樓江 林能明 劉占利 王飛 李晴宇 史長城 嚴(yán)偉

拉莫三嗪（lamotrigine，LTG）是苯三嗪類抗癲癇藥物，主要通過阻斷突觸前膜電壓敏感性鈉離子通道，抑制谷氨酸和天冬氨酸的釋放，發(fā)揮抗癲癇作用；奧卡西平（oxcarbazepine，OXC）是卡馬西平的10-酮基衍生物，在體內(nèi)可迅速轉(zhuǎn)化成活性代謝物10-羥基卡馬西平（10-monohydroxycarbazepine，MHD）發(fā)揮抗癲癇作用[1]。但上述兩種藥物藥動學(xué)個體差異大，治療窗窄（LTG治療窗 3～14μg/ml，OXC 治療窗為 3～35μg/ml），服用相同劑量，部分患者可能出現(xiàn)不良反應(yīng)，因此有學(xué)者建議對服用LTG和OXC的患者進行血藥濃度監(jiān)測，并根據(jù)血藥濃度調(diào)整LTG和OXC用量，以提高LTG和OXC的療效并降低不良反應(yīng)發(fā)生率[2-4]。目前，國內(nèi)外已有研究報道人血漿中LTG、MHD和OXC的分析方法，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）雖靈敏度高，但儀器成本和維護費用昂貴；而文獻報道的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法，大多采用液-液萃取或液-固萃取前處理法，該法耗時較長，操作繁瑣且費用較貴；相比于文獻報道的紫外檢測器檢測，二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）可對被測物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)進行全波長掃描，選取最優(yōu)檢測波長，同時可設(shè)定參比波長，消除噪音干擾，提高檢測的靈敏度[5-7]。本研究在文獻報道的基礎(chǔ)上，以甲醇為蛋白沉淀劑，建立了同時測定人血漿中LTG、OXC和MDH濃度的HPLCDAD法，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀：包括四元泵（型號∶G1311B）、自動進樣器（型號∶G1329B）、柱溫箱（型號∶G1316A）和 DAD 檢測器（型號∶G1315D）購自美國Agilent公司；低速離心機（DM0412S）、渦旋混合器（MXS）購自美國賽洛捷克公司；低溫高速離心機（5418R）購自德國艾本德股份公司；超純水系統(tǒng)（Thermo fisher LabTower ED1）購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 藥品與試劑 LTG（美國Sigma公司，純度≥98%，10mg）；OXC（中檢所，純度：99.8%，100mg）；MHD（南京康滿林有限公司，純度：97%，250mg），氯唑沙宗（中檢所，純度：99.7%，100mg），血漿：人體血漿，甲醇和乙腈（色譜級，德國默克公司），磷酸二氫鉀（分析純）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（4.6×100mm，3.6μm）；柱溫：35℃；流動相：乙腈-10 mmol/L KH2PO4（V/V，24∶76，pH5.5）；流速：0.8ml/min；進樣體積：10μl；檢測波長220nm，參比波長360nm。

1.3.2 溶液的配制 LTG標(biāo)準(zhǔn)液配置：精密稱取LTG 9.6mg，加甲醇溶解并定容至 10ml，得到 960μg/ml的LTG標(biāo)準(zhǔn)液。OXC標(biāo)準(zhǔn)液配置：精密稱取OXC 11.0mg，加甲醇溶解并定容至10ml，得到1 100μg/ml的OXC標(biāo)準(zhǔn)液。MHD溶液配置：精密稱取MHD 19.6mg，加甲醇溶解并定容至10ml，得到1 900μg/ml的MHD標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取 LTG 4.17ml、OXC 3.64ml和 MHD 2.11ml置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10ml，得到LTG、OXC和MHD混合液，3種物質(zhì)濃度均為400.0μg/ml。氯唑沙宗溶液配置：精密稱取氯唑沙宗10.0mg，用甲醇溶解并定容至10ml，得到1000μg/ml的內(nèi)標(biāo)液；精密吸取500μl氯唑沙宗標(biāo)準(zhǔn)液，置于10ml容量瓶中，用甲醇定容，得到50μg/ml的內(nèi)標(biāo)儲備液。以上儲備液均置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血漿樣品預(yù)處理 精密吸取200μl血漿置于1.5ml離心管中，加入內(nèi)標(biāo)50μl（濃度50μg/ml）及400μl甲醇溶液，渦旋混勻2min后，4℃低溫下離心10min（14 000r/min），取300μl上清液于進樣瓶，10μl進樣分析。1.4 方法學(xué)驗證 根據(jù)《中國藥典2015版（第4部）》中《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》對該方法的專屬性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率、日內(nèi)和日間精密度以及穩(wěn)定性等進行考察[8]。

1.4.1 專屬性 取6份健康體檢者的空白血漿，按“1.3.3”項方法處理后進樣，考察該方法的專屬性。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取LTG、OXC和MHD混合稀釋液400μg/ml，用甲醇逐級稀釋得 10.0、20.0、50.0、100.0、200.0μg/ml的LTG、OXC和MHD混合液；再用空白血漿將 10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 和 400.0μg/ml的LTG、OXC和MHD混合液稀釋10倍，得到LTG、OXC和MHD的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為 1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 和40.0μg/ml。按“1.3.3”項方法處理后進樣，測得 LTG、OXC和MHD和內(nèi)標(biāo)的峰面積，以待測物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（y），各待測物濃度為橫坐標(biāo)（x），進行線性回歸分析。

1.4.3 精密度和回收率實驗 用空白血漿分別配置LTG、MHD和OXC的混合質(zhì)控樣品，低、中和高濃度分別為 2.0、10.0 和 30.0μg/ml，按“1.3.3”項方法處理后分析，每個濃度平行5份，計算日內(nèi)精密度及方法回收率，該步驟連續(xù)測定3d，計算日間精密度及方法回收率。精密度采用相對偏準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示，RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）/測定結(jié)果的平均數(shù)×100%，RSD＜15%證明該方法精密度良好。方法回收率為測定結(jié)果的平均數(shù)與真實值之間的比值，85%＜方法回收率＜105%，證明回收率良好。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗 配置低、中、高3種濃度的LTG、MHD和OXC混合質(zhì)控血漿，按“1.3.3”項處理后分析，每個濃度平行5份，觀察樣品室溫放置（2、4、8和12h）、自動進樣器放置（2、4、8和 12h）和反復(fù)凍融（1、2 和 3次）穩(wěn)定性。RSD＜15%表明被測藥物在上述條件下穩(wěn)定性良好。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，以待測物峰面積（LTG、OXC和MHD峰面積）和內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（y），各待測物濃度為橫坐標(biāo)（x），進行線性回歸分析，當(dāng)相關(guān)系數(shù)r≥0.999時，證明線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果

2.1 專屬性 在本試驗條件下，被測物及內(nèi)標(biāo)物均分離良好（分離度 R≥1.5min），LTG、MHD、OXC 和內(nèi)標(biāo)物（internal standard，IS） 的保留時間分別為 4.3、5.2、9.8 和11.5min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定結(jié)果，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖（a：空白血漿；b：LTG+MHD+OXC+IS；c：患者服用拉莫三嗪12h后的血漿樣品+IS；d：患者服用奧卡西平12h后的血漿樣品+IS；e：患者服用拉莫三嗪+奧卡西平12h后的血漿樣品+IS）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 LTG的線性回歸方程為y=0.171x+0.036（r=0.99974），MHD的線性回歸方程為y=0.091x+0.018（r=0.99969），OXC 的線性回歸方程為：y=0.130x+0.036（r=0.99969），結(jié)果表明 LTG、MHD 和 OXC 在 1.0～40.0μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 精密度和回收率 LTG、OXC和MHD的方法回收率在93.4%～100.95%，日內(nèi)和日間精密度均＜6%，結(jié)果表明該方法下LTG、OXC和MHD的回收率和精密度較好，見表1。

表1 LTG、OXC和MHD的日內(nèi)、日間精密度和回收率

2.4 穩(wěn)定性試驗 LTG、MHD和OXC在室溫放置穩(wěn)定性、自動進樣器放置穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性條件下的RSD均＜8%，結(jié)果表明該方法下LTG、MHD和OXC的穩(wěn)定性較好，見表2。

表2 LTG、OXC和MHD在各種條件下的穩(wěn)定性實驗

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 本研究使用DAD對被測物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)的使用全紫外波長（190～400nm，步進值2nm）進行掃描，發(fā)現(xiàn)近紫外區(qū)210nm處的信號較強，但溶劑吸收干擾嚴(yán)重。經(jīng)反復(fù)試驗比較，取220nm不僅可排除溶劑吸收干擾，還可獲得最佳靈敏度，故選220nm為本研究的檢測波長。試驗發(fā)現(xiàn)360nm波長處樣品沒有吸收，且最接近檢測波長，為消除基線噪音干擾，選擇360nm作為本研究的參比波長。

3.2 流動相的選擇 本試驗曾嘗試使用甲醇-水和乙腈-水作流動相，但發(fā)現(xiàn)被測物質(zhì)色譜峰拖尾嚴(yán)重，這可能與被測物質(zhì)含伯氨、叔氨等有機氮結(jié)構(gòu)有關(guān)，它們可與C18色譜柱內(nèi)未參加鍵合反應(yīng)硅醇基發(fā)生正、負電荷的吸附，引起拖尾。當(dāng)以10mmol/L和50mmol/L KH2PO4作水相，發(fā)現(xiàn)緩沖鹽溶液可顯著影響被測物質(zhì)的色譜行為（包括色譜峰和保留時間），因緩沖液濃度越高，對色譜柱的損害可能越大，不易維護保養(yǎng)，最終選擇10 mmol/L KH2PO4緩沖液作該條件的水相。

3.3 內(nèi)標(biāo)的選擇 已有研究報道LTG或OXC的測定，可用苯巴比妥和氯唑沙宗作內(nèi)標(biāo)[6，9]。本試驗曾嘗試使用另一苯二氮卓藥物地西泮和氯唑沙宗作內(nèi)標(biāo)，發(fā)現(xiàn)地西泮與被測物的保留時間相差較大，不適用于分析測定，但氯唑沙宗在該條件下分離度好，保留時間較適合，最后選擇氯唑沙宗作為本研究的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

3.4 前處理的選擇 文獻報道LTG、MHD和OXC的測定，常采用液-液萃取或固相萃取作為前處理，操作繁瑣且費用昂貴[6-7]。因此本研究曾嘗試使用甲醇、乙腈和高氯酸溶液作為蛋白沉淀劑，發(fā)現(xiàn)高氯酸和乙腈的回收率較低，尤其是低濃度樣品，因此本研究最后選用甲醇作為蛋白沉淀劑。

綜上所述，本研究針對LTG、MHD和OXC血藥濃度個體差異大的特點，建立了快速、靈敏和高效的測定人血漿中LTG、MHD和OXC的HPLC-DAD法，適用于服用LTG和OXC患者的常規(guī)治療藥物監(jiān)測。