鄧雨飛 劉明浩 王丹 左示敏 康厚祥,* 王國梁,4,*

?

抗稻瘟病位點(diǎn)LABR_64的起源及其分布和序列多樣性

鄧雨飛1,2劉明浩2王丹1左示敏3康厚祥2,*王國梁2,4,*

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 長沙 410128;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193;3揚(yáng)州大學(xué) 植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 揚(yáng)州 225009;4俄亥俄州立大學(xué) 植物病理學(xué)系, 美國 俄亥俄州 哥倫布 43210;*通訊聯(lián)系人, E-mail: kanghouxiangcaas@163.com;wang.620@osu.edu)

【目的】研究抗病基因在水稻種群中的分布特征是培育抗病品種的基礎(chǔ)?！痉椒ā恳运镜?染色體上與等位的抗病位點(diǎn)LABR_64為研究對(duì)象，結(jié)合稻瘟病抗性鑒定，對(duì)該位點(diǎn)中包含的兩個(gè)抗病基因和在水稻群體中的分布特征進(jìn)行了研究，并對(duì)其在單子葉植物中對(duì)應(yīng)的直系同源序列進(jìn)行了共線性分析?！窘Y(jié)果】LABR_64位點(diǎn)在水稻中存在的頻率約為16%，所有存在該位點(diǎn)的粳稻均表現(xiàn)高抗病性，缺失該位點(diǎn)的粳稻品種均表現(xiàn)出高感病性，而秈稻品種中LABR_64位點(diǎn)存在頻率低于5%，雖然其存在情況下均表現(xiàn)出抗病性，但大部分缺失該位點(diǎn)品種也表現(xiàn)出抗性；存在LABR_64位點(diǎn)的品種中，基因編碼序列高度保守；LABR_64起源于單子葉與雙子葉植物完全分離后及單子葉植物分化早期，其在不同的單子葉植物的分化過程中一直保持著良好的共線性。【結(jié)論】粳稻抗稻瘟病表型與和存在與否緊密關(guān)聯(lián)，而秈稻的相關(guān)性不大，表明秈稻中其他抗性基因在稻瘟病抗性過程中起主導(dǎo)作用；鑒于的高度保守性，可根據(jù)其編碼序列設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，用于高效篩選抗稻瘟病粳稻品種；LABR_64可能在不同單子葉植物抗病過程中均具有重要作用。

水稻；抗稻瘟病基因；序列多樣性；基因起源

稻瘟病是由稻瘟病菌（）引起的一種真菌病害，主要通過氣流傳播，是水稻的三大病害之一，每年造成水稻減產(chǎn)高達(dá)11％～13％，給糧食產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，有效防治稻瘟病是水稻安全生產(chǎn)的重要任務(wù)。目前，選育優(yōu)良抗病品種和化學(xué)防治是防治稻瘟病的兩種主要方法，其中，前者是控制稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的方法[1]。同時(shí)，稻瘟菌菌株多樣性豐富且變異速度快，導(dǎo)致水稻抗稻瘟病品種在大面積推廣2~3年后容易喪失抗病性，這對(duì)稻瘟病抗病育種和抗病品種田間布局帶來極大困難，也成為制約我國乃至世界水稻持續(xù)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要因素之一[2]。因此，發(fā)掘自然群體中的抗稻瘟病新基因及建立抗病品種在不同地區(qū)的合理布局對(duì)水稻抗病育種具有重要意義。

根據(jù)植物抗性基因編碼蛋白產(chǎn)物的類型，可將抗病基因分為五大類，包括NBS-LRR、eLRR-TM、eLRR-TM-pkinase、STK以及除這四類以外的其他類型[3-4]。NBS-LRR類基因編碼具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)和富亮氨酸重復(fù)(LRR)的胞內(nèi)受體蛋白。根據(jù)NBS的N端結(jié)構(gòu)不同，又可分為TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR兩大類。其中，TIR-NBS-LRR類型只存在于雙子葉植物中，單子葉植物抗病基因主要類型為CC-NBS-LRR[5-7]。目前，共鑒定和報(bào)道了超過100個(gè)水稻抗稻瘟病基因位點(diǎn)，已經(jīng)克隆的水稻抗稻瘟病基因有等28個(gè)[8-18]，其中只有一個(gè)隱性基因，為，其余全部為顯性抗稻瘟基因[13]。在這20多個(gè)已被克隆的抗病基因中，除編碼B-lectin激酶[10]和編碼富含脯氨酸蛋白[13]以外，其余均為NBS-LRR類型基因。抗病基因呈串聯(lián)重復(fù)分布于同一遺傳座位在水稻NBS-LRR基因家族中為普遍現(xiàn)象。在已克隆的20多個(gè)抗稻瘟病基因中，和都位于第6染色體近著絲粒區(qū)域，屬于同一遺傳座位。此外，和也呈串聯(lián)重復(fù)分布于第11染色體同一遺傳座位。和是位于第9染色體同一遺傳座位的等位基因，對(duì)序列和功能分析表明，其中包含兩個(gè)抗病基因和，需二者同時(shí)存在時(shí)才具有抗性[19-21]。Kang等[22]利用RDP1(rice diversity panel 1)群體接種5個(gè)不同的稻瘟菌菌株，結(jié)合高通量測(cè)序獲得的高密度SNP標(biāo)記進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定了97個(gè)與稻瘟病相關(guān)的位點(diǎn)LABR(loci associated with blast resistance)。這些抗病位點(diǎn)中，有且只有64號(hào)位點(diǎn)LABR_64對(duì)所有5個(gè)測(cè)試稻瘟菌的抗性均關(guān)聯(lián)，通過基因沉默方法對(duì)LABR_64位點(diǎn)中潛在的候選基因進(jìn)行了功能分析，鑒定到兩個(gè)新的抗性等位基因和。本研究系統(tǒng)分析了其在水稻群體中的分布情況，并通過進(jìn)一步序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)在單子葉植物中非常保守，是一個(gè)古老的抗病位點(diǎn)。對(duì)該基因區(qū)域的進(jìn)一步研究將有助于明確水稻抗稻瘟基因的起源與演化，為挖掘新的抗稻瘟病基因以及充分利用抗病等位基因來提高水稻抗性提供新思路。

1 材料與方法

1.1 水稻材料、稻瘟菌材料以及試劑

本研究選用227份水稻核心材料，其中秈稻68份，粳稻159份，日本晴為對(duì)照感病材料。所用稻瘟菌菌株為RB22。聚合酶等分子試劑均購自全式金公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水稻種植方法

將水稻種子去殼，按照Park等[23]的方法用酒精和次氯酸鈉消毒后鋪于1/2MS培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱中(12 h光照/12 h黑暗)培養(yǎng)，保證水稻起始狀態(tài)一致。一周后，將水稻幼苗移栽于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊基地溫室苗缽，三周后進(jìn)行接種。

1.2.2 稻瘟菌培養(yǎng)

參照Wang等[24]的方法，將稻瘟菌紙片轉(zhuǎn)接到燕麥培養(yǎng)基上；于25℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7 d，待菌絲擴(kuò)散后，轉(zhuǎn)移至24 h光照培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)一周，即可產(chǎn)生分生孢子。

1.2.3 稻瘟病接種方法

用0.05%的吐溫水溶液刮洗孢子，過濾至50 mL離心管中；在光學(xué)顯微鏡下調(diào)節(jié)孢子濃度約為1×105個(gè)/mL；用噴壺將孢子懸浮液均勻噴于3葉1心的水稻苗，用封口膜輕輕封住接種箱，置于25℃、相對(duì)濕度95%條件下，避光24 h后，在光照12 h/黑暗12 h條件下交替培養(yǎng)一周，調(diào)查病情。

1.2.4 DNA提取、PCR和測(cè)序分析

采用CTAB法提取水稻葉片DNA。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)，長度約為18~25 bp，GC含量為40%~60%，退火溫度為55℃~60℃。DNA測(cè)序等由北京華大基因研究中心有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

不同單子葉植物的參考基因組序列從NCBI網(wǎng)站(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)下載，利用BLAST、ClustalW2和DNAMAN等對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和分析，Perl SVG模塊完成共線性作圖。

表1 本研究所用的引物序列

2?結(jié)果與分析

2.1?LABR_64位點(diǎn)稻瘟病抗性鑒定

康厚祥等[22]通過基因敲除技術(shù)敲除LABR_64位點(diǎn)中兩個(gè)抗病基因中的任意一個(gè)后，不同遺傳背景的水稻品種均表現(xiàn)出感病性。本研究利用強(qiáng)致病稻瘟菌菌株RB22噴霧接種秈稻和粳稻材料后，發(fā)現(xiàn)對(duì)照日本晴(缺失LABR_64區(qū)域兩個(gè)抗病基因)葉片具有典型病斑，表現(xiàn)為感病，而攜帶LABR_64位點(diǎn)的材料葉片無典型病斑，表現(xiàn)為抗病(圖1)。進(jìn)一步表明LABR_64位點(diǎn)在供試水稻品種中與抗RB22緊密關(guān)聯(lián)。

2.2 LABR_64在秈粳稻中的分布

用RB22接種不同遺傳背景的品種，分別篩選出秈稻和粳稻的抗、感病品種。針對(duì)LABR_64位點(diǎn)包含的兩個(gè)抗病功能基因和進(jìn)行PCR檢測(cè)。接種結(jié)果表明，在感病粳稻品種中兩個(gè)基因均缺失，而在抗病品種中擴(kuò)增條帶清晰一致。在所測(cè)試粳稻品種中，LABR_64的存在與否與抗/感RB22菌株高度關(guān)聯(lián)；秈稻抗性品種中，只有部分品種包含LABR_64位點(diǎn)，包含LABR_64的秈稻品種均對(duì)RB22菌株高抗，同時(shí)，秈稻抗病品種中還有很大一部分不包含LABR_64，表明這些秈稻品種中存在其他未知的抗病基因?qū)B22起抗性作用（圖2）。

2.3 LABR_64位點(diǎn)的起源與演化

為了進(jìn)一步明確抗稻瘟位點(diǎn)LABR_64的起源及在水稻不同亞群中的演化。選取12個(gè)包含LABR_64位點(diǎn)的抗病水稻品種進(jìn)行DNA提取和PCR測(cè)序。通過對(duì)和基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)基因序列在不同抗稻瘟病水稻品種中相對(duì)保守，同時(shí)序列之間也具有多態(tài)性位點(diǎn)，這些多態(tài)性位點(diǎn)分布在第175－458位氨基酸(NBS結(jié)構(gòu)域)，第583－602位和第796－818位氨基酸區(qū)域(LRR結(jié)構(gòu)域)(圖3~4)。這些NBS和LRR結(jié)構(gòu)區(qū)域的序列多樣性可能對(duì)其抗稻瘟病功能的分化具有重要作用。

M－5000 bp標(biāo)記; 1－Binulawan; 2－IR36; 3－IR8; 4－Carolina Gold; 5－Iguape Cateto; N－日本晴。其中Binulawan、IR36和IR8為秈稻，抗性級(jí)別為0，Carolina Gold和Iguape Cateto為粳稻，抗性級(jí)別為1。

Fig. 1. Blast resistance evaluation of the rice varieties which contain LABR_64 locus.

A: LABR_64-1(上)、LABR_64-2(下)在秈稻感病和抗病品種中的分布，M－5000 bp標(biāo)記；1~12為感病品種；13~24為抗病品種。B: LABR_64-1(上)、LABR_64-2(下)在粳稻感病和抗病品種中的分布，M－5000 bp標(biāo)記；1~12為感病品種；13~24為抗病品種。

Fig. 2. Distribution of LABR_64 inandrice.

圖3 抗稻瘟病基因LABR_64-1序列多樣性分析

Fig. 3. Sequences diversity of rice blast resistance alleles of

Fig. 4. Sequences diversity of rice blast resistance alleles of

2.4 不同單子葉植物中LABR_64直系同源區(qū)段的序列共線性分析

在抗病粳稻和秈稻中，基因與序列一致性高且所在區(qū)域共線性關(guān)系一致(圖5-A)。其中二穗短柄草LABR_64直系同源區(qū)域與水稻比較，發(fā)現(xiàn)直系同源基因差異相對(duì)于的直系同源差異更大，側(cè)翼序列呈共線性排列。我們通過對(duì)基因和所在的200 kb DNA區(qū)段在幾種單子葉植物(包括二穗短柄草、狗尾草、高粱、玉米)中的直系同源區(qū)段的分析，發(fā)現(xiàn)均存在明顯共線性關(guān)系。表明在單子葉植物分化過程中LABR_64直系同源區(qū)域一直保持著共線性，此區(qū)域在不同的單子葉植物中可能均起重要作用。此外，序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)雙子葉植物（如擬南芥、大豆等）均不存在LABR_64直系同源區(qū)域，表明LABR_64區(qū)域?yàn)閱巫尤~植物所特有。

2.5 LABR_64位點(diǎn)的起源

單雙子葉植物分化的時(shí)間節(jié)點(diǎn)在7300萬年前，單子葉植物后續(xù)分化出不同的物種[25-26](圖6)。其中，玉米、高粱祖先大概在4500萬~6000萬年與其他單子葉植物(如小麥、二穗短柄草、水稻等)物種分離，水稻在4000萬~5400萬年前與小麥和二穗短柄草等物種分離。水稻和其他測(cè)試單子葉植物均存在一個(gè)與LABR_64直系同源的共線性區(qū)域(圖5)，因此，LABR_64抗病位點(diǎn)的起源可追溯到單子葉植物分化早期，即5600萬~7300萬年，是一個(gè)古老的抗病位點(diǎn)。

A－日本晴和9311(LABR_64位點(diǎn)在不同粳稻品種中表現(xiàn)為存在或缺失兩種主要類型，而日本晴中缺失LABR_64位點(diǎn)，為了便于共線性分析，圖中三角形區(qū)域表示來自抗病粳稻的LABR_64序列插入日本晴等位區(qū)域)；B－二穗短柄草與水稻；C－粟米與水稻；D－高粱與水稻；E－玉米與水稻。

A, Nipponbare and 9311 (Nipponbare does not contain LABR_64, the triangles represent theandgenes from the resistantvarieties). B, Nipponbare and; C, Nipponbare and; D, Nipponbare and; E, Nipponbare and.

圖5 不同單子葉植物中LABR_64直系同源區(qū)域的序列共線性分析

Fig. 5. Microsynteny of the LABR_64 orthologous regions in different monocotyledons.

3 討論

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，其品種繁多且分布廣泛，同時(shí)水稻也是植物生物學(xué)研究的模式植物之一。相對(duì)水稻的起源與馴化、生長與發(fā)育、產(chǎn)量與品質(zhì)等研究[27-29]而言，水稻抗病性研究相對(duì)滯后，為水稻的分子設(shè)計(jì)育種帶來了潛在風(fēng)險(xiǎn)。本研究關(guān)于抗稻瘟病基因的起源和演化研究可為分子設(shè)計(jì)育種提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)可為其他非模式作物的相關(guān)研究提供重要參考價(jià)值。

在水稻抗稻瘟病研究中，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study, GWAS)挖掘出與抗稻瘟病相關(guān)的位點(diǎn)并進(jìn)一步結(jié)合分子水平功能驗(yàn)證已成為定位和克隆抗稻瘟病基因可靠的新方法。本研究對(duì)通過GWAS分析獲得的LABR_64抗病位點(diǎn)，在227份核心水稻品種資源中進(jìn)行抗性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)LABR_64與抗稻瘟病具有高度相關(guān)性。稻瘟菌接種發(fā)現(xiàn)攜帶這個(gè)位點(diǎn)的水稻品種具有良好的抗性表型，進(jìn)一步從群體水平說明了LABR_64位點(diǎn)與水稻抗性相關(guān)。

圖6 單子葉植物分化的時(shí)間節(jié)點(diǎn)（單位：百萬年）

Fig. 6. Timeline of monocotyledon differentiation (Unit: million years).

我國的地理環(huán)境復(fù)雜，南北氣候差異大，栽培的水稻品種也不同，南方以秈稻為主，北方以粳稻為主[30]。因而南北方稻瘟菌菌株也不盡相同[31]。因此，挖掘并有效利用更多廣譜抗稻瘟病基因是有效防治水稻稻瘟病的途徑。是已克隆的廣譜抗稻瘟病基因之一[21]，LABR_64位于水稻第9染色體等位區(qū)域[32]。LABR_64位點(diǎn)在不同粳稻抗病品種都存在，且不同品種間具有序列多樣性，這些序列多樣性可能對(duì)LABR_64的廣譜抗病功能具有重要作用，LABR_64區(qū)域序列多樣性和其廣譜抗病性之間的關(guān)系和機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

植物中NBS-LRR類型基因家族是抗病基因中最大的家族，其旁系同源基因序列之間差異大、多樣性豐富，通常認(rèn)為其與病原菌的效應(yīng)因子等存在協(xié)同演化關(guān)系[9]。通常情況下，NBS-LRR類型基因在基因組中存在非常高頻率的缺失、加倍、異位插入、同源序列間彼此交換進(jìn)而形成新基因[11]。因此，對(duì)親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)的物種，隨演化時(shí)間尺度的延長，NBS-LRR基因及其側(cè)翼序列的共線性極易被破壞。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，抗稻瘟病位點(diǎn)LABR_64不僅古老，且其包含的基因和及其側(cè)翼基因所在的200 kb區(qū)域在不同的單子葉植物中均保守且呈典型的共線性，雖然它在其他單子葉植物中的直系同源基因的功能尚不明確，但此研究結(jié)果表明，LABR_64直系同源區(qū)段在不同的單子葉植物抗病過程中均可能扮演重要作用。

總之，對(duì)抗稻瘟病位點(diǎn)LABR_64的起源及演化的研究為水稻其他抗病基因的起源與演化分析奠定了基礎(chǔ)，也為將來可能利用近緣物種的優(yōu)良直系同源基因進(jìn)行作物抗病性改良提供了科學(xué)依據(jù)。

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Origin, Distribution and Sequence Diversity of Rice Blast Resistance Locus LABR_64in Rice

DENG Yufei1,2, LIU Minghao2, WANG Dan1, ZUO Shimin3, KANG Houxiang2,*, WANG Guoliang2,*

(Agricultural College,,,;State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pest /,,,;,,,,;,,,;,:,)

【Objective】A better understanding of the origin and distribution of disease resistance genes in rice germplasm is useful for breeding highly resistant varieties.【Method】We analyzed sequence diversity of the rice blast resistance locus LABR_64, which contains two homologous genes,and, is located in the allelic region ofon rice chromosome 9. In addition, we analyzed the microsynteny of the LABR_64 orthologous region in different monocotyledons.【Result】The presence frequency (PF) of LABR_64 is 16%. All of therice cultivars carrying LABR_64 are highly resistant to rice blast and all of those without the locus are susceptible. In addition, the PF of LABR_64 in thesubpopulation is lower than 5%. Although LABR_64 is correlated with the resistance to rice blast, manyrice cultivars without LABR_64 are also resistant to rice blast. We also found that thesequence is much conserved. Moreover, the microsynteny analysis of the LABR_64 orthologous region in different monocotyledons indicated that LABR_64 originates after the separation of the monocotyledonous and dicotyledonous species, and at the early differentiation stage of monocotyledons.【Conclusion】The rice blast resistance phenotypes are closely correlated with the presence of the LABR_64 locus insubpopulation, but not in, indicating that there are many other resistance loci in thesubpopulation. Thesequence can be used for developing molecular markers in marker-assisted rice blast resistance breeding. It also indicated that LABR_64 may play a role in disease resistance in different monocotyledons.

rice; rice blast resistance gene; sequence diversity; gene origin

10.16819/j.1001-7216.2019.8017

S435.111.4+1; S511.034

A

1001-7216(2019)01-0020-08

2018-02-08；

2018-06-27。

國家自然科學(xué)基金國際合作重點(diǎn)項(xiàng)目(31461143019)；江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項(xiàng)目(PZCZ201703)。