張洋子 朱龍佼 邵向麗 許文濤，2

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

點(diǎn)擊化學(xué)（Click chemistry）又譯為鏈接化學(xué)，自2001年由化學(xué)家Sharpless，Kolb及Finn首次提出以來受到越來越多的關(guān)注，其目的是開發(fā)一系列強(qiáng)大，高度可靠，具有選擇性和模塊化，并通過碳-雜原子鍵（C-X-C）的連接能夠快速合成有用的新化合物和組合化學(xué)庫的反應(yīng)［1-2］。點(diǎn)擊反應(yīng)的特點(diǎn)主要包括反應(yīng)的起始原料和試劑易獲??；反應(yīng)條件簡單溫和，對氧、水不敏感；只產(chǎn)生無害副產(chǎn)物（或者可以通過非色譜方法去除）等。此外，點(diǎn)擊反應(yīng)的實(shí)現(xiàn)需要依靠高熱力學(xué)驅(qū)動力（＞20 kcal/mol），這也是用于識別點(diǎn)擊反應(yīng)的一大特征［1］。目前點(diǎn)擊化學(xué)幾乎滲透進(jìn)現(xiàn)代化學(xué)、生物學(xué)的各個方面，其應(yīng)用范圍從生物標(biāo)記、物質(zhì)表面功能化、生物分子的固定到藥物化學(xué)、材料科學(xué)、高分子科學(xué)等，促進(jìn)了多領(lǐng)域交叉學(xué)科的快速發(fā)展。

點(diǎn)擊反應(yīng)的分類方式有多種，按照加成反應(yīng)的類型大致可分為四類，包括環(huán)加成反應(yīng)，如1，3-偶極-環(huán)加成反應(yīng)（CuAAC）和狄爾斯-阿爾德（Diels-Alder）反應(yīng)；親核開環(huán)反應(yīng)，如環(huán)氧化物、氮丙啶和環(huán)狀硫酸酯等發(fā)生的反應(yīng)；非醇醛的羰基化反應(yīng)，如肟醚，腙和芳香族雜環(huán)的形成；碳-碳多重鍵加成反應(yīng)，如環(huán)氧化反應(yīng)和二羥基化反應(yīng)，以及疊氮-膦的偶合反應(yīng)，如施陶丁格連接［3］。此外，點(diǎn)擊反應(yīng)還可以簡單分為金屬催化的點(diǎn)擊反應(yīng)，如CuAAC等，以及無金屬催化的點(diǎn)擊反應(yīng)，如施陶丁格連接和環(huán)張力促進(jìn)的疊氮-炔烴環(huán)加成反應(yīng)（SPAAC）等。CuAAC又稱為Husigen［3+2］疊氮-炔烴環(huán)加成反應(yīng)，是目前使用最廣泛的點(diǎn)擊反應(yīng)。事實(shí)上，無催化劑參與的環(huán)加成反應(yīng)早在1963年已由Husigen發(fā)現(xiàn)，但由于反應(yīng)需要在高溫高壓下進(jìn)行，條件苛刻，未被廣泛利用。Sharpless及其團(tuán)隊將銅（I）作為催化劑參與反應(yīng)后，該反應(yīng)可在溫和的條件下進(jìn)行，同時提升了反應(yīng)速率［3］。然而該反應(yīng)的最大局限性在于無法用于生物學(xué)系統(tǒng)中，因?yàn)殂~（I）具有潛在的細(xì)胞毒性，純化較難，體內(nèi)攝入過量時會產(chǎn)生副作用引發(fā)疾病，如肝炎、阿爾茲海默病及神經(jīng)紊亂等［2］。因此，現(xiàn)在無金屬催化的點(diǎn)擊反應(yīng)，如施陶丁格連接，狄爾斯-阿爾德反應(yīng)等，受到越來越多的關(guān)注。

施陶丁格反應(yīng)作為無金屬催化的點(diǎn)擊反應(yīng)代表，在各種復(fù)雜的生物系統(tǒng)以及體外檢測中都扮演著重要的角色。目前，施陶丁格連接已廣泛應(yīng)用于材料表面功能化、各種生物大分子的合成包括功能聚合物合成和樹枝狀化合物合成、生物標(biāo)記如聚糖、脂類、DNA 和蛋白質(zhì)的標(biāo)記等方面。同時，在靶物質(zhì)遞送，特別是藥物的合成與遞送及生物傳感器等方面的應(yīng)用具有較大發(fā)展空間。生物傳感器是將固定化的生物敏感材料，包括生物體本身，如細(xì)胞、微生物、組織等以及生物成分，如酶、蛋白質(zhì)、DNA等作為識別原件，利用其敏感特性與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)檢測器相結(jié)合產(chǎn)生的一種快速檢測各種物理、化學(xué)和生物量的分析工具［4］。首先，敏感材料能夠特異地選擇性識別目標(biāo)物，而檢測器則是捕捉二者之間的作用過程，隨后將反應(yīng)的程度轉(zhuǎn)化成電信號，通過對電信號的檢測從而推算出目標(biāo)物的量［4］。多種點(diǎn)擊反應(yīng)已廣泛應(yīng)用于生物傳感器中，從而實(shí)現(xiàn)其功能的多樣化。因此，本文主要圍繞無金屬催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)——施陶丁格連接進(jìn)行綜述，詳細(xì)介紹了施陶丁格連接的反應(yīng)機(jī)理、影響反應(yīng)動力學(xué)、連接產(chǎn)率以及反應(yīng)進(jìn)程的多種因素，及其介導(dǎo)的生物標(biāo)記技術(shù)。在此基礎(chǔ)上，針對不同靶物質(zhì)論述了施陶丁格連接介導(dǎo)的生物傳感相關(guān)應(yīng)用，包括核酸、小分子熒光生物傳感器；細(xì)胞成像技術(shù)在核酸、聚糖中的應(yīng)用；以及藥物合成與遞送中的應(yīng)用。最后預(yù)測了施陶丁格連接未來的發(fā)展方向以及在生物傳感中的應(yīng)用前景。

1 施陶丁格連接機(jī)理及性質(zhì)

1919年Staudinger和Meyer發(fā)現(xiàn)并提出了有機(jī)疊氮化物與膦之間發(fā)生的經(jīng)典施陶丁格還原反應(yīng)。其中，反應(yīng)物膦是磷化氫（PH3）分子中的氫原子全部或部分被烴基取代而形成的一類化合物，如三烷基膦或三苯基膦（TPP）常用于施陶丁格連接反應(yīng)。如圖1-A所示，疊氮化物與TPP反應(yīng)首先釋放氮?dú)馍芍虚g體膦亞胺，隨后在水溶液中自發(fā)水解生成伯胺和穩(wěn)定的三苯基氧化膦（TPPO）［2，5-6］。這一反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)在于能夠在溫和條件下幾乎定量地進(jìn)行，同時沒有明顯的副產(chǎn)物形成，常用于有機(jī)合成以引入胺［5-6］。

2000 年，Saxon 和 Bertozzi［7］發(fā)現(xiàn)了施陶丁格還原反應(yīng)作為生物偶聯(lián)方法的潛力并進(jìn)行了改進(jìn)，即在反應(yīng)物之間設(shè)計了一種能夠選擇性生成酰胺鍵的化學(xué)連接，稱為施陶丁格連接。同年，Raines小組［8］和Bertozzi［9］小組同時報道了一種特殊的施陶丁格連接，其中Raines小組［8］將施陶丁格連接應(yīng)用于肽片段的連接, 反應(yīng)能夠生成一個天然的酰胺鍵且連接產(chǎn)物中不含殘留的氧化膦, 這就是無痕施陶丁格連接。施陶丁格連接的反應(yīng)機(jī)理與經(jīng)典的還原反應(yīng)不同，經(jīng)改進(jìn)后通過分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)利用位于反應(yīng)物中膦原子鄰位的酯構(gòu)建TPP作為親電子捕獲劑，從而能夠在水溶液條件下捕獲親核的氮雜內(nèi)鎓鹽中間體作為酰胺，因此實(shí)現(xiàn)了兩個分子的共價“結(jié)合”［2，10-12］（圖 1-B）。無痕施陶丁格連接則是在施陶丁格連接的基礎(chǔ)上的進(jìn)一步改進(jìn)，其“無痕”體現(xiàn)在水解步驟中生成酰胺鍵的同時從最終產(chǎn)物中除去TPPO（圖1-C）。這一連接反應(yīng)由于能夠形成天然酰胺鍵而成為替代化學(xué)連接的強(qiáng)有力的肽段連接工具［2，5-6］。

施陶丁格連接是一種具有生物正交特性的反應(yīng)。生物正交反應(yīng)是指在生命系統(tǒng)中能夠在不干擾生物自身生化過程的前提下進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)［10］。其應(yīng)具備以下3個要素：反應(yīng)必須在水溶液中發(fā)生；參與反應(yīng)的催化劑或反應(yīng)物無毒；最重要的一點(diǎn)是兩個功能基團(tuán)不存在于生物系統(tǒng)中并且不與生物系統(tǒng)中的任何功能化基團(tuán)發(fā)生交叉反應(yīng)。同時，生物正交反應(yīng)還應(yīng)具有點(diǎn)擊反應(yīng)的特性，包括反應(yīng)動力學(xué)快，產(chǎn)率高，無多余副產(chǎn)物，溶劑適配性高以及反應(yīng)起始材料易獲取等［2］。因此，生物正交這一概念是對點(diǎn)擊化學(xué)的延伸，拓寬了施陶丁格連接在各種復(fù)雜的生物系統(tǒng)中的應(yīng)用［6］。

圖1 施陶丁格連接反應(yīng)機(jī)制

2 施陶丁格連接反應(yīng)的影響因素

施陶丁格連接具有生物正交性，能夠在室溫、水溶液中，無需金屬離子催化等溫和條件下發(fā)生反應(yīng)。然而，其反應(yīng)動力學(xué)、連接產(chǎn)率以及反應(yīng)進(jìn)程同樣會受到多種物理及化學(xué)因素的影響，如反應(yīng)體系中溶劑的極性、反應(yīng)物中功能基團(tuán)的位置與結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、pH及水溶性等，通過優(yōu)化這些影響因素能夠進(jìn)一步促進(jìn)施陶丁格連接更加高效的進(jìn)行。

施陶丁格連接的速率常數(shù)范圍在（1.8-2.2）×10-3m-1s-1之間，無痕施陶丁格的反應(yīng)速率常數(shù)變化范圍為（0.12-7.7）×10-3m-1s-1，這與CuAAC最高能達(dá)到的反應(yīng)速率常數(shù)104m-1s-1比相差很多［11-12］。因此，施陶丁格連接在反應(yīng)動力學(xué)上受到限制，反應(yīng)速率較慢。施陶丁格還原反應(yīng)的動力學(xué)研究表明反應(yīng)屬于一級動力或者二級動力反應(yīng)取決于反應(yīng)物的性質(zhì)。Lin等［13］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了限制施陶丁格連接反應(yīng)速率與限制施陶丁格還原反應(yīng)速率的步驟相似，均為反應(yīng)的初始階段，即膦上的孤對電子進(jìn)攻疊氮化物中的末端氮原子從而生成膦基疊氮化物的過程。大部分影響因素會作用于這一限速步驟，從而實(shí)現(xiàn)對整個反應(yīng)速率的影響。

另一方面，膦基疊氮化物發(fā)生分子內(nèi)重排形成中間體膦亞胺，這一中間體之后的反應(yīng)路徑將直接影響施陶丁格連接產(chǎn)物及其生成率。若一部分中間體膦亞胺被消耗進(jìn)行施陶丁格還原反應(yīng)，在水溶液中水解生成氧化膦和胺，將直接減少能繼續(xù)發(fā)生連接反應(yīng)的膦亞胺含量，也就意味著連接產(chǎn)率的降低，產(chǎn)物的減少［13］。因此，反應(yīng)影響因素對產(chǎn)率的影響主要表現(xiàn)在是否促進(jìn)反應(yīng)向著施陶丁格連接的方向進(jìn)行。

2.1 反應(yīng)體系中溶劑極性對反應(yīng)速率的影響

一般情況下，極性大的溶劑有助于加快施陶丁格連接限速步驟的反應(yīng)速率。Lin等［13］發(fā)現(xiàn)限速步驟處于一種極性過渡狀態(tài)，能夠通過極性溶劑穩(wěn)定。因此，在具有較高介電常數(shù)的溶劑中反應(yīng)能進(jìn)行的更快。然而也有特殊情況存在。例如，CD3OD和CD3CN的介電常數(shù)大小相似，但前者施陶丁格連接的反應(yīng)速率常數(shù)遠(yuǎn)大于后者。這說明溶劑還能夠通過氫鍵或其它直接的相互作用對限速步驟的過渡狀態(tài)進(jìn)行穩(wěn)定。此外，不同溶劑中水的比例變化也會對限速步驟的反應(yīng)速率造成影響。

2.2 反應(yīng)物中功能基團(tuán)位置與結(jié)構(gòu)對反應(yīng)速率及產(chǎn)率的影響

膦和疊氮化物是發(fā)生施陶丁格連接的兩個要素。膦的結(jié)構(gòu)和位置會通過空間位阻和電子修飾對施陶丁格連接反應(yīng)速率及產(chǎn)率產(chǎn)生影響。Lin等［13］合成了一組三苯基膦，并分別將多種取代基直接連接在磷原子對位的其中一個苯基上。利用哈密特圖分析了反應(yīng)速率與反應(yīng)中心電荷變化的情況，結(jié)果表明直接與磷原子相連的供電子取代基會加速這一反應(yīng)。與此同時，在合成的另一組不同結(jié)構(gòu)的三苯基膦中一個苯基上連有酯基（-COOR），分別由甲基、乙基、異丙基以及叔丁基取代（即R=Me，Et，i-Pr和t-Bu）。當(dāng)與疊氮化物發(fā)生施陶丁格連接反應(yīng)時，酯基會發(fā)生斷裂，形成連有不同取代基（R）的酯離去基團(tuán)。研究結(jié)果顯示，不同的酯離去基團(tuán)對總體反應(yīng)速率沒有顯著影響，但會影響產(chǎn)物比率。較小的酯離去基團(tuán)，如甲基，乙基或異丙基等，反應(yīng)后只觀察到施陶丁格連接產(chǎn)物，而當(dāng)離去基團(tuán)對空間要求更高時，如叔丁基，除了連接產(chǎn)物外，還會有顯著量的膦亞胺水解產(chǎn)物氧化膦產(chǎn)生，從而降低了施陶丁格連接的產(chǎn)率。

此外，對疊氮化物結(jié)構(gòu)的優(yōu)化同樣會影響施陶丁格連接的反應(yīng)動力學(xué)。Lin等［13］發(fā)現(xiàn)芳基疊氮化物對反應(yīng)速率的影響取決于分子內(nèi)酰胺鍵形成的步驟，而不是生成膦基疊氮化物的初始反應(yīng)。最新研究顯示，全氟芳基疊氮化物（PFAAs）和芳基膦之間能夠發(fā)生快速的施陶丁格反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)表明PFAA施陶丁格反應(yīng)在CD3CN/D2O（1∶1）中反應(yīng)速率常數(shù)達(dá)到18 m-1s-1，同時證明了該反應(yīng)是很好的生物正交反應(yīng)，能夠在細(xì)胞環(huán)境中應(yīng)用［14］。

2.3 反應(yīng)物中功能基團(tuán)pH對反應(yīng)速率及產(chǎn)率的影響

有研究指出施陶丁格連接的產(chǎn)物生成率會受到反應(yīng)物pH的影響。Tam等［15］在合成蛋白質(zhì)的研究中首先合成了硫代膦硫酯（4），并通過對巰基脫保護(hù)進(jìn)一步形成酸性膦硫醇（2），利用13C Nuclear Magnetic Resonance（NMR）技術(shù)對（2）介導(dǎo)的無痕施陶丁格連接的反應(yīng)能力進(jìn)行監(jiān)控。如圖2所示，酸性膦硫醇（2）介導(dǎo)的反應(yīng)，其生成物的產(chǎn)量很大程度上依賴于混合反應(yīng)物，即疊氮化物與硫代膦酸酯（4）的pH。在pH為堿性的情況下產(chǎn)率增大，但同樣會導(dǎo)致硫酯的水解反應(yīng)加速進(jìn)行，因此二者無法兼得。經(jīng)優(yōu)化后，在中性pH附近進(jìn)行（2）介導(dǎo)的無痕施陶丁格連接反應(yīng)最理想。

受此啟發(fā)，研究人員發(fā)現(xiàn)參與施陶丁格連接反應(yīng)的關(guān)鍵原子必須是未質(zhì)子化的，特別是中間體膦亞胺中的氮原子，在質(zhì)子性溶劑中易被質(zhì)子化而促使反應(yīng)向著施陶丁格還原反應(yīng)的方向進(jìn)行最終生成胺和氧化膦。因此，利用分子內(nèi)庫侖相互作用來調(diào)節(jié)中間體膦亞胺的酸度，合成了一種新型堿性膦硫醇，即（對二甲基氨基乙基）膦基甲硫醇（3）。在對（3）介導(dǎo)無痕施陶丁格反應(yīng)的能力進(jìn)行評估時發(fā)現(xiàn)，與（2）相同，產(chǎn)物酰胺的量取決于疊氮化物與對應(yīng)的硫代膦酸酯（5）的pH，產(chǎn)量隨著pH值的升高而增大。然而，在堿性條件下，產(chǎn)率依然能達(dá)到94%。同時還發(fā)現(xiàn)，在各pH下，堿性膦硫醇（3）的連接產(chǎn)率遠(yuǎn)高于酸性膦硫醇（2）的連接產(chǎn)率［15］。由此可以看出，反應(yīng)物中功能基團(tuán)pH的高低會直接影響施陶丁格連接的反應(yīng)產(chǎn)率。

2.4 反應(yīng)物中功能基團(tuán)水溶性對反應(yīng)產(chǎn)率的影響

功能基團(tuán)的水溶性也是影響施陶丁格連接反應(yīng)的重要因素。事實(shí)上，在施陶丁格連接應(yīng)用的初期，特別是在無痕施陶丁格連接的研究中，大多數(shù)反應(yīng)是在有機(jī)溶劑或者有機(jī)溶劑與水溶液的混合物中進(jìn)行的。為了保證施陶丁格連接的生物正交性，Tam等［15］首次實(shí)現(xiàn)了在水溶液中發(fā)生無痕施陶丁格連接反應(yīng)。研究人員開發(fā)的堿性膦硫醇（3）具有良好的水溶性，與另外兩種酸性膦硫醇（1）和（2）相比，這種水溶性膦硫醇結(jié)構(gòu)上包含二甲基氨基，不但能大大提高水溶性，而且還能阻止中間體膦亞胺中氮的質(zhì)子化，促進(jìn)反應(yīng)在水溶液中向著生成酰胺鍵而非直接水解成氧化膦的方向進(jìn)行（圖2）。

2.5 反應(yīng)物中功能基團(tuán)穩(wěn)定性對反應(yīng)進(jìn)程的影響

與點(diǎn)擊化學(xué)家族中的其他反應(yīng)相比，尤其是CuAAC，施陶丁格連接的應(yīng)用仍未十分廣泛，主要受到反應(yīng)物膦穩(wěn)定性的制約，如三烷基膦/三苯基膦容易被空氣、二硫鍵和單線態(tài)氧氧化。目前，已有相關(guān)研究通過改善反應(yīng)機(jī)制去避免膦被氧化對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。Hangauer 和Bertozzi［16］研究設(shè)計了一個基于分子內(nèi)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光淬滅的膦探針。膦-熒光團(tuán)偶聯(lián)物通過酯鍵連接FRET淬滅劑而不發(fā)熒光，在與疊氮化物反應(yīng)后，酯鍵斷開，淬滅劑被釋放并開啟熒光。因此該探針已成功用于在活細(xì)胞中對疊氮化物官能化的聚糖進(jìn)行成像。因此，運(yùn)用類似方法對反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行改良從而巧妙地避免反應(yīng)物膦被氧化。

3 施陶丁格連接介導(dǎo)的生物標(biāo)記技術(shù)

施陶丁格連接中的膦及疊氮化物都具有生物正交特性，其中疊氮化物的化學(xué)惰性決定其在生理?xiàng)l件下的分子大小和高度穩(wěn)定性，使其十分適用于生物偶聯(lián)，目前該方法已廣泛應(yīng)用于生物大分子的標(biāo)記。另外，通過化學(xué)方法或生物合成途徑也能將疊氮化物摻入聚糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸中。施陶丁格連接在生物標(biāo)記中的作用，拓寬了其應(yīng)用范圍，特別是為開發(fā)相關(guān)的生物傳感器奠定了基礎(chǔ)。下面主要從施陶丁格連接介導(dǎo)的生物標(biāo)記在不同生物大分子中的應(yīng)用展開討論［5，7］。

3.1 施陶丁格連接在核酸分子標(biāo)記中的應(yīng)用

3.1.1 DNA標(biāo)記 施陶丁格連接常用于將小分子標(biāo)記在DNA上，標(biāo)記形式主要有兩種：將疊氮化物修飾的核苷酸摻入DNA鏈中以及將化學(xué)報告基團(tuán)通過酶法引入DNA中［5］。Wang等［17］通過施陶丁格連接將5’末端修飾了疊氮基團(tuán)的寡核苷酸與熒光素FAM選擇性反應(yīng)，形成FAM標(biāo)記的熒光寡核苷酸。所得的熒光寡核苷酸能夠作為引物通過桑格測序法生成帶有熒光的DNA片段并利用DNA測序儀以單堿基分辨率進(jìn)行檢測。另外，Weisbrod和Marx［18］設(shè)計了一種新型位點(diǎn)特異性的共價標(biāo)記方法。研究顯示經(jīng)疊氮化物修飾的非天然核苷酸通過施陶丁格連接能成功地引入DNA中，實(shí)現(xiàn)對DNA的修飾。同時證明了經(jīng)標(biāo)記的核苷酸能夠被DNA聚合酶接受，通過聚合反應(yīng)形成并擴(kuò)增帶有標(biāo)記的DNA鏈。首先，研究人員合成了疊氮基-2′-脫氧腺苷-5′-O-三磷酸（dATP）類似物，并通過來自噬熱細(xì)菌Pyrococcus woesei（Pwo）的DNA聚合酶將含有疊氮基的核苷三磷酸引入DNA中。隨后，疊氮化物修飾的雙鏈DNA作為底物與經(jīng)生物素化的三苯基膦發(fā)生施陶丁格連接反應(yīng)。產(chǎn)物中生物素能夠與鏈霉親和素功能化的材料進(jìn)一步偶聯(lián)，應(yīng)用于生物分子的分析和純化［16］。Anna等［19］在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了類似的研究，利用相同的原理設(shè)計了另外兩種疊氮化物修飾的 2′-脫氧胸苷 -5′-O-三磷酸（dTTP）類似物并成功地實(shí)現(xiàn)了對DNA片段的修飾。

圖2 不同結(jié)構(gòu)的膦硫醇及其前體物硫代膦硫酯的結(jié)構(gòu)式

3.1.2 RNA標(biāo)記 與DNA類似，通過施陶丁格連接將功能化的非天然核苷酸引入RNA中實(shí)現(xiàn)對其標(biāo)記主要有兩種方式：固相合成與酶介導(dǎo)。然而，Jawalekar等［20-21］對固相合成方式存在質(zhì)疑。這是由于研究中發(fā)現(xiàn)磷（Ⅲ）的化合物，如亞磷酰胺會與疊氮化物之間發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致利用疊氮基修飾的核苷酸固相合成RNA存在問題。盡管如此，Michaela的團(tuán)隊通過將修飾核苷酸的濃度調(diào)至較低水平實(shí)現(xiàn)了利用具有位點(diǎn)特異性的2′-疊氮基核苷固相合成小干擾RNA（siRNA）［20-22］。施陶丁格連接可應(yīng)用于siRNA中2′-疊氮基與熒光染料的連接，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中siRNA的定位和追蹤。延伸該方法通過固相合成將2′-疊氮基胞苷和2′-疊氮基鳥苷引入RNA 中［23］。Frommer等［24］也實(shí)現(xiàn)了用 3′-疊氮基腺苷在RNA的3′末端進(jìn)行標(biāo)記。

固相合成標(biāo)記RNA存在局限性，如耗時、成本高、需特殊設(shè)備處理以及RNA長度受限等［5］。因此，酶介導(dǎo)標(biāo)記RNA的方法受到越來越多的關(guān)注。Rao等［25］合成了含有疊氮基的尿苷三磷酸類似物并在體外轉(zhuǎn)錄期間被T7 RNA聚合酶有效地結(jié)合，引入RNA寡核苷酸中。隨后，可通過施陶丁格連接將含有疊氮基的RNA寡核苷酸與經(jīng)功能化修飾的三苯基膦發(fā)生反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)RNA的標(biāo)記。此外，相似的研究還有通過施陶丁格連接成功將含膦的淬滅劑分子標(biāo)記在RNA上。目前，RNA化學(xué)或酶合成的方法僅適用于體外標(biāo)記，但可通過后續(xù)的施陶丁格連接進(jìn)一步偶聯(lián)，應(yīng)用于RNA的功能研究。對于體內(nèi)靶向特異性標(biāo)記RNA尚未實(shí)現(xiàn)，有報道稱RNA的后合成修飾有望解決這一難題［5］。

隨著熒光激活系統(tǒng)的發(fā)展，利用修飾有疊氮基團(tuán)的熒光物質(zhì)標(biāo)記RNA，并通過模板化施陶丁格反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對哺乳動物和細(xì)菌細(xì)胞中RNA的成像。Pianowski等［26］設(shè)計了兩種細(xì)胞滲透性胍基肽核酸（GPNA）探針，分別用熒光前體疊氮羅丹明和三烷基膦標(biāo)記，通過模板化施陶丁格反應(yīng)檢測完整細(xì)胞中編碼O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的mRNA。隨后，Gorska等［27］同樣利用依賴于兩種肽核酸探針之間的模板化施陶丁格反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了在幾個小時內(nèi)對miRNA的快速熒光成像。結(jié)果表明這一方法適用于顯示細(xì)胞中miRNA的水平，同時在不同細(xì)胞系中觀察到miRNA水平和熒光強(qiáng)度之間存在良好相關(guān)性，說明該方法可以通過流式細(xì)胞術(shù)對懸浮細(xì)胞進(jìn)行熒光定量。

3.2 施陶丁格連接在非核酸類物質(zhì)生物標(biāo)記中的應(yīng)用

3.2.1 聚糖標(biāo)記 施陶丁格連接介導(dǎo)的聚糖標(biāo)記為實(shí)現(xiàn)聚糖在原生環(huán)境中參與多種生物變化過程的可視化及探測細(xì)胞內(nèi)相互作用提供了新的可能性。細(xì)胞產(chǎn)生的聚糖總量，即糖組，是細(xì)胞生理學(xué)的動態(tài)指標(biāo)。糖組會隨著細(xì)胞發(fā)育、活化以及疾病的影響從健康狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴±頎顟B(tài)而發(fā)生變化。因此，細(xì)胞表面的聚糖成像對疾病的診斷與治療具有重要意義［28］。由于聚糖不是由基因組直接編碼，因此用于分析蛋白質(zhì)和DNA的大部分現(xiàn)有分子生物學(xué)技術(shù)不能延伸以研究聚糖。聚糖成像可以通過兩種方法進(jìn)行：一是通過凝集素和抗體進(jìn)行成像，但體內(nèi)使用該方法會受到低親和力的限制；另一種方法則是用醛或酮形成席夫堿，但在體內(nèi)應(yīng)用時聚糖會與內(nèi)源性代謝物非特異性結(jié)合而產(chǎn)生問題［5］。相比之下，施陶丁格連接作為一種化學(xué)選擇性連接，參與反應(yīng)的功能基團(tuán)基本上在生物分子內(nèi)部或細(xì)胞表面不發(fā)生反應(yīng)，十分適用于細(xì)胞內(nèi)聚糖標(biāo)記并進(jìn)行成像。

近年來施陶丁格連接中具有生物正交性的膦及疊氮化物的引入促進(jìn)了細(xì)胞表面聚糖成像的發(fā)展。Saxon和Bertozzi［14］將施陶丁格連接最早應(yīng)用于聚糖的成像與檢測。首先，考慮到疊氮化物尺寸較小以及合成作為代謝前體的疊氮糖的難度較小，因此選擇將疊氮化物裝載在細(xì)胞表面的糖綴合物內(nèi)，形成N-疊氮基乙酰甘露糖胺（ManNAz）作為生物正交化學(xué)報告基團(tuán)，疊氮基的加入不會影響糖綴合物本身的特性。隨后，與經(jīng)生物素或熒光基團(tuán)標(biāo)記的三苯基膦發(fā)生施陶丁格連接反應(yīng)，生成穩(wěn)定的細(xì)胞表面加合物，從而實(shí)現(xiàn)了聚糖成像方面的突破［5，7］。在此基礎(chǔ)上，Chang等［29］利用細(xì)胞自身的生物合成機(jī)制，將兩種小功能基團(tuán)酮和疊氮化物分別引入目標(biāo)分子唾液酸和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）殘基中。這些化學(xué)報告基團(tuán)在生物環(huán)境下是惰性存在的，但是可以通過高度選擇性的共價反應(yīng)用外源遞送的探針檢測。針對上述兩種代謝標(biāo)記，分別設(shè)計使用兩種熒光探針同時對相關(guān)的細(xì)胞表面聚糖進(jìn)行成像。此外，許多新型的熒光探針以及成像技術(shù)得到了快速開發(fā)。Cohen等［28］設(shè)計了一種新型膦探針對細(xì)胞表面聚糖進(jìn)行實(shí)時生物發(fā)光成像。所使用的膦-螢火蟲熒光素探針通過施陶丁格連接與疊氮化物標(biāo)記的聚糖反應(yīng)后，游離的熒光素擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。在熒光素酶的催化作用下轉(zhuǎn)化成氧合蟲熒光素并伴隨著光子的產(chǎn)生，可以使用電荷耦合器件（CCD）照相機(jī)進(jìn)行檢測。

3.2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)記 施陶丁格連接在蛋白質(zhì)標(biāo)記中的應(yīng)用基礎(chǔ)是通過引入疊氮化物或膦作為功能標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)其功能化。相比起膦在水溶液中易發(fā)生氧化的特性，疊氮化物的性質(zhì)更加穩(wěn)定，是施陶丁格連接對蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記的關(guān)鍵。將疊氮化物引入蛋白質(zhì)中主要有兩種方法，一種是化學(xué)方法，如通過重氮基轉(zhuǎn)移反應(yīng)或生物化學(xué)反應(yīng)將疊氮化物引入蛋白質(zhì)中，另一種是生物方法，如通過基因工程在蛋白質(zhì)中引入含疊氮基的氨基酸或通過翻譯對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾等［5］。

目前，施陶丁格連接多應(yīng)用于將非天然氨基酸導(dǎo)入蛋白質(zhì)中，有效地實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的選擇性修飾。通過多種化學(xué)反應(yīng)將合成的分子共價偶聯(lián)在天然蛋白質(zhì)上，所形成的生物偶聯(lián)產(chǎn)物已經(jīng)成為研究天然蛋白質(zhì)的重要工具。然而，傳統(tǒng)的生物偶聯(lián)反應(yīng)對天然氨基酸的位點(diǎn)特異性較差。因此，近年來多種具有獨(dú)特反應(yīng)性的非天然氨基酸被設(shè)計合成，為與蛋白質(zhì)的生物正交偶聯(lián)創(chuàng)造了新的可能性［30］。Tsao等［31］將合成的非天然氨基酸疊氮基苯丙氨酸導(dǎo)入噬菌體展示肽和突變的Z-結(jié)構(gòu)域蛋白。隨后，利用熒光素標(biāo)記的三苯基膦通過施陶丁格連接反應(yīng)高選擇性及高效地修飾了這些含疊氮基的蛋白質(zhì)。這項(xiàng)工作為用各種合成試劑選擇性修飾蛋白質(zhì)提供了一個強(qiáng)大的新工具。研究證明施陶丁格連接不影響噬菌體活力，并且在連接完成后能夠輕易地實(shí)現(xiàn)富集。因此該方法能夠選擇性修飾蛋白質(zhì)而不改變其功能，可應(yīng)用于產(chǎn)生高度均勻的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，表面固定化蛋白質(zhì)、用光譜或親和試劑修飾的蛋白質(zhì)。

3.2.3 脂質(zhì)標(biāo)記 近年來，多種脂質(zhì)標(biāo)記的化學(xué)選擇性偶聯(lián)方法得到應(yīng)用，例如酰胺，硫醇-馬來酰亞胺偶聯(lián)，亞胺或腙鍵及CuAAC等。通過改善制備表面官能化脂質(zhì)體常規(guī)方法中的繁瑣步驟，如脂質(zhì)偶聯(lián)物的完全合成，脂質(zhì)組分的制備等，實(shí)現(xiàn)了不同配體能夠以模塊化方式在脂質(zhì)體的外表面對脂質(zhì)骨架進(jìn)行修飾。脂質(zhì)體在藥物遞送以及對治療藥物的包埋中扮演了關(guān)鍵的角色［11］。Vabbilisetty等［32］通過施陶丁格連接利用乳糖的偶氮衍生物對脂質(zhì)體表面進(jìn)行功能化修飾。就脂質(zhì)體大小和包埋藥物的滲漏率而言，施陶丁格連接在保證脂質(zhì)雙層膜完整性的同時提供了適用于靶向藥物遞送的完美功能性囊泡。與施陶丁格連接以及CuAAC相比，其他偶聯(lián)方法缺乏特異性，導(dǎo)致脂質(zhì)體與目標(biāo)生物分子之間的共價鍵不能穩(wěn)定存在和被控制。其中，施陶丁格連接反應(yīng)能夠在室溫，水溶液以及無催化劑的條件下對脂質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，同時與許多生物分子中無保護(hù)的功能基團(tuán)互相適配，從而制備出的多種功能化脂質(zhì)體產(chǎn)率較高［2，11］。

4 施陶丁格連接在生物傳感中的應(yīng)用

隨著施陶丁格連接應(yīng)用范圍的不斷拓寬以及生物傳感器在檢測中的快速發(fā)展，施陶丁格連接介導(dǎo)的生物傳感器逐漸增多。由于連接反應(yīng)中產(chǎn)生的酯離去基團(tuán)能夠被設(shè)計用于特定的生物應(yīng)用中，如將離去基團(tuán)賦予顯色或熒光性質(zhì)，或是用作前體藥物［13］，因此目前施陶丁格連接多應(yīng)用于熒光生物傳感器中，為檢測核酸以及小分子物質(zhì)提供了快速便利的方式。下文將按照靶標(biāo)為核酸與小分子兩大類對施陶丁格連接介導(dǎo)的生物傳感應(yīng)用進(jìn)行論述。

4.1 施陶丁格連接介導(dǎo)的核酸熒光生物傳感器

施陶丁格連接介導(dǎo)的核酸熒光生物傳感器主要是通過模板化施陶丁格反應(yīng)激活熒光信號對DNA、RNA進(jìn)行檢測，隨后不斷優(yōu)化相關(guān)參數(shù)，刷新檢測限低值。過去的技術(shù)受到了反應(yīng)動力學(xué)緩慢、背景信號值高等問題的制約。在引入點(diǎn)擊反應(yīng)，如施陶丁格連接后，其生物正交性與反應(yīng)動力學(xué)，有助于提升檢測靈敏度熒光強(qiáng)度，同時削弱背景信號。在模板化施陶丁格反應(yīng)的基礎(chǔ)上，開發(fā)了多種熒光探針與其相結(jié)合用于核酸的檢測。Abe等［33］開發(fā)了一種還原觸發(fā)熒光探針（REFA）用于寡核苷酸的檢測，探針中的新熒光化合物是羅丹明衍生物，標(biāo)記在與靶標(biāo)鏈互補(bǔ)的DNA鏈上，其中的疊氮基團(tuán)能夠與另一條DNA鏈上標(biāo)記的TPP發(fā)生施陶丁格反應(yīng)，疊氮基團(tuán)被還原后出現(xiàn)熒光信號。在靶標(biāo)DNA或RNA存在下，無任何酶或試劑參與的情況下自動進(jìn)行，10-20 min內(nèi)產(chǎn)生熒光信號，該熒光化合物的熒光強(qiáng)度信號/背景比值達(dá)到2 100倍的增長。REFA探針已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測溶液中單核苷酸水平的寡核苷酸和細(xì)菌細(xì)胞中的內(nèi)源RNA。

目前使用比較廣泛的另一種熒光探針是Franzini和Kool［34］設(shè)計的一種多功能模板熒光激活探針，被稱為淬滅施陶丁格觸發(fā)α-疊氮醚釋放（Q-STAR）探針。這一DNA探針含有熒光基團(tuán)，與α-疊氮醚接頭相連的猝滅基團(tuán)會使熒光淬滅失活。通過TPP與疊氮官能團(tuán)發(fā)生施陶丁格反應(yīng)觸發(fā)接頭的斷開，導(dǎo)致淬滅基團(tuán)的釋放，引發(fā)穩(wěn)健的熒光信號。這一探針已用于在大腸桿菌和腸道沙門氏菌中表達(dá)的特定RNA靶標(biāo)的體外檢測［35］。隨后，F(xiàn)ranzini和Kool將Q-STAR探針進(jìn)行了改進(jìn)，開發(fā)了具有單核苷酸特異性的DNA靶標(biāo)的雙色鑒別方法，即同時使用花青染料標(biāo)記的淬滅釋放探針（NIR STAR）特異性地與一條靶標(biāo)鏈雜交，在與TPP-DNA探針進(jìn)行模板反應(yīng)后提供近紅外熒光信號，而另一條靶標(biāo)鏈與特異性的綠色STAR探針雜交則提供綠色熒光信號。改進(jìn)后的模板熒光探針通過顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)增強(qiáng)對致病細(xì)菌的分析，這種多色探針可用于復(fù)雜樣品中核酸的多重檢測［36］。

此外，針對PCR檢測方法依賴于線性信號放大而阻礙了對少量遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測的問題，近期Velema和Kool［37］開發(fā)了一種非酶促的熒光擴(kuò)增級聯(lián)模板反應(yīng)用于單核苷酸水平的核酸檢測。檢測結(jié)合了兩個核酸模板反應(yīng)，首先第一個是靶序列模板化學(xué)連接反應(yīng)，形成一種不穩(wěn)定的產(chǎn)物，與模板序列分離后，進(jìn)入第二個模板化施陶丁格反應(yīng)，從而產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。結(jié)果表明，利用該方法以濃度依賴性的方式檢測靶序列，檢測限可低至10 pmol/L，同時具有高選擇性與生物相容性。

4.2 施陶丁格連接介導(dǎo)的小分子熒光生物傳感器

施陶丁格介導(dǎo)的熒光傳感器用于小分子檢測的研究比較少。最近，Yu等［38］報道了利用重要的能量儲存生物分子三磷酸腺苷（ATP）作為生物催化劑誘導(dǎo)鏈間施陶丁格反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)高選擇性、高效率檢測ATP。如圖3所示，實(shí)驗(yàn)設(shè)計了一條用弱熒光疊氮基-香豆素功能化的ATP劈裂適配體A1；第二條DNA鏈A2則與TPP共價連接，能夠通過施陶丁格反應(yīng)選擇性且有效地將疊氮基還原為氨基。首先將A2與另一半設(shè)計更長的DNA鏈（T1）雜交。T1的后半部分是ATP的劈裂適配體，并選擇性地識別ATP與A1形成三明治結(jié)構(gòu)。ATP與適配子之間的特異性相互作用促使兩個功能性DNA鏈（A1和A2）上的疊氮基與TPP互相靠近，引發(fā)了fmolnmol濃度水平的鏈間施陶丁格連接反應(yīng)，熒光基團(tuán)被還原成7-氨基香豆素，產(chǎn)生熒光，可用作ATP示蹤的指示劑。同時，反應(yīng)產(chǎn)物的熒光信號對ATP濃度具有劑量響應(yīng)［38］。這種鏈?zhǔn)绞┨斩「穹磻?yīng)可以擴(kuò)展到為其他小功能分子構(gòu)建基于適配體的熒光生物傳感器。

Peng等［39］的最新研究是基于施陶丁格連接開發(fā)了一種新型激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）高選擇性熒光探針，用于靈敏地檢測有機(jī)疊氮化物。該探針可檢測線性響應(yīng)高達(dá)40 μmol/L的苯基疊氮化物，檢測下限為227 nmol/L，在多種分析物存在的情況下也能表現(xiàn)出高選擇性。另外，該探針具有低毒性，已成功應(yīng)用于活體肝癌SMMC-7721細(xì)胞中有機(jī)疊氮化物的成像。

5 施陶丁格連接在藥物合成與遞送中的應(yīng)用

圖3 ATP引發(fā)的鏈間施陶丁格反應(yīng)以及香豆素的熒光恢復(fù)［38］

點(diǎn)擊化學(xué)目前主要應(yīng)用于材料科學(xué)，高分子化學(xué)以及生物技術(shù)中，但是Sharpless及其團(tuán)隊最初提出點(diǎn)擊化學(xué)這一概念時，主要目的就是將其應(yīng)用于藥物合成與遞送。施陶丁格連接中參與反應(yīng)的疊氮化物與膦都具有生物正交性質(zhì)，因此十分適用于靶向的藥物遞送與釋放。2006年，Azoulay 等［40］研究人員開發(fā)了一種具有改性親電子阱的膦探針，并首次成功地利用這一潛在的前藥釋放系統(tǒng)，通過施陶丁格連接有效地選擇性釋放藥物，獲得較高產(chǎn)率。在施陶丁格連接的觸發(fā)作用下，多柔比星藥物前體被激活，隨著時間的增加，藥物前體不斷轉(zhuǎn)化成多柔比星，3 h后反應(yīng)完成接近90%，實(shí)現(xiàn)了多柔比星的緩釋。通過高效液相色譜法（HPLC）對多柔比星及其藥物前體的釋放進(jìn)行了量化和監(jiān)控，二者的保留時間分別為3 min和23 min，線性范圍為10-5mol/L-1.5 x 10-3mol/L［40］。

靶向脂質(zhì)體是藥物遞送中的重要媒介，其合成通常需要靶向配體與脂質(zhì)體表面的化學(xué)偶聯(lián)。由于施陶丁格連接能夠在溫和的反應(yīng)條件下以高產(chǎn)率進(jìn)行并且與多數(shù)生物分子的未保護(hù)官能團(tuán)具有相容性，因此適用于靶向藥物遞送的生物偶聯(lián)物的新型合成方法［8］。Xu等［41］將裝載有鈣黃綠素或多柔比星的轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）-共軛脂質(zhì)體通過施陶丁格連接法合成，所得到的脂質(zhì)體在細(xì)胞攝取和體外細(xì)胞毒性方面具有高度功能化，偶聯(lián)反應(yīng)具有高度特異性及穩(wěn)定性，可應(yīng)用于將來開發(fā)靶向給藥系統(tǒng)。

6 施陶丁格連接對納米材料的生物功能化

隨著新型材料的特性不斷被發(fā)掘，納米材料作為其中一員，因其結(jié)構(gòu)龐大，負(fù)載能力高以及獨(dú)特且可調(diào)控的物理、化學(xué)性質(zhì)而成為藥物遞送系統(tǒng)開發(fā)中的重要工具［42］。施陶丁格連接介導(dǎo)的納米材料藥物遞送技術(shù)也得到一定程度的發(fā)展。2008年P(guān)arkhouse等開發(fā)了靶向基因遞送系統(tǒng)的模塊化合成新方法，首次實(shí)現(xiàn)將施陶丁格連接用于納米顆粒的功能化。研究人員利用末端為疊氮基的聚乙二醇化聚酰胺-胺聚合物和DNA納米顆粒通過施陶丁格連接反應(yīng)與肽配體偶聯(lián)，從而形成離散的小尺寸納米顆粒［11，43］。目前，Gobbo 等［42］的最新研究是通過施陶丁格連接將疊氮基標(biāo)記的CRGDK肽與金納米粒子結(jié)合。由于CRGDK肽能夠靶向不同癌細(xì)胞系的生物分子，反應(yīng)后得到的AuNP-CRGDK生物偶聯(lián)物將成為潛在的廣譜型靶向劑，便于在抗癌藥物遞送中應(yīng)用。

7 施陶丁格連接介導(dǎo)的生物傳感器的未來發(fā)展方向

施陶丁格連接具有生物正交性、與多種熒光基團(tuán)偶聯(lián)的適用性，同時無需金屬離子催化而無潛在細(xì)胞毒性等優(yōu)勢，使其成為點(diǎn)擊反應(yīng)中應(yīng)用較為廣泛的代表之一。目前，施陶丁格連接在細(xì)胞及體內(nèi)成像中的應(yīng)用已經(jīng)較為成熟，但在生物傳感器中的應(yīng)用仍然具有較大的發(fā)展空間。本文將從以下幾點(diǎn)對施陶丁格連接在生物傳感器中的應(yīng)用進(jìn)行展望。

7.1 反應(yīng)局限性的優(yōu)化

相較于應(yīng)用最為廣泛的點(diǎn)擊反應(yīng)CuAAC，施陶丁格連接的局限性主要體現(xiàn)在兩個方面：反應(yīng)物中膦易被氧化以及反應(yīng)動力學(xué)較慢，二者限制了施陶丁格連接在體外檢測，尤其是生物傳感器中的應(yīng)用。目前，已陸續(xù)有研究提出相應(yīng)的解決辦法來減小局限性對施陶丁格連接在實(shí)際應(yīng)用中的影響。例如，文中提到的通過優(yōu)化疊氮化物的結(jié)構(gòu)，形成全氟芳基疊氮化物，與膦發(fā)生施陶丁格連接反應(yīng)，能夠加快反應(yīng)速率［14］。其次，在不使用金屬離子催化劑的前提下，研究適用于施陶丁格連接且無潛在細(xì)胞毒性的催化劑，加快反應(yīng)速率，增大產(chǎn)率。除此之外，研究疊氮化物和膦中各主要基團(tuán)的位置和距離對反應(yīng)速率的影響，總結(jié)規(guī)律，針對不同的探針或靶標(biāo)標(biāo)記條件最優(yōu)的疊氮基和膦，從而構(gòu)建高效的生物傳感器。

7.2 拓寬生物傳感器的種類

在生物傳感方面，目前施陶丁格連接主要集中應(yīng)用于靶標(biāo)為核酸以及小分子的熒光傳感器，使得搭載的生物傳感器類型較為缺乏且單一。因此，在將施陶丁格連接局限性最小化的同時，可以參考已經(jīng)發(fā)展較為成熟的點(diǎn)擊反應(yīng)，如CuAAC在電化學(xué)傳感器［44］、可視顯色傳感器［45］及光譜生物傳感器［46］中的應(yīng)用，嘗試將施陶丁格連接引入多種生物傳感器中，打破施陶丁格連接應(yīng)用單一的局面，進(jìn)一步拓寬施陶丁格連接的應(yīng)用范圍。

7.3 新材料的功能化及應(yīng)用

施陶丁格連接在新材料中的應(yīng)用有待開發(fā)。文中提到已有將施陶丁格連接應(yīng)用于金納米粒子的報道，但是僅停留于對金納米粒子進(jìn)行功能化的初期，具體的應(yīng)用仍然空缺［42］。因此，可以借鑒CuAAC或SPAAC等點(diǎn)擊反應(yīng)在金納米粒子［47］、碳納米管［48］、磁納米粒子［49］中的應(yīng)用方法，開發(fā)施陶丁格連接在這些新材料功能化及生物傳感中的應(yīng)用。

7.4 減小在生物大分子上標(biāo)記功能基團(tuán)的難度和成本

目前已有多種在生物大分子上分別修飾疊氮基團(tuán)和膦的方法，其中疊氮基團(tuán)作為CuAAC反應(yīng)的主要功能基團(tuán)，在修飾生物大分子中相對較為成熟，但施陶丁格連接在實(shí)際應(yīng)用中的普及率相對較低，同時購買用于標(biāo)記的疊氮化物和膦的原始材料成本較高，從而大大影響了在生物大分子上標(biāo)記功能基團(tuán)的商業(yè)化程度以及合成方法，尤其是核酸探針修飾方法的發(fā)展。這也是目前施陶丁格連接在生物傳感器中應(yīng)用的主要限制因素之一。因此，若能總結(jié)并優(yōu)化現(xiàn)有的修飾方法，并在此基礎(chǔ)上積極開發(fā)新型可持續(xù)發(fā)展、可廣泛應(yīng)用的合成及修飾手段，從根本上解決施陶丁格連接主要功能基團(tuán)在修飾生物大分子上的難題，將極大地拓寬施陶丁格連接的應(yīng)用前景。