號(hào)，是一種非常經(jīng)濟(jì)、安全的方法，滿足環(huán)保和便捷檢驗(yàn)的發(fā)展方向。尤其是對(duì)于醫(yī)學(xué)方面細(xì)胞內(nèi)跟蹤和體內(nèi)檢測(cè)、定制藥物的設(shè)計(jì)等方面有很好的應(yīng)用前景。

4.1 氨基酸及蛋白質(zhì)檢測(cè)

4.1.1 半胱氨酸 半胱氨酸及其他含硫原子氨基酸可以通過與銅原子絡(luò)合而淬滅熒光銅納米簇的熒光。通過這個(gè)原理可以檢測(cè)這些含硫氨基酸以及其他能夠產(chǎn)生含硫氨基酸的物質(zhì)，由于這類物質(zhì)非常多，如細(xì)胞色素C等，所以據(jù)此設(shè)計(jì)的生物傳感器應(yīng)用十分廣泛。此外，半胱氨酸可以與汞離子結(jié)合，通過由汞離子介導(dǎo)的熒光銅納米簇生物傳感器檢測(cè)。

4.1.2 端粒配體 G-四鏈體是在人體端粒DNA中形成的、可抑制端粒酶活性的結(jié)構(gòu)。其配體是一種蛋白質(zhì)。因此，檢測(cè)G-四聯(lián)體的配體在治療癌癥方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

Yang等［33］據(jù)此設(shè)計(jì)出的熒光銅納米簇生物傳感器可以檢測(cè)端粒配體的存在。如圖9，在不存在配體的情況下，人端粒DNA（GDNA）與其互補(bǔ)DNA（cDNA）雜交形成雙鏈DNA（dsDNA），其可以作為形成DNA-CuNP的有效模板，導(dǎo)致高熒光的發(fā)生。在配體存在下，GDNA折疊成G-四聯(lián)體。單鏈cDNA不支持DNA-CuNP的形成，導(dǎo)致低熒光的發(fā)生。因此，可以通過監(jiān)測(cè)DNA-CuNCs的熒光變化來篩選端粒結(jié)合配體。

4.2 酶的檢測(cè)

利用熒光銅納米簇作為輸出信號(hào)檢驗(yàn)酶的原理十分多樣。各種酶系可能參與DNA分子的合成或水解，從而導(dǎo)致熒光產(chǎn)生或淬滅；可能參與催化降解或合成銅納米顆粒的絡(luò)合物，從而導(dǎo)致熒光產(chǎn)生或淬滅。如前文所提到的多種內(nèi)切酶、聚合酶、核酸酶、磷酸酶等都可通過這些原理進(jìn)行檢測(cè)。在DNA的擴(kuò)增、熒光銅納米簇產(chǎn)生的過程中，有很多物質(zhì)（金屬、非金屬離子、生物小分子等）均可介導(dǎo)，凡是能與這些物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的酶，理論上都可以作為熒光銅納米簇的檢測(cè)靶標(biāo)，如各種蛋白酶、水解酶等。

4.3 核酸分子的檢測(cè)

4.3.1 識(shí)別DNA 含有高效生產(chǎn)熒光銅納米簇的DNA序列（如poly-AT雙鏈序列）經(jīng)擴(kuò)增后作為熒光銅納米簇的反應(yīng)模板，產(chǎn)生出有熒光性的銅納米顆粒，將自身存在的信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)或電信號(hào)輸出，可以被直接檢測(cè)到。無法高效產(chǎn)生熒光銅納米簇的DNA序列通過改造其引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物中引物序列高效產(chǎn)生熒光銅納米簇，也可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。

表1 不同物質(zhì)介導(dǎo)熒光銅納米簇生物傳感器檢測(cè)方法的比較

圖9 熒光銅納米簇生物傳感器檢測(cè)端粒配體

4.3.2 識(shí)別錯(cuò)配 如果熒光銅納米簇的模板發(fā)生錯(cuò)配突變，則生成的銅納米簇?zé)晒庑再|(zhì)受到突變位點(diǎn)、錯(cuò)配種類的影響。通過測(cè)定銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度，可以區(qū)分完整或變異序列，并識(shí)別變異類型。這種技術(shù)廣泛應(yīng)用于單核苷酸錯(cuò)配的檢測(cè)。

還可以利用錯(cuò)配設(shè)計(jì)如圖10-A所示的特殊DNA結(jié)構(gòu)，如Sun等［34］設(shè)計(jì)的3WJ結(jié)構(gòu)檢測(cè)堿基錯(cuò)配時(shí)，兩條富含互補(bǔ)的連續(xù)AT序列的探針可以同時(shí)于第三條靶DNA形成一個(gè)Y字形結(jié)構(gòu)，作為CuNCs的生成模板。但當(dāng)靶DNA存在突變時(shí)，就會(huì)與探針DNA形成單核苷酸錯(cuò)配并阻礙CuNCs的形成，熒光信號(hào)消失。

4.3.3 識(shí)別RNA miRNAs是內(nèi)源性的小型非編碼RNA分子。以它作為引物擴(kuò)增一段帶有熒光銅納米簇生成模板的DNA分子，可以用銅納米的熒光性作為輸出信號(hào)反映RNA的存在。靶標(biāo)信號(hào)可以通過等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)放大。另外，Borghei等［35］以polyT為模板，如圖10-B所示設(shè)計(jì)生物傳感器。在沒有靶miRNA-155的情況下DNA-CuNCs的熒光在510 nm處有最大發(fā)射，熒光為綠色，在靶miRNA-155存在的情況下，發(fā)生60 nm的紅移，熒光呈橙色，創(chuàng)新性地以顏色變化作為靶標(biāo)存在的檢測(cè)標(biāo)志。

圖10 熒光銅納米簇生物傳感器檢測(cè)核酸

4.4 金屬離子的檢測(cè)

利用鉛離子淬滅dsDNA介導(dǎo)的銅納米簇?zé)晒獾哪芰?，可檢測(cè)水體、人體尿樣中的鉛離子含量，并應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)等方面的其他樣品檢測(cè)。檢出限為5 nmol/L。此外，熒光銅納米簇生物傳感器最直接的應(yīng)用就是檢測(cè)銅離子，熒光銅納米簇的生成所需銅離子濃度很低，目前較為成功的是Qing等［36］發(fā)展的polyT40檢測(cè)體系，可實(shí)現(xiàn)在1 min內(nèi)、檢出限為5.6 μmol/L的快速檢測(cè)。利用Hg2+離子與胸腺嘧啶絡(luò)合形成T-Hg2+-T錯(cuò)配堿基對(duì)的性質(zhì)、Mn2+離子使熒光銅納米簇的熒光發(fā)生紅移的性質(zhì)，均可通過熒光銅納米簇生物傳感器檢測(cè)，具體原理不做重復(fù)說明。

4.5 化學(xué)基團(tuán)、化學(xué)分子的檢測(cè)

熒光銅納米簇在化學(xué)基團(tuán)方面的應(yīng)用十分廣泛。這些化學(xué)分子在熒光銅納米簇的形成過程中可以影響多個(gè)環(huán)節(jié)。有些化學(xué)分子本身對(duì)模板DNA分子或CuNCs分子產(chǎn)生破壞，淬滅CuNCs的熒光；有些則可以將自身的配體修飾到模板DNA分子上，并利用其與配體的結(jié)合，使DNA分子的性質(zhì)發(fā)生改變，如破壞其特定結(jié)構(gòu)或使酶的其的作用失活，從而使熒光信號(hào)改變。

4.5.1 ATP的檢測(cè) 如圖11-A，Zhou等［37］發(fā)現(xiàn)ATP分子能夠誘導(dǎo)DNA反平行四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的形成，使得作為熒光銅納米簇生成模板的雙鏈DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，一條鏈松散脫落而無法成功發(fā)生銅納米簇生成的反應(yīng)。從而將ATP的存在轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒庀У男盘?hào)，設(shè)計(jì)成一個(gè)“turn-off”型的生物傳感器，檢出限為0.1 μmol/L。同時(shí)，利用ATP誘導(dǎo)DNA反平行四聯(lián)體結(jié)構(gòu)形成的性質(zhì)，Song等［38］令其保護(hù)ss-polyT DNA模板免受ExoI的水解，在抗壞血酸和Cu2+的存在下形成CuNCs，從而設(shè)計(jì)出一個(gè)“turn-on”型的以ATP為靶標(biāo)的熒光銅納米簇生物傳感器，更加清晰地觀察到靶標(biāo)的存在。

4.5.2 生物素等其他小分子 除了Song等用HCR等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、磁珠修飾技術(shù)測(cè)定的生物素和鏈霉親和素以外，很多小分子與特定蛋白質(zhì)都有類似生物素和鏈霉親和素之間的結(jié)合關(guān)系（如葉酸分子和葉酸受體等）。利用這個(gè)原理，可以同時(shí)檢測(cè)許多小分子和相應(yīng)結(jié)合蛋白。將磁珠（一般為磁性Fe3O4納米顆粒）用結(jié)合蛋白涂覆包被，再用小分子修飾CuNCs模板DNA分子（如ss-polyT序列）。如果體系中沒有檢體，則在小分子和結(jié)合蛋白的特異相互作用下，CuNCs模板DNA分子將結(jié)合到磁珠之上，并隨磁珠通過磁力沉淀，發(fā)生CuNCs生成反應(yīng)，賦予沉淀較高的熒光信號(hào)。如果體系中存在檢體，則磁珠將選擇與體系中游離的檢體結(jié)合，通過磁力沉淀將其帶入下層，而模板DNA則留在上清夜，通過CuNCs生成反應(yīng)賦予上清夜較高的熒光信號(hào)。Cao等［39］已用此原理，并用生物素-鏈霉親和素作為模型物質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并引入TdT介導(dǎo)的polyT合成系統(tǒng)制作CuNCs的模板DNA分子，由此設(shè)計(jì)的如圖11-B所示的生物傳感器在同一系統(tǒng)中生物素的檢出限為3.1 nmol/L；鏈霉親和素的檢出限為0.47 nmol/L。

4.5.3 H2O2的檢測(cè) H2O2具有氧化性，可以生成羥基自由基，既能夠攻擊DNA分子，又可以氧化破壞CuNCs。利用H2O2的性質(zhì)，將其淬滅CuNCs熒光性質(zhì)的能力通過熒光銅納米簇生物傳感器反映出來，就可以測(cè)知其存在并測(cè)定其含量。

例如，Mao等［40］利用單鏈polyT-DNA作為熒光銅納米粒子生成模版時(shí)對(duì)模板長(zhǎng)度的要求，設(shè)計(jì)出如圖11-C中的檢測(cè)H2O2的辦法。在H2O2存在時(shí)，加入二價(jià)鐵離子會(huì)使反應(yīng)體系產(chǎn)生羥基自由基，攻擊ss-polyT-DNA片段，使其分解成小片段，無法作為熒光銅納米簇的模板，并以熒光的減弱或消失作為被檢物質(zhì)消失的信號(hào)。此方法還可應(yīng)用于檢測(cè)其他可被氧化酶催化氧化并產(chǎn)生H2O2的物質(zhì)，如葡萄糖、膽堿、膽固醇、黃嘌呤和乳酸等。其中，Mao等已在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了方法用于檢驗(yàn)血清樣品中葡萄糖含量的可行性。

Chen等［41］利用H2O2破壞CuNCs的能力，設(shè)計(jì)了其基于熒光銅納米簇生物傳感器的檢測(cè)方法。如圖11-C2所示，dsDNA誘導(dǎo)的CuNCs本身顯示紅色熒光，在CuNCs的環(huán)境中加入SYBR Green I，由于SYBR Green I只吸附在CuNCs表面，而不嵌入dsDNA，故此時(shí)顯示CuNCs 的紅色熒光。但當(dāng)H2O2存在時(shí)，CuNCs解構(gòu)并被淬滅熒光；與此同時(shí)，SYBR Green I與dsDNA結(jié)合的抑制被消除，顯示綠色熒光。由此，即實(shí)現(xiàn)將綠色熒光作為H2O2含量的輸出信號(hào)。

5 總結(jié)與展望

首先，目前對(duì)熒光銅納米簇的了解還只局限在10年的研究基礎(chǔ)上。雖然對(duì)于熒光銅納米簇的生成形成了基本認(rèn)知，對(duì)于它的反應(yīng)體系也達(dá)成了基本的共識(shí)，但是熒光銅納米簇的反應(yīng)原理和機(jī)制仍有很多細(xì)節(jié)問題需要繼續(xù)研究。例如，在模版方面，用隨機(jī)序列、雙鏈polyAT序列和單鏈polyT序列反應(yīng)有何異同之處；在熒光銅納米簇的形成方面，熒光銅納米簇在DNA分子中生成的具體位置、其與DNA分子結(jié)合的具體方式；熒光銅納米簇反應(yīng)過程的具體步驟、反應(yīng)物添加的最佳順序等都需要更加深入的討論。

圖11 熒光銅納米簇生物傳感器檢測(cè)化學(xué)分子

其次，雖然熒光銅納米簇生物傳感器已經(jīng)拓展出成百上千種應(yīng)用，但是在未來能否將它們發(fā)展得應(yīng)用性、操作性更好，能否服務(wù)于實(shí)際生活，還需要對(duì)熒光銅納米簇本身更加深入的研究，解決這些細(xì)節(jié)問題。銅是人體內(nèi)的一種必需微量元素。在正常范圍內(nèi)對(duì)人體有重要作用，但缺乏或過量都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的病理改變。所以利用銅元素的體內(nèi)檢測(cè)、利用銅元素進(jìn)行細(xì)胞成像是未來醫(yī)學(xué)發(fā)展的必然趨勢(shì)。然而在此之前我們必須繼續(xù)研究熒光銅納米簇在體內(nèi)生成的穩(wěn)定性，如反應(yīng)過程中產(chǎn)物會(huì)否被體內(nèi)核酸酶切割等，要首先在體外實(shí)驗(yàn)中搞清基本的操作可行性。

最后，熒光銅納米簇生物傳感器在現(xiàn)階段主要還是采用熒光信號(hào)輸出，電化學(xué)輸出信號(hào)法操作性不如熒光法簡(jiǎn)便；而可視化信號(hào)輸出又需要特殊的反應(yīng)特性，所以在未來的工作中需要有新傳感方法的建立。生物傳感器離不開材料學(xué)的應(yīng)用，今后可能需要熒光銅納米簇生物傳感器與新型納米材料、復(fù)合納米材料等學(xué)科進(jìn)行交叉，如近年開展的金納米簇、銀納米簇等，探究二者結(jié)合是否具備更多優(yōu)勢(shì)，能否創(chuàng)造出新的傳感方法。另外，熒光銅納米簇可應(yīng)用的領(lǐng)域雖多，但是一般一種傳感器無法做到多重靶標(biāo)檢測(cè)，在未來的研究工作中，仍需要篩選出多能性比較好的傳感器，以賦予熒光銅納米簇生物傳感器實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。