林添資?孫立亭?龔紅兵?王益華?劉玲瓏?趙志剛?江玲?萬(wàn)建民, *

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一個(gè)水稻低溫移栽白條紋突變體的鑒定和基因定位

林添資1, 2孫立亭2龔紅兵2王益華1劉玲瓏1趙志剛1江玲1萬(wàn)建民1, *

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/長(zhǎng)江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210095;2江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 江蘇 句容 212400;*通訊聯(lián)系人, E-mail: wanjm@njau.edu.cn)

【目的】葉色突變相關(guān)基因的鑒定與克隆為研究葉綠體發(fā)育、葉綠素合成和光合作用等分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。【方法】從常規(guī)粳稻鎮(zhèn)糯19雜交后代中分離出一個(gè)低溫移栽后葉色轉(zhuǎn)成白條紋的自然變異突變體, 命名為。成熟期測(cè)定野生型和的主要農(nóng)藝性狀，分別在苗期、移栽后15 d和同時(shí)期直播條件下測(cè)定新生葉片的色素含量并觀察葉綠體的超微結(jié)構(gòu)；將和野生型正反交進(jìn)行遺傳分析；用與秈稻9311雜交產(chǎn)生的F2作為定位群體進(jìn)行基因定位；采用RT-qPCR 分析葉綠體發(fā)育、葉綠素合成和光合作用相關(guān)基因在野生型和中的表達(dá)水平。【結(jié)果】突變體在苗期表現(xiàn)正常綠色，移栽15 d后心葉出現(xiàn)白條紋葉表型，至分蘗末期心葉葉色恢復(fù)；而不經(jīng)移栽，突變體不會(huì)出現(xiàn)白條紋葉。人工模擬實(shí)驗(yàn)表明該表型是由低溫條件下根損傷引起的。與野生型相比，突變體移栽后的新生葉色素含量顯著降低，光合速率下降；同時(shí)株高變矮，穗長(zhǎng)、劍葉長(zhǎng)和每穗粒數(shù)均顯著降低。葉綠體的超微結(jié)構(gòu)顯示，突變體的葉肉細(xì)胞中，僅少數(shù)細(xì)胞含有正常的葉綠體，其余大部分葉肉細(xì)胞不含葉綠體。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變體中部分光合系統(tǒng)相關(guān)基因和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，葉綠素生物合成相關(guān)的14個(gè)基因表達(dá)也下調(diào)。遺傳分析表明，該突變性狀受一對(duì)隱性核基因控制。利用突變體/9311的F2群體，將該基因定位于水稻第2染色體著絲粒附近853 kb區(qū)間內(nèi)。目前，該區(qū)間內(nèi)沒(méi)有葉色相關(guān)基因的報(bào)道。【結(jié)論】是低溫條件下移栽調(diào)控葉片轉(zhuǎn)色的關(guān)鍵基因，在葉綠體發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

水稻；移栽葉片轉(zhuǎn)色；葉綠體發(fā)育；基因定位

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，也是植物體內(nèi)很多有機(jī)大分子如淀粉、脂類和氨基酸的合成場(chǎng)所[1]，因此葉綠體的正常發(fā)育對(duì)植物至關(guān)重要。葉綠體存在缺陷的突變體往往表現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的異常葉色表型，如葉色淡綠、黃化、白條紋、斑馬葉等，并通常伴隨有一系列生長(zhǎng)發(fā)育缺陷，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致植株死亡[2-4]。葉色突變與植物光合作用[5]、激素生理[6]和光形態(tài)建成[7]等密切相關(guān)，對(duì)它們的研究有助于闡明光合作用機(jī)制、葉綠素生物合成及代謝途徑以及葉綠體發(fā)育的調(diào)控機(jī)理，為開(kāi)展水稻高光效育種提供理論基礎(chǔ)。此外，水稻的葉色變異可用作標(biāo)記性狀剔除假雜種，提高種子純度，降低制種風(fēng)險(xiǎn)[8]。因此，水稻葉色變異相關(guān)基因的克隆及功能分析具有重要的理論意義和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

迄今為止，關(guān)于葉色突變的研究很多。突變基因在水稻12條染色體上均有分布，大多數(shù)突變性狀受單隱性核基因控制[9]，而由細(xì)胞質(zhì)基因和顯性基因控制的葉色突變很少[10-11]。引起葉色變異的機(jī)理主要有葉綠素代謝途徑受阻[12-13]和葉綠體發(fā)育進(jìn)程受阻[14-15]兩類。高等植物中，葉綠素的生物合成途徑已基本明確[16-17]，水稻中，已克隆的參與葉綠素合成途徑的基因分別為編碼鎂離子螯合酶D、I、H三個(gè)亞基的、和基因[18-19]，編碼鎂離子原卟啉Ⅸ單酯環(huán)化酶的基因[2]，編碼脫酯基葉綠素酸酯a乙烯基還原酶的基因[20]，編碼NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶A和B的基因[21]和[22]，編碼葉綠素合成酶的基因[23]，編碼葉綠素酸酯a加氧酶的基因[12]和[13]，參與這個(gè)途徑的任何一個(gè)基因發(fā)生改變都會(huì)導(dǎo)致葉色變異。

葉綠體發(fā)育受阻不僅直接影響葉綠體的發(fā)育，同時(shí)會(huì)間接影響葉綠素的合成?？刂迫~綠體發(fā)育的基因主要有以下幾類：一是質(zhì)體轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，如[24]、[25]、[3]、[26]；二是PPR蛋白，如[8]、[27]、[28]；三是葉綠體蛋白酶，如[29]、[30]；四是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，如[31]。由于葉色形成過(guò)程十分復(fù)雜，涉及到多方面的生理生化反應(yīng)，因此葉色變異的分子機(jī)制仍然不是十分清楚，挖掘、鑒定新的葉色突變相關(guān)基因?qū)M(jìn)一步闡明水稻葉色調(diào)控的分子機(jī)制具有十分重要的意義。

本研究從常規(guī)粳稻鎮(zhèn)糯19后代中發(fā)現(xiàn)一個(gè)移栽后葉色轉(zhuǎn)成白條紋的自然變異突變體。對(duì)該突變體移栽前后的葉色表型、葉色轉(zhuǎn)變條件、光合特性等進(jìn)行分析，并構(gòu)建群體對(duì)突變性狀進(jìn)行了遺傳分析和基因定位，同時(shí)從植物生理、細(xì)胞和分子水平闡述的突變機(jī)理，以期為該基因克隆和功能分析奠定基礎(chǔ)，揭示調(diào)控葉色的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

來(lái)源于鎮(zhèn)糯19后代自然突變，經(jīng)10代連續(xù)自交獲得，移栽后出現(xiàn)的白條紋性狀在江蘇句容、海南陵水都能穩(wěn)定遺傳。

1.2 wltt表型特征及主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所行香基地種植和野生型親本。5月15日播種，5葉1心期移栽，單本栽插，常規(guī)田間管理，觀察在不同時(shí)期的葉色變化。成熟期分別取和野生型親本各5株，考查株高、單株有效穗、劍葉長(zhǎng)、穗長(zhǎng)、每穗總粒數(shù)、千粒重和結(jié)實(shí)率等主要農(nóng)藝性狀。

1.3 剪根、光照和溫度處理

水稻幼苗在水培條件下生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)液配制采用國(guó)際水稻所營(yíng)養(yǎng)液配方[32]，放置在光照培養(yǎng)箱(HP400GS-C)中，溫度設(shè)置為20℃和30℃，光照強(qiáng)度設(shè)置為25 000 lx和6 250 lx，光照和黑暗各12 h，溫度和光照強(qiáng)度兩兩組合，利用4臺(tái)光照培養(yǎng)箱設(shè)置不同溫度和光照強(qiáng)度。幼苗生長(zhǎng)3葉1心時(shí)，剪根，留1 cm左右，繼續(xù)生長(zhǎng)2個(gè)葉齡，進(jìn)行拍照和色素含量測(cè)定。

1.4 色素含量測(cè)定

取突變體與其野生型新完全展開(kāi)葉，去掉中間葉脈，測(cè)定方法參照Wu等[23]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在分蘗期移栽后表型出現(xiàn)時(shí)期進(jìn)行。

1.5 光合速率測(cè)定

利用光合速率測(cè)定儀LI-6400XTOPEN 6.1測(cè)定自然條件下野生型和突變體正常移栽后分蘗期新生葉片的凈光合速率，選取紅藍(lán)光源，葉室內(nèi)的光照強(qiáng)度是1500 μmol/(m2·s)，CO2濃度為400~420 μmol/mol, 葉片溫度為25℃~28℃；葉室內(nèi)空氣濕度為40%~60%，將葉片夾入葉室后，數(shù)據(jù)穩(wěn)定進(jìn)行測(cè)量，在上午9:00?11:00進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法詳見(jiàn)說(shuō)明書。野生型和突變體各測(cè)5株，每株測(cè)3次。

1.6 葉綠體透射電鏡分析

利用透射電鏡(Transmission Electron Microcope, TEM)進(jìn)行葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察。移栽后15 d，分別取突變體和野生型新完全展開(kāi)葉的中上部，去掉中間葉脈，固定于含有2.5%的戊二醛溶液中，抽真空，4℃下固定12 h，沖洗后用1%鋨酸溶液(pH 7.2)后固定4 h，經(jīng)30%、50%、70%、80%、90%、100%酒精梯度脫水后，環(huán)氧樹脂SPURR包埋、聚合。之后用LKB-V型切片機(jī)將樣品切成1 μm厚的切片，醋酸鈾染色后，經(jīng)透射電鏡(JEM-1230)觀察、照相。

1.7 遺傳分析及作圖群體構(gòu)建

用突變體和野生型親本正反交得到F1，自交獲得F2種子，并在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所行香基地種植，移栽后統(tǒng)計(jì)F2群體中突變表型和正常表型的植株數(shù)，計(jì)算分離比，并進(jìn)行χ2測(cè)驗(yàn)。用與秈稻9311雜交產(chǎn)生的F2作為定位群體，從F2群體中選取移栽后表現(xiàn)白條紋的單株(共3364份)，進(jìn)行基因定位。

1.8 基因定位

采用SDS法[33]提取水稻基因組DNA。利用均勻分布于水稻12條染色體上的InDel標(biāo)記(引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)進(jìn)行親本多態(tài)性分析。用有多態(tài)的引物對(duì)/9311的F2群體中選取的移栽后表現(xiàn)白條紋的單株進(jìn)行連鎖分析及精細(xì)定位，所用定位引物見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 葉綠素合成和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)分析

使用天根公司的植物RNA小量提取試劑盒，對(duì)野生型和突變體移栽后15 d的新完全展開(kāi)葉提取RNA，提取步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書。反轉(zhuǎn)錄步驟參照TaKaRa公司(日本)的說(shuō)明書。實(shí)時(shí)PCR 20 μL反應(yīng)體系如下：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，10 μmol/L的正、反向引物0.4 μL，SYBRGreen混合物(TaKaRa公司) 10 μL，最后補(bǔ)去離子水至20 μL。反應(yīng)在ABI 7500 實(shí)時(shí) PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序參照Applied Biosystems操作手冊(cè)，水稻的基因作為內(nèi)參。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。按2方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量[34]。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體wltt的表型鑒定

通過(guò)對(duì)突變體的葉色觀察，發(fā)現(xiàn)在苗期，突變體與野生型無(wú)顯著差異，葉片表現(xiàn)出正常綠色(圖1-A)。6月10日移栽，15 d(大田日均溫均值24.5℃)后，突變體新生葉片表現(xiàn)出白條紋癥狀，而老葉維持葉色不變(圖1-B)；至成熟期，突變體葉色恢復(fù)正常(圖1-D)；7月10日移栽，15 d后(大田日均溫31.7℃)突變體表型與野生型無(wú)差異；在齊穗期進(jìn)行移栽，15 d后(大田日均溫24.3℃)再生分蘗同樣表現(xiàn)出白化(圖1-C)；而采用直播(不移栽)的方式種植的野生型和突變體植株全生育期葉色無(wú)明顯差異(圖1-E)。上述結(jié)果表明，表型的產(chǎn)生與移栽有關(guān)，且移栽后的相對(duì)低溫對(duì)于白條紋表型的形成起著重要的作用。與野生型相比，正常移栽的突變體(6月10日移栽)新生葉片凈光合速率比野生型顯著降低(圖1-F)。成熟期的農(nóng)藝性狀測(cè)定表明，株高明顯下降(圖1-D, 表2)，同時(shí)穗長(zhǎng)、劍葉長(zhǎng)和每穗粒數(shù)亦明顯降低，表明突變體的葉色變異顯著影響了植株的生長(zhǎng)發(fā)育。

表1 基因定位引物

A?苗期；B?分蘗期，移栽后15 d，右上角為野生型(左)和突變體(右)的新完全展開(kāi)葉；C?抽穗期移栽后15 d，右上角為野生型(左)和突變體(右)的再生分蘗的葉片；D?6月10日正常移栽的成熟期植株；E?直播條件下分蘗期的植株；F?正常移栽分蘗期植株新生葉片的凈光合速率。WT?野生型。**表示經(jīng)t測(cè)驗(yàn)后，P<0.01下差異顯著。

Fig. 1. Phenotypic characterization of themutant and its wild type(WT).

2.2 突變體與野生型的色素含量測(cè)定

通過(guò)測(cè)定突變體及其野生型葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量發(fā)現(xiàn)，苗期的各色素含量與野生型無(wú)顯著差異；分蘗期移栽15 d后，的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量及總的色素含量明顯下降，與野生型相比，差異極顯著；而直播條件下，分蘗期的突變體的各色素含量與野生型相比，差異不顯著(圖2)。

2.3 突變體中葉綠體的超微結(jié)構(gòu)變化

利用透射電鏡(TEM)觀察了移栽轉(zhuǎn)色后野生型和突變體的葉綠體超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，突變體的葉肉細(xì)胞與野生型相比(圖3-A, C)，大部分葉肉細(xì)胞不正常，觀察不到葉綠體(圖3-D)，但也有少數(shù)葉肉細(xì)胞能觀察到葉綠體(圖3-E)，且葉綠體中含有豐富的類囊體，其片層結(jié)構(gòu)與野生型無(wú)顯著差異(圖3-F)。這一結(jié)果與白條紋突變性狀(白綠相間)一致。

表2 野生型與突變體wltt的主要農(nóng)藝性狀比較

**表示經(jīng)測(cè)驗(yàn)后，在<0.01下差異顯著。

**The difference between the wild type andis significant at0.01 level according to Student’stest.

Chla-葉綠素a；Chlb-葉綠素b；Car-類胡蘿卜素；Total-總色素含量。誤差線表示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。**表示野生型與突變體間差異達(dá)0.01顯著水平（t測(cè)驗(yàn)）。

Fig. 2. Pigment contents in leaves ofmutant and its wild type(WT).

2.4 光合系統(tǒng)和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)分析

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，為研究該突變是否影響葉綠體發(fā)育，我們分析了移栽前后葉綠體發(fā)育和部分光合系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)(圖4)。結(jié)果表明，在突變體中，葉綠體發(fā)育相關(guān)基因，如編碼轉(zhuǎn)運(yùn)RNA聚合酶的家族的基因(、和)，低溫移栽后只有表達(dá)極顯著上調(diào)表達(dá)(圖4-A)；而移栽前，、和全部上調(diào)表達(dá)，均達(dá)到極顯著水平(圖4-B)。葉綠體能量代謝相關(guān)酶編碼基因，如編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的大小亞基和；編碼NADH脫氫酶的和及編碼ATP合酶的和在突變體中低溫移栽后全部下調(diào)(圖4-A)，而移栽前只有和在突變體中上調(diào)表達(dá)，其他基因無(wú)顯著差異(圖4-B)。在突變體中，光合系統(tǒng)相關(guān)基因，如編碼光系統(tǒng)Ⅱ和Ⅰ蛋白復(fù)合物的基因家族的和基因在低溫移栽后全部下調(diào)表達(dá)，而移栽前這些基因的表達(dá)無(wú)顯著差異。這些結(jié)果表明，葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)模式在移栽前后差異顯著，移栽后大量的基因表達(dá)量下調(diào)，這很可能導(dǎo)致葉綠體發(fā)育缺陷。

2.5 葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

高等植物中葉綠素的合成過(guò)程十分復(fù)雜，突變體的色素含量比野生型顯著降低，葉綠素的合成受到抑制，我們進(jìn)一步分析了移栽前后突變體中葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平(圖5)。結(jié)果表明，突變體中，葉綠素生物合成的三個(gè)限速酶基因，如(編碼谷氨酸-tRNA還原酶)、(編碼鎂離子螯合酶D亞基)、(編碼鎂離子螯合酶Ⅰ亞基)、(編碼葉綠素合成酶)在低溫移栽后均下調(diào)表達(dá)(圖5-A)；而移栽前和表達(dá)下調(diào)，和表達(dá)無(wú)差異(圖5-B)。其他的葉綠素生物合成基因，如(編碼谷氨酸-1-半縮醛氨基轉(zhuǎn)移酶)、(編碼δ-氨基酮戊酸脫水酶)、(編碼原脫氨酶)、(編碼尿卟啉原Ⅲ脫羧酶)、(編碼糞卟啉Ⅲ氧化酶)、(編碼鎂離子原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶)、(編碼鎂離子原卟啉Ⅸ單甲基脂環(huán)氧化酶)、(編碼脫酯基葉綠素酸酯a乙烯基還原酶)、(編碼NADPH-原葉綠素酸酯氧化還原酶)、(編碼葉綠素合成酶)，低溫移栽后均下調(diào)表達(dá)(圖5-A)；移栽前基因和的表達(dá)水平在突變體中下調(diào)(圖5-B)。這些結(jié)果表明，突變體的部分葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)在移栽前后均有所下調(diào)，但似乎對(duì)移栽后的基因表達(dá)影響更大。

A~C為野生型的葉綠體超微結(jié)構(gòu)；D~F為突變體wltt中同時(shí)含有異常結(jié)構(gòu)的葉綠體(D)和正常結(jié)構(gòu)的葉綠體(E~F)。Cp-葉綠體; Thy?類囊體; OB-嗜鋨體。

Fig. 3. Transmission electron microscopic (TEM) images of chloroplast ultrastructure in the wild type and themutant.

誤差線表示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。**表示野生型與突變體間差異達(dá)0.05和0.01顯著水平（t測(cè)驗(yàn)）。

Fig. 4. Expression analysis of genes associated with chloroplast development and photosynthetic system in the wild type(WT) andmutant.

誤差線表示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。*和**分別表示野生型與突變體間差異達(dá)0.05和0.01顯著水平（t測(cè)驗(yàn)）。

Fig. 5. Expression analysis of genes associated with chlorophyll biogenesis in the wild type(WT) andmutant.

2.6 突變體葉片轉(zhuǎn)色的影響因素

連續(xù)兩年觀察發(fā)現(xiàn)，在梅雨季節(jié)結(jié)束之前(相對(duì)低溫，弱光照)移栽心葉出現(xiàn)白條紋表型，而在梅雨季節(jié)后(高溫，強(qiáng)光照)移栽無(wú)此表型。為研究葉片轉(zhuǎn)色與機(jī)械損傷、光照、溫度的關(guān)系，對(duì)幼苗進(jìn)行剪根處理。結(jié)果表明，不進(jìn)行剪根處理，在不同光照(25 000 lx和6 250 lx)和溫度(20℃和30℃)條件下(兩兩組合)，表型與野生型無(wú)差異(圖6-A)；在20℃下，光照強(qiáng)度在25 000 lx(圖6-B)和6520 lx(圖6-C)條件下，新生葉片均出現(xiàn)白條紋癥狀，同時(shí)，的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量及總色素含量明顯下降，與野生型相比，差異極顯著(圖7)；在30℃下，光照強(qiáng)度在25 000 lx和6250 lx條件下，突變體新生葉片均未轉(zhuǎn)色，相應(yīng)的的各色素含量與野生型相比無(wú)顯著差異(圖7)。這些結(jié)果表明，突變體新生葉片出現(xiàn)白條紋表型是由根系損傷和低溫(20℃)引起的，與光照強(qiáng)度無(wú)關(guān)。

A－不進(jìn)行剪根處理；B, C-剪根處理10 d后，20℃條件下，光照強(qiáng)度為25 000 lx(B)和6250 lx(C)；D, E-剪根處理10 d后，30℃條件下，光照強(qiáng)度為25 000 lx(D)和6250 lx(E)。

Fig. 6. Effects of environmental conditions on leaf color variation.

2.7 突變體的遺傳模式及基因定位

為確定突變體的遺傳特性，我們進(jìn)行了正反交實(shí)驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)了后代的分離比例。結(jié)果表明，無(wú)論突變體用作母本還是父本，相應(yīng)的F1植株移栽后新生葉片均表現(xiàn)出正常綠色，其自交后代F2群體移栽后新生葉片顏色表現(xiàn)出明顯分離，且正常綠色與白條紋植株數(shù)比值符合3∶1(表3)，這說(shuō)明該性狀是由一對(duì)隱性核基因控制的。

將突變體與秈稻9311雜交，從其F2代挑取移栽后表現(xiàn)為白條紋的單株共3364株作為定位群體，利用均勻分布在水稻12條染色體上的InDel標(biāo)記將基因初定位在第2染色體著絲粒附近區(qū)域，兩端標(biāo)記為I2-5和I2-8，遺傳距離分別是50.0 cM和58.4 cM(圖8)。為精細(xì)定位，利用Primer 5.0軟件，開(kāi)發(fā)出兩親本之間有多態(tài)的引物11對(duì)(表1)，最終將基因定位于標(biāo)記L22和L26之間，物理距離為853 kb(圖8)，標(biāo)記I2-6為共分離標(biāo)記。

3 討論

本研究中的葉色突變體的葉色表型為綠-白-綠，與之前Shi等[35]獲得的移栽敏感葉綠體發(fā)育缺陷突變體的表型有相似之處，即在移栽15 d后，新生的3~4片葉表現(xiàn)出白化表型，隨后的葉片恢復(fù)綠色，表型均在移栽后出現(xiàn)。不同的是，基因位于第11染色體，編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在黑暗條件下(移栽后的葉原基處于土壤中)的質(zhì)體發(fā)育中發(fā)揮重要的作用；突變體即使經(jīng)剪根處理在水培(光照補(bǔ)償)條件下，移栽后也不出現(xiàn)白條紋葉的表型，與光照有關(guān)，與溫度無(wú)關(guān)。本研究中，突變體經(jīng)剪根處理在水培條件下移栽，低溫(20℃)生長(zhǎng)15 d，葉片出現(xiàn)白條紋癥狀；而在較高溫度(30℃)無(wú)突變表型，并與光照強(qiáng)度無(wú)關(guān)；在大田條件下(葉原基處于黑暗條件)，也表現(xiàn)出移栽低溫敏感特性。因此，突變體的葉色變異是由低溫(20℃)條件下根系損傷造成的，與光照無(wú)關(guān)。然而，突變體的低溫敏特性，又有別于其他的葉色低溫敏突變體；已成功克隆的5個(gè)葉色低溫敏突變基因，即[36]、[37]、[38]、[39]和[40]，這些基因突變后，對(duì)應(yīng)的突變體均是在低溫條件下出現(xiàn)白條紋表型，在高溫條件下葉色恢復(fù)正常；突變體只有根系損傷后才表現(xiàn)出低溫敏特性?；诒静牧系奶厥庑?，該突變體為研究水稻葉片生長(zhǎng)發(fā)育、葉綠體發(fā)育及移栽后根系重建等機(jī)理提供了理想材料。

誤差線表示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差。**表示野生型與突變體間差異達(dá)0.01顯著水平（t測(cè)驗(yàn)）。

Fig. 7. Effects of environmental conditions on pigment contents after root cutting treatment.

表3 野生型與wltt突變體的F2代分離比

A－基因位點(diǎn)初定位在第2染色體著絲粒附近InDel標(biāo)記I2-5和I2-8之間；B-基因位點(diǎn)精細(xì)定位到標(biāo)記L22和L26之間，物理距離853 kb。n為定位所用的白條紋葉植株數(shù)。

Fig. 8. Location ofon rice chromosome 2.

葉綠體是植物特有的細(xì)胞器，也是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所。通過(guò)對(duì)葉綠體透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)突變體中既含有正常的葉綠體結(jié)構(gòu)，也含有只存在嗜鋨體、無(wú)類囊體片層結(jié)構(gòu)的葉綠體，說(shuō)明突變體的葉綠體發(fā)育受到影響。光反應(yīng)相關(guān)蛋白編碼基因表達(dá)量的改變會(huì)影響葉綠體光系統(tǒng)的形成，、編碼PSⅠ合成相關(guān)亞基[41]，其中PsaA和PsaB蛋白結(jié)合形成光合電子傳遞鏈的最初電子供體P700[42]，基因用于編碼光系統(tǒng)Ⅱ核心復(fù)合物；在突變體中，低溫移栽后這些基因表達(dá)均下調(diào)，說(shuō)明葉綠體的光系統(tǒng)受到影響。葉綠體中mRNA的轉(zhuǎn)錄對(duì)其發(fā)育至關(guān)重要，mRNA轉(zhuǎn)錄需要RNA聚合酶的參與，植物葉綠體內(nèi)有4個(gè)基因編碼RNA聚合酶：、、和；RNA聚合酶基因缺失后，植株色素含量降低，葉綠體內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)育不完整[43]；移栽前，突變體中上述4個(gè)基因全部上調(diào)，推測(cè)基因突變后反饋增強(qiáng)了RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄，以彌補(bǔ)的缺陷對(duì)葉綠體發(fā)育的影響；而低溫移栽后只有表達(dá)略有上調(diào)，其他3個(gè)基因的表達(dá)量與野生型無(wú)差異，因而與移栽前相比，對(duì)葉綠體發(fā)育缺陷的補(bǔ)償效應(yīng)減弱甚至消失，從而造成了葉綠體發(fā)育的缺陷。核糖體大、小亞基參與葉綠體基因蛋白翻譯過(guò)程，敲除葉綠體核糖體小亞基編碼基因后，葉片表現(xiàn)出白化，植株不能存活[44]；核糖體大亞基編碼基因缺失后，葉片發(fā)育受到影響，植株光合速率下降[45]；在突變體中，低溫移栽后核糖體大、小亞基均表達(dá)下調(diào)，這與其表現(xiàn)出白條紋癥狀及光合速率下降相吻合。ATP合酶與NADH脫氫酶參與葉綠體內(nèi)的能量代謝，小麥葉綠素缺失突變體中，白化株的家族基因全部表達(dá)下調(diào)[46]；在突變體中，低溫移栽后基因、、和均表達(dá)下調(diào)，則推測(cè)光合電子傳遞中的耗能過(guò)程不能正常進(jìn)行，而移栽前和表達(dá)上調(diào)，推測(cè)基因突變后首先激活了NADH脫氫酶的轉(zhuǎn)錄，隨著表型的出現(xiàn)，該基因轉(zhuǎn)錄水平下降。因此，控制突變體葉片轉(zhuǎn)色的基因可能是葉綠體發(fā)育的關(guān)鍵基因。葉綠體發(fā)育受阻間接影響葉綠素合成，在突變體中，低溫移栽后參與葉綠素生物合成的14種酶的編碼基因表達(dá)大部分下調(diào)，葉綠素的生物合成受到抑制，這與突變體色素含量下降一致。而移栽前，部分葉綠素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，這表明基因突變抑制了部分葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)，與表型出現(xiàn)與否無(wú)直接關(guān)聯(lián)。

本研究通過(guò)/9311的F2群體，將基因定位于第2染色體著絲粒附近，物理距離相距853 kb。由于臨近著絲粒區(qū)交換冷點(diǎn)，盡管使用了較大的定位群體，進(jìn)一步縮小區(qū)間仍存在一定困難。目前，在水稻第2染色體上已經(jīng)報(bào)道了12個(gè)與葉色相關(guān)的基因，其中表現(xiàn)白化或白條紋性狀的有3個(gè)，分別是(t)[47]、[48]和[49]。(t)突變體的表型是在3葉期白化，4葉期恢復(fù)為正常綠色，突變體表現(xiàn)為苗期葉片白色和淡綠色橫向相間的斑馬葉，突變體幼苗白化死亡，這3個(gè)基因均不在突變體基因定位的區(qū)間內(nèi)；而且，該區(qū)間沒(méi)有葉色相關(guān)基因的報(bào)道，表明為一個(gè)新的葉色基因。進(jìn)一步克隆和鑒定的功能，將有助于提高我們對(duì)環(huán)境因子(如溫度、植傷誘導(dǎo)等)影響葉綠體發(fā)育的機(jī)制的深入理解。

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Identification and Gene Mapping of aMutant in Rice

LIN Tianzi1, 2, SUN Liting2, GONG Hongbin2, WANG Yihua1, LIU Linglong1, ZHAO Zhigang1, JIANG Ling1, WAN Jianmin1,*

(State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Biology, Genetics and Breeding of japonica Rice in Mid-lower Yangtze River, Ministry of Agriculture/The Yangtze River Valley Hybrid Rice Collaboration Innovation Center/Jiangsu Collaboration Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210095, China;Zhenjiang Agricultural Research Institute, Jurong 212400, China;*)

【Objective】Isolation and characterization of leaf-color mutation related genes lays a firm theoretical foundation for dissecting the molecular mechanism underlying chloroplast development, chlorophyll biosynthesis, and photosynthesis in rice. 【Method】A spontaneous leaf-color mutant, termed aswas obtained from the progeny ofcultivar Zhennuo 19. The main agronomic traits of the wild type andwere determined at maturity. The pigment contents and ultrastructure of chloroplast of newly emerged leaves were analyzed at the seedling stage, fifteen days after transplanting, at the tillering stage under direct seeding. Genetic analysis was carried out by reciprocal cross of the wild type and. An F2population derived from the cross×9311 was used for gene mapping. Quantitative RT-PCR was carried out to analyze the relative expression of genes associated with chloroplast development and chlorophyll biogenesis in the wild type and themutant. 【Result】The white-striped leaves in themutant only emerged at 15 days after transplanting at low temperature such as 20℃. No white-striped leaf was observed under direct seeding treatment. However, leaves of the mutant developed normally at the late tillering stage. Simulation experiments showed that the mutant phenotype was caused by root injury at low temperature. Compared with the wild type, the pigment contents in white-stripe leaves of themutant were significantly decreased, accompanying by reduced photosynthetic rate. Simultaneously, most of the mesophyll cells had no chloroplasts. The expression levels of genes associated with chloroplast development, chlorophyll biosynthesis, and photosynthetic system were all down-regulated in the mutant. At maturity, the mutant was featured with reduced plant height, panicle length, flag leaf length and number of spikelets per panicle relative to its wild type. Genetic analysis revealed that the mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear gene. Moreover, thegene was mapped within an 853 kb region near the centromere on chromosome 2, between InDel markers L22 and L26, in which no gene related to leaf color was reported. 【Conclusion】is a key gene regulating leaf color after transplanting at low temperature, which plays an important role in chloroplast development.

rice; white-stripe leaf after transplanting; chloroplast development; gene mapping

10.16819/j.1001-7216.2018.8026

Q343.5; S511.034

A

1001-7216(2019)01-0001-11

2018-03-13；

2018-05-29。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(2017YFD0100400)；江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(BE2015363)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金資助項(xiàng)目[CX(16)1029]。