張媛 梁嘉慧 羅云波 田晶晶 田洪濤 許文濤

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，保定 071001；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

基因工程重要的特點(diǎn)之一是在體外實(shí)行DNA分子的切割和重新連接，因此工具酶是DNA體外操作必不可少的工具。工具酶種類繁多、功能各異，主要包括限制酶、聚合酶、連接酶、修飾酶和核酸酶5大類。獲得某種特殊的目的基因，大多需要工具酶——限制性內(nèi)切酶，將目的基因和載體DNA連接到一起，也需要工具酶——DNA連接酶。這些酶具有特異性的序列識別能力以及高效的生物催化活性，在一定的條件下可以對核酸分子進(jìn)行切割、連接、擴(kuò)增以及修飾等，同時(shí)工具酶的反應(yīng)條件溫和且具有出色的生物相容性。基于這些優(yōu)勢，工具酶被廣泛地應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)和小分子等生物活性分子的分析檢測。常用的工具酶包括：限制性核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶和磷酸激酶、單鏈核酸內(nèi)切酶、核酶等。在基因工程的研究中，多傾向于將兩種或多種工具酶混合使用，充分發(fā)揮各工具酶的功能，以達(dá)到最優(yōu)的應(yīng)用效果，如本文所述，可以利用甲基化酶和TdT酶共同作用構(gòu)建電化學(xué)傳感器、利用核酸外切酶和TdT酶構(gòu)建熒光生物傳感器等。

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）是一種催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA或RNA分子的3′羥基端的無需模板的DNA聚合酶［1］。1958年，Bollum等［2］從小牛胸腺中純化并稱為小牛胸腺DNA聚合酶，后來因其催化聚合時(shí)不需要模板的特點(diǎn)改名為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶。此酶大量存在于胸腺中［3］，少量存在于骨髓細(xì)胞內(nèi)［4］，在煙草培養(yǎng)細(xì)胞中也含有此酶［5］。自1973年McCaffrey等［6］在急性淋巴母細(xì)胞白血病人的白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)此酶后，科學(xué)家們對此酶進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)其對生物功能有很大的影響，TdT酶在體內(nèi)表達(dá)被認(rèn)為僅發(fā)生于原發(fā)性淋巴組織（胸腺和骨髓）中［7-9］，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于腫瘤的檢測和治療［6，10］、免疫組織化學(xué)分析［11］、作為某些白血病的診斷指標(biāo)［12-13］和某些人類癌細(xì)胞的生物標(biāo)志等方面［13-14］。自1958年來，科學(xué)家對末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的研究從未間斷，但是對于核心特征即可以不依賴于模板聚合的發(fā)生原因卻仍未探究清楚。即使如此，其獨(dú)特?zé)o模板便可擴(kuò)增的特性卻使得其在核酸標(biāo)記中具有很廣闊的前景，被廣泛應(yīng)用于核酸生物傳感、核酸納米技術(shù)和基因芯片技術(shù)等領(lǐng)域中。

1 TdT酶的簡介

1.1 TdT酶的結(jié)構(gòu)

DNA聚合酶的X家族是核酸轉(zhuǎn)移酶家族的亞類，TdT酶屬于DNA聚合酶的X家族，是基因結(jié)構(gòu)具有高度保守性的多結(jié)構(gòu)域蛋白［15-16］。1971年，Change等［17］提出了用于純化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的簡化程序，通過平衡離心和凝膠電泳顯示該酶是均相的，其可被十二烷基硫酸鈉解離成α和β兩個亞基。后來Sabbioni［18］用放射性活性分析法證明它是含鋅的金屬酶，實(shí)驗(yàn)時(shí)常用Mg2+作為激活嘌呤核苷三磷酸聚合的激活劑，Co2+作為嘧啶核苷三磷酸聚合的激活劑，Srivastava［19］實(shí)驗(yàn)證明了Mg2+不能代替Zn2+，而Co2+可以代替Zn2+。

1.2 TdT酶的性質(zhì)

TdT酶的分子量為60 kD的金屬酶，最適pH值為7.2，二價(jià)離子如Mg2+、Mn2+和Co2+等可作為其輔因子，加速酶催化反應(yīng)［13，20］。核酸類似物如5-甲基-dCTP、6-O-甲基-dGTP等可作為反應(yīng)的底物，三磷酸雙脫氧胸腺嘧啶和三磷酸蟲草菌素作為為反應(yīng)的終止物。EDTA是非常有效的TdT酶抑制劑，只要微克分子水平的EDTA就可抑TdT酶的活性。金屬鰲合劑因除去了二價(jià)金屬離子而起到抑制作用，但它并不能改變酶的結(jié)構(gòu)，也不與dNTP競爭，而與起始物競爭，阻礙了起始物和酶的結(jié)合，是一種金屬配基抑制劑。

1.3 TdT酶催化的生物反應(yīng)

TdT酶可催化dNTP或標(biāo)記了小分子的dNTP，如Cy3-dNTP和biotin-dNTP。聚合于RNA或單雙鏈DNA的3′-OH末端的反應(yīng)，該反應(yīng)無需特定模板，但引物須至少有3個以上堿基的寡核苷酸。以RNA為模板時(shí)，TdT性能嚴(yán)格依賴于受體RNA3′-末端的三級結(jié)構(gòu)和核苷酸種類。一般來說，TdT對RNA模板的作用效率比DNA模板低，目前的研究也多以DNA為模板進(jìn)行。TdT酶對于引物分子的具體序列無特殊要求，凡是帶有突出、凹陷或平滑的3′末端的單雙鏈DNA分子均可作為引物，其中3′突出末端摻入效率最高，而延伸產(chǎn)物的堿基序列則由反應(yīng)池中的dNTP的成分所決定［21-22］，TdT酶已廣泛用于溶液中DNA的延伸或在表面制備DNA納米結(jié)構(gòu)［23-24］。

2 3′端羥基生成機(jī)制介導(dǎo)的TdT酶功能核酸傳感器

2.1 TdT酶和界面納米材料聯(lián)合介導(dǎo)的生物傳感器

隨著對核酸研究的不斷深入，核酸參與的反應(yīng)不僅僅局限于液相體系，很多反應(yīng)也可在固相表面進(jìn)行，有使產(chǎn)物更容易分離等優(yōu)點(diǎn)，如在核酸表面修飾巰基，可通過金硫鍵將核酸固定在金電極表面以進(jìn)行一系列的反應(yīng)，具有類似性質(zhì)的界面材料如氧化石墨烯、玻碳電極和介孔二氧化硅等。

Wan等［25］基于靶標(biāo)誘導(dǎo)的莖環(huán)探針（Stemloop probe，SLP）和表面引發(fā)的酶促聚合（Surface initiated enzymatic polymerization，SIEP）的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換開發(fā)了兩種電化學(xué)DNA傳感器。首先，通過金硫鍵將5′末端巰基標(biāo)記的探針（命名為5-SLP）和3′末端標(biāo)記的探針（命名為3-SLP）固定在金電極表面。在傳感器的初始狀態(tài)下，兩種探針均采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而避開捕獲探針未標(biāo)記的末端。當(dāng)探針與靶標(biāo)DNA雜交時(shí)，SLP被改變?yōu)閯傂噪p鏈，因此5-SLP釋放了可由TdT酶催化的3′-OH末端，而3-SLP由于3′-OH末端被巰基標(biāo)記，阻止了TdT酶的作用，使用信號探針與3-SLP的5′末端雜交并提供3′-OH。經(jīng)過TdT酶的末端延伸反應(yīng)后，通過使用天然dNTP和生物素化的2′-脫氧腺苷-5′-三磷酸（Biotinylated 2′-deoxyadenosine 5′-triphosphate，biotin-dATP）的混合物，將生物素標(biāo)記到長單鏈DNA中，然后使用抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶（Avidin-horseradish peroxidases，Av-HRPs）特異性結(jié)合生物素標(biāo)記以產(chǎn)生電化學(xué)信號，實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。3-SLP介導(dǎo)的傳感器靈敏度更高，可用來區(qū)分單個堿基錯配，可應(yīng)用于疾病相關(guān)DNA、microRNA和疾病相關(guān)蛋白的檢測。

圖1 5-SLP和3-SLP介導(dǎo)的生物傳感器實(shí)驗(yàn)原理圖［25］

2.2 TdT酶和核酸酶聯(lián)合介導(dǎo)的生物傳感器

由于TdT酶需在3′-OH端進(jìn)行延伸，所以要利用TdT酶可以延長核酸序列這一特點(diǎn)構(gòu)建生物傳感器時(shí)，可利用不同的工具酶對核酸進(jìn)行切割以產(chǎn)生3′-OH。能夠?qū)⒕酆塑账徭湹牧姿岫ユI切斷的酶，稱為核酸酶。不同來源的核酸酶，其專一性、作用方式都有所不同，根據(jù)核酸酶作用的位置不同，又可將核酸酶分為核酸外切酶和限制性內(nèi)切酶，能識別特定的核苷酸順序，并從特定位點(diǎn)水解核酸的內(nèi)切酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。核酸外切酶Ⅰ、核酸外切酶Ⅲ、核酸外切酶Ⅶ等核酸外切酶和限制性核酸內(nèi)切酶如EcoR Ⅰ、SmaⅠ、甲基化酶等都能切割核苷酸產(chǎn)生3′-OH端。

Wu等［24］將DNA分子探針的3′末端設(shè)計(jì)成為巰基的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，且分子探針設(shè)計(jì)成包含了能被DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶特異性識別的特定序列，通過金硫鍵的強(qiáng)結(jié)合作用，將探針固定在金電極表面，避免在空氣中有3′端裸露。當(dāng)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶存在時(shí)可將腺苷甲硫亮氨酸（SAM）上的甲基轉(zhuǎn)移到這個序列中腺嘌呤殘基上N6的位置上，形成的5′-G-Am-T-C-3′序列，該序列可被甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶Dpn I特異性識別并切割，在電極表面產(chǎn)生具有3′-OH末端的新探針。隨后，通過TdT酶介導(dǎo)的延伸將biotin-dUTP并入到新探針的3′-OH末端，再加入鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶（streptavidinalkaline phosphatase，SA-ALP）與新探針上的標(biāo)記生物素結(jié)合，ALP酶催化1-萘基磷酸酯（1-naphthyl phosphate，1-NP）水解，產(chǎn)生一個放大的電化學(xué)信號。在沒有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶時(shí)，不會產(chǎn)生電化學(xué)信號，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測。

Ma等［26］設(shè)計(jì)了在其3′末端被磷酸化的識別探針的發(fā)夾DNA，由于DNA探針在沒有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dam MTase）時(shí)不含游離的3′-OH官能團(tuán)，因此不能被TdT酶延長。在Dam MTase的存在下，它可以甲基化識別序列以產(chǎn)生作為DpnI底物的甲基化 DNA（5′-GmA-T-C-3′）。然后，DpnI將甲基化探針切割成含有兩個游離3′-OH末端的3個短的單鏈DNA片段，含有游離3′-OH末端的DNA片段可以被TdT酶延長。TdT酶生產(chǎn)的富含G的產(chǎn)品可以被硫代黃素T（Thioflavin T，ThT）染料迅速識別，產(chǎn)生高度特異性的熒光增強(qiáng)信號，以檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。

Xu等［27］開發(fā)了一種特異而靈敏的microRNA檢測方法，設(shè)計(jì)了一種與靶miRNA完全互補(bǔ)的3′-磷酸化的 DNA 探針（DNA-3′-PO3），由于該探針無3′-OH的ssDNA，所以不會被雙鏈特異性核酸酶（Duplex-specific nuclease，DSN）切割及TdT酶識別。當(dāng)靶標(biāo)存在的情況下，DNA-3′-PO3將與miRNA雜交形成雙鏈體，可被DSN酶識別。由于DSN酶只切割DNA / RNA雙鏈體中的DNA，目標(biāo)miRNA可被釋放與另一個DNA-3′-PO3探針雜交，同時(shí)，可以在目標(biāo)循環(huán)反應(yīng)后收集帶有3′-OH的DNA片段作為TdT酶的引物，形成的超長多T尾的2′-脫氧胸苷5′-三磷酸（dTTP）與Cu2+結(jié)合形成聚（胸腺嘧啶）銅納米粒子（poly（thymine）-hosted copper nanoparticle，poly T-CuNps），產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。

3 TdT酶介導(dǎo)的四聯(lián)體生物傳感器

3.1 C-四聯(lián)體生物傳感器

Lu等［28］使用 TdT 酶在富含胞嘧啶（Cytosine，C）的dNTP（60% dCTP，40% dTTP）庫將引物延伸成富含C的DNA序列，并且富含C的序列可以折疊成i-基序，i-基序是非規(guī)范的DNA二級結(jié)構(gòu)，其由兩個平行雙鏈體通過插入的C-C+堿基對氫鍵合在一起組成。新生的富含C的寡核苷酸序列將在酸性條件下折疊成i-基序結(jié)構(gòu)，然后可被具有增強(qiáng)發(fā)光響應(yīng)的發(fā)光Ir（III）絡(luò)合物識別，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號，原理如圖2-A所示。因此，該系統(tǒng)可以用作TdT酶活性測定的接通發(fā)光檢測平臺，與傳統(tǒng)的生物化學(xué)或免疫學(xué)測定相比，這種無標(biāo)記的基于i-基序的發(fā)光接通平臺相對簡單且成本較低。

3.2 G-四聯(lián)體生物傳感器

Leung等［29］基于銥（iridium，Ir）（III）與 G-四聯(lián)體結(jié)合能夠形成增強(qiáng)發(fā)光響應(yīng)的復(fù)合物這一性質(zhì)，開發(fā)了無標(biāo)記與結(jié)構(gòu)無關(guān)的傳感平臺。實(shí)驗(yàn)原理如圖2-B所示，在靶標(biāo)不存在的情況下，適配體將在3′-5′方向上被核酸外切酶（Exonucleautomotive，ExoI）消化，被切割成很多單核苷酸。因此，TdT酶將不能使核苷酸鏈延伸產(chǎn)生G-四聯(lián)體序列并且由于Ir（III）配合物的背景發(fā)射弱，所以系統(tǒng)的發(fā)光將會很弱。但是，增加了目標(biāo)誘導(dǎo)適體折疊成抗ExoI消化的二級結(jié)構(gòu)，在由60% dGTP和40%dATP組成的dNTP庫的存在下，加入0.33 U/μL TdT酶在37℃反應(yīng)1 h后即可將DNA寡核苷酸延伸成隨機(jī)的富含鳥嘌呤的序列，在加入K+離子后，DNA將被誘導(dǎo)成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，隨后被G-四聯(lián)體選擇性Ir（III）復(fù)合物識別并具有強(qiáng)烈的發(fā)光響應(yīng)。該傳感平臺不需要適體的特定二級結(jié)構(gòu)，因此極大地簡化了DNA的設(shè)計(jì)步驟。

4 TdT酶介導(dǎo)的金屬納米簇生物傳感器

金屬納米簇是由幾個至幾十個原子組成的具有熒光性、水溶性的分子級聚集體。它因特有的量子尺寸效應(yīng)、光穩(wěn)定性強(qiáng)、反聚合能力強(qiáng)、生物相容性好等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器、新型催化劑、腫瘤細(xì)胞的檢測及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域［30-32］。

4.1 銀納米簇生物傳感器

圖2 TdT酶介導(dǎo)的四聯(lián)體生物傳感器實(shí)驗(yàn)原理圖［28-29］

Yuan等［33］利用Ag+與胞嘧啶之間的特異性相互作用強(qiáng)于其他3種堿基，在dCTP存在下，TdT酶催化脫氧核苷酸的重復(fù)添加以延長DNA引物的3′-OH末端，并因此產(chǎn)生富含胞嘧啶的長單鏈DNA模板。長鏈富含胞嘧啶的DNA可以作為寡核苷酸封裝的銀納米簇的合成模板，合成的DNA-AgNCs發(fā)出強(qiáng)烈的熒光（圖3-A）。根據(jù)這一性質(zhì)，可構(gòu)建檢測核酸酶活性的新型生物傳感系統(tǒng)。Hu等［34］基于氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）支持的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶生成的富含胞嘧啶的DNA納米微粒模板化銀納米簇（DNA nanotailtemplated silver nanoclusters，DNA-AgNCs）的獨(dú)特電催化活性，建立了一種新型的無標(biāo)記的生物傳感器。在dCTP存在下，TdT酶催化脫氧核苷酸的重復(fù)添加以延長DNA引物的3′-OH末端，并且生長的富含胞嘧啶的DNA可用于制備具有銀原子的胞嘧啶堿基的DNAAgNCs，可吸附在GO修飾的玻碳電極（GO-modified glassy carbon electrodes，GO/GCE）上，對H2O2還原具有較高的電催化活性，能夠?qū)崿F(xiàn)良好的電化學(xué)信號輸出。該方法為TdT酶活性檢測及其相關(guān)抑制劑篩選提供了一種簡便的方法，由于其具有較高的靈敏度和優(yōu)異的選擇性，因此在基于TdT酶的生物化學(xué)研究、疾病診斷和藥物發(fā)現(xiàn)的實(shí)際應(yīng)用中具有很大的潛力。

4.2 銅納米簇生物傳感器

Zhou等［35］在引物和底物脫氧核糖核苷酸三磷酸（dNTP）存在下，TdT酶催化重復(fù)添加dNTP以延長DNA引物的3′-OH末端并因此產(chǎn)生長DNA序列，37℃孵育2.5 h后所得到的DNA可以用作合成熒光CuNCs的模板。因此，可以通過熒光的強(qiáng)度反映TdT酶的活性。實(shí)驗(yàn)還得出當(dāng)?shù)孜锍赜?0% dATP和50% dTTP組成時(shí)，相應(yīng)的聚合產(chǎn)物是用于合成熒光CuNCs的最佳模板。Zhang等［36］使用獨(dú)立于模板的DNA聚合酶-TdT酶，在單鏈DNA（ssDNA）的3′-OH末端連續(xù)添加脫氧胸苷三磷酸（deoxythymidine Triphosphate，dTTP）37℃孵育2 h即可產(chǎn)生長的富含T的DNA納米線，該納米線可作為模板用來形成DNA銅納米簇（DNA nanowirestemplated copper nanoclusters，DNA-CuNCs），通過非共價(jià) π-π 堆積作用自組裝到GO-修飾的玻碳電極（GO/GCE）表面上來建立電化學(xué)測定，可以催化H2O2的還原，產(chǎn)生與TdT酶量成比例的強(qiáng)電化學(xué)信號，這種新的生物傳感策略對于進(jìn)一步開發(fā)基于CuNCs的生物傳感器具有積極作用，實(shí)驗(yàn)原理如圖3-B所示。。

4.3 金納米簇生物傳感器

Hu等［37］開發(fā)了一種基于TdT酶和DNA金納米 簇（Nucleic acid functionalized Au nanoparticles，DNA-AuNPs）的“樹枝狀”信號放大的無標(biāo)記電化學(xué)生物傳感器，用于DNA的檢測。制備過程具有3步放大：首先，“主干”（富含T的長序列）通過引入脫氧胸腺嘧啶三磷酸（Deoxythymine triphosphate，dTTP）作為底物池來構(gòu)建，這一過程需在37℃下反應(yīng)1 h；其次，將由poly-A DNA功能化的AuNPs與上述“主干”雜交，30 min后可形成更多的枝放大信號；最后，使用dATP∶dGTP=4∶6的混合dNTPs通過TdT酶使AuNPs上的核酸延伸，這種隨機(jī)形成的包含豐富G的DNA序列可以通過Pb2+誘導(dǎo)在室溫下形成G-四聯(lián)體，三苯基甲烷染料結(jié)晶紫（Crystal violet，mCV）可與G-四聯(lián)體特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)電信號輸出，實(shí)驗(yàn)原理如圖3-C所示。作者還將3步放大法與直接形成G-四聯(lián)體的一步信號放大法進(jìn)行對比，這種新型無標(biāo)記多步放大電化學(xué)DNA傳感器與單步放大實(shí)驗(yàn)相比具有更低的檢測限。

圖3 TdT酶介導(dǎo)的金屬納米簇實(shí)驗(yàn)原理圖［33，36-37］

5 TdT酶介導(dǎo)的電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)方法可以快速的分析酶活性，基于TdT酶介導(dǎo)的延伸策略，可以建立簡單且高效的電化學(xué)測定法，用于敏感且無標(biāo)記的DNA相關(guān)酶活性檢測。Hu和 Zhang等［33，35］證明了原位生長的 DNA 納米模板AgNCs和CuNCs可以吸附在GO修飾電極上，對H2O2還原具有較高的電催化活性，為電化學(xué)傳感器的構(gòu)建提供良好的輸出信號。由于TdT酶可使dNTP延伸，吸附金屬離子產(chǎn)生金屬納米簇，因此可以利用以上兩種性質(zhì)進(jìn)行電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建。

Wei等［38］利用了三重級聯(lián)信號放大效應(yīng)設(shè)計(jì)了用于檢測 Pb2+的電化學(xué)脫氧核酶（DNA enzyme，DNAzyme）傳感器。當(dāng)存在靶標(biāo)Pb2+時(shí)，3′端磷酸化的DNAzyme催化DNA 序列（8-17 E）被激活，且雙巰基功能化發(fā)夾（HP）底物鏈可以被切割以暴露3′-OH，可以被TdT酶催化將生物素標(biāo)記的dUTP依次添加到底物鏈的3′-OH 端。用牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）封閉后，鏈霉親和素標(biāo)記的5 μg/mL的20 μL堿性磷酸酯酶（SA-ALP）通過其與生物素的親和作用連接到電極上，ALP催化1-萘基磷酸酯（1-NP）生成電活性物質(zhì)1-萘酚，產(chǎn)生電化學(xué)信號，實(shí)現(xiàn)對Pb2+的靈敏檢測，最低檢測限為0.043 nmol/L，當(dāng)不存在Pb2+時(shí)，電化學(xué)響應(yīng)較弱。

6 TdT酶介導(dǎo)的光學(xué)生物傳感器

6.1 熒光生物傳感器

Liu等［21］通過TdT酶聚合制備富含G的隨機(jī)DNA序列，并證明了這種隨機(jī)富含G的DNA能夠形成G-四聯(lián)體，通過實(shí)驗(yàn)得出當(dāng)dNTP池中有60%dGTP和40% dATP時(shí)G-四聯(lián)體活性最高。此外，這些G-四聯(lián)體可以結(jié)合到氯化血紅素上以形成過氧化物酶模擬脫氧核酶，并與G-四聯(lián)體特異性染料產(chǎn)生熒光配合物。基于以上原理Liu等研發(fā)了兩種檢測簡單且無標(biāo)記的檢測TdT酶活性的策略，包括基于脫氧核糖核酸酶的比色測定法和實(shí)時(shí)熒光測定法，后者的檢測限為0.05 U。該實(shí)驗(yàn)的實(shí)時(shí)檢測方法為臨床診斷中關(guān)鍵酶的生化分析提供了一種可行的方法，且操作相對傳統(tǒng)方法更加簡便。

6.2 可視化生物傳感器

Tian等［39］基于多重超聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Multiplex super polymerase chain reaction，MS-PCR） 和 不 對稱尾部雜交鏈反應(yīng)（Asymmetric tailing hybridization chain reaction，AT-HCR）開發(fā)并驗(yàn)證了超靈敏的比色雙重檢測病原體的方法。實(shí)驗(yàn)采用20 U/L的TdT酶催化ssDNA尾部的延伸，孵育60 min后與hemin形成G-四聯(lián)體DNA核酶，表現(xiàn)出辣根過氧化物酶（HRP）模擬酶的活性，新形成的脫氧核酶可以通過H2O2催化ABTS2-變?yōu)榫G色的ABTS·-，該方法可直接進(jìn)行可視化分析，且靈敏度較高用時(shí)較短。

Miao等［40］開發(fā)了一種新的比色性DNA酶納米線傳感器，用于靈敏和選擇性定量測定脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS），其用肉眼觀察的半定量極限可達(dá)20 ng/mL。在存在LPS的情況下，適體-引發(fā)劑（Aptamer-Initiator，AI）的一端的LPS-適體與LPS形成LPS/適體復(fù)合物，AI另一端的引發(fā)劑開始通過HCR交替打開H1和H2。此外，在HCR過程之后，TdT酶誘導(dǎo)的G-四聯(lián)體DNA核酶沿著帶切口的超dsDNA多聯(lián)體納米線自組裝。氯化血紅素（Hemin）作為嵌入G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)中的配體形成辣根過氧化物酶（Horse Radish Peroxidase，HRP）模擬DNA酶，催化過氧化氫（H2O2）/ TMB產(chǎn)生明顯的亮黃色。在不到2 h時(shí)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了比色反應(yīng)，檢測到的LPS濃度可低至100 pg/mL，它也可以靈活地轉(zhuǎn)化為其他適配子識別的非核酸靶標(biāo)，如離子、蛋白質(zhì)、生物分子和細(xì)胞等，具有廣闊的應(yīng)用前景。

Zhang等［41］開發(fā)了一種無標(biāo)記、高通量的生物發(fā)光方法，通過酶介導(dǎo)的三環(huán)級聯(lián)信號放大來靈敏檢測尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil DNA Glycosylase，UDG），此法高靈敏度，檢測限低至0.000 31 U/mL。在UDG的存在下，DNA雙鏈體中的一條鏈可產(chǎn)生嘌呤/脫嘧啶（Apurinic/apyrimidinic，AP）位點(diǎn)，可被嘌呤/嘧啶核酸內(nèi)切酶（Apurinic/apyrimidinic endonuclease，APE1）切割，得到帶有游離3′-OH末端的DNA片段可啟動TdT酶介導(dǎo)的聚合反應(yīng)，在dTTPs存在下產(chǎn)生長的富含T的序列。再用富含A的輔助探針，通過T7 核酸外切酶（T7 Exonuclease，T7Exo）從其5′末端特異性降解以釋放大量的AMP和dAMP，在磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）和dCTP存在下腺苷酸激酶（Adenylate kinase，AK）和丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）酶促反應(yīng)的組合將釋放的AMP轉(zhuǎn)化成ATP，并且隨后將ATP轉(zhuǎn)化成AMP產(chǎn)生強(qiáng)烈的生物發(fā)光信號。

7 TdT酶介導(dǎo)的表面離子共振生物傳感器

Yuan等［42］進(jìn)行了基于高效表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）的DNA檢測研究，兒茶酚紫（Catechol violet，CV）能夠聚合成寡聚物或與金屬離子螯合，實(shí)驗(yàn)中CV與dsDNA-復(fù)合的銅納米簇（CuNPs @ dsDNA）結(jié)合或形成寡聚體，引起顯著的質(zhì)量增加并作為提高SPR響應(yīng)，通過原位合成由聚-T序列dsDNA模板化的CuNPs并與納米效應(yīng)沉積協(xié)同地開發(fā)了新的SPR-DNA傳感器。首先，tDNA與探針雜交，以將TdT酶介導(dǎo)的DNA延伸活化到SPR芯片的表面上，從而在雙鏈DNA末端到金芯片表面形成長的poly-T序列ssDNA鏈，并通過與優(yōu)化的探針雜交產(chǎn)生巨大的SPR響應(yīng)。然后，在單鏈核苷酸鏈上同步產(chǎn)生的CuNPs錨定在dsDNA衍生物中，導(dǎo)致明顯的SPR信號擴(kuò)大。最后，CuNPs@ dsDNA通過添加CV和H2O2觸發(fā)沉淀的實(shí)時(shí)轉(zhuǎn)化，以實(shí)現(xiàn)最終的信號放大。

8 總結(jié)與展望

目前基于TdT酶輔助的信號放大策略，構(gòu)建得到了一系列簡單靈敏的功能核酸生物傳感器，其顯著的優(yōu)勢在于TdT酶利用脫氧核苷酸在3′羥基末端延伸時(shí)不需要特定的模板，具有普遍適用性；其次，經(jīng)TdT酶延伸形成的信號輸出產(chǎn)物多樣，可以實(shí)現(xiàn)多種模式的信號輸出，滿足不同的生物傳感器需求。更重要的是，由于TdT酶獨(dú)特的性質(zhì)其介導(dǎo)的生物傳感器檢出限相對較低，可顯著提高檢測的靈敏度。

現(xiàn)今對TdT酶的生物傳感器研究仍屬于初級階段，還存在一些問題亟待解決，要想使其得到更廣泛的應(yīng)用，則需對TdT酶的核心特征即可以不依賴于模板聚合的具體生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究，確定其空間構(gòu)象結(jié)構(gòu)與功能發(fā)揮的關(guān)系，便于進(jìn)一步從合成生物學(xué)的角度來提升酶活及改造酶的特性。目前TdT酶介導(dǎo)的生物傳感器大多是對單一物質(zhì)進(jìn)行檢測，在今后的研究中如何利用TdT酶的性質(zhì)將TdT酶介導(dǎo)的生物傳感器與其他類型的傳感器相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)多種靶物質(zhì)的同時(shí)快速檢測，將成為未來研究的主要方向。另外，TdT酶與功能核酸聯(lián)合介導(dǎo)的生物傳感器的設(shè)計(jì)相對簡單，且構(gòu)建方便，人們可以充分利用不同功能核酸的性質(zhì)發(fā)揮功能核酸的優(yōu)勢，結(jié)合TdT酶的信號放大功能，使TdT酶介導(dǎo)的功能核酸生物傳感器應(yīng)用于更多的領(lǐng)域，如快速檢測領(lǐng)域?？焖贆z測即在采樣現(xiàn)場即刻進(jìn)行分析，省去標(biāo)本在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)時(shí)的復(fù)雜處理程序，快速得到檢驗(yàn)結(jié)果的一類方法，由于其耗時(shí)短，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛的應(yīng)用到各種檢測領(lǐng)域，要想使TdT酶在快速檢測領(lǐng)域得到應(yīng)用，則應(yīng)需尋找一種方法封閉酶的活性以便于酶的貯存和運(yùn)輸。