符金華， 楊琳芬， 董澤民*， 徐國(guó)茂， 姜文娟 ， 邢 磊，黃艷清， 李瑾瑾， 周仁丹， 葉 金， 吳 宇， 廖 豐

（1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌 330096；2.南昌大學(xué)分析測(cè)試中心，江西南昌 330047；3.國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京西城 100037；4.雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司，江西南昌 330096）

霉菌毒素是真菌在適宜環(huán)境條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其對(duì)人和畜禽具有致癌、致畸、致突變作用（朱聰英等，2010）。飼料及其原料特別易于被霉菌毒素污染（Binder等，2007），從而降低飼料的口感與質(zhì)量，給畜牧業(yè)發(fā)展和畜產(chǎn)品安全造成極大的危害。其中，對(duì)人和畜禽毒性較大毒害的主要有黃曲霉毒素、嘔吐毒素、T-2毒素和玉米赤霉烯酮等數(shù)十種（Marin 等，2013；鄭翠梅等，2012）。因此，飼料及原料中各種毒素的限量和檢測(cè)要求日趨嚴(yán)格。

目前，霉菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法（TLC） 、熒光/酶聯(lián)免疫法（ELISA） 、高效液相色譜法（HPLC）及氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）等（朱 聰英等 ，2010；Cavaliere 等，2007；Chiar 等 ，2007）。雖然在一定程度上能夠滿足目前部分毒素的檢測(cè)，但也存在諸多問題。如TLC法的穩(wěn)定性和重復(fù)性差，易受外界環(huán)境的干擾；ELISA法通常作為篩選方法，不能準(zhǔn)確定量，且易出現(xiàn)假陽性；HPLC法容易受到基質(zhì)干擾，檢測(cè)通量不夠，且部分毒素的檢測(cè)限達(dá)不到限量標(biāo)準(zhǔn)要求；GC-MS法的操作步驟繁瑣，衍生化的效率低等。另外，實(shí)際的飼料樣品中霉菌毒素污染通常是多種霉菌毒素同時(shí)污染 （Monbaliu等，2009），而這些方法檢測(cè)的毒素種類比較單一。

因此，開發(fā)出飼料及原料中多種霉菌毒素一步檢測(cè)方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）是一種集高效分離和多組分同時(shí)定性、定量于一體的檢測(cè)技術(shù)，具有較強(qiáng)抗基體干擾能力、高通量、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，成為近年來痕量檢測(cè)中發(fā)展非常快的新技術(shù)之一 （Markus等，2012；Johannes等，2012；Mira等，2010；Micheal等，2009）。 但HPLC-MS/MS法均需要專用的前處理設(shè)備耗材，提取凈化步驟繁瑣，且霉菌毒素的檢測(cè)種類面仍然比較窄 （Shephard 等，2012；趙孔祥等，2011）。 本研究建立了一種飼料及原料中16種霉菌毒素的超高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜檢測(cè)法（Q-trap-UPLC-MS/MS）。樣品經(jīng)簡(jiǎn)單的提取、同位素稀釋后直接檢測(cè)，不需要過多功能凈化柱及脫脂等操作，實(shí)現(xiàn)了一次前處理和一針進(jìn)樣，同時(shí)精確檢測(cè)16種霉菌毒素。該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、低成本、定量準(zhǔn)確，對(duì)批量飼料及原料樣品中霉菌毒素的快速監(jiān)測(cè)意義重大。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑 質(zhì)譜型號(hào)為Sciex4500 Qtrap（美國(guó) Sciex公司）；液相為島津LC-20AD XR（日本Shimadzu公司）；赫西離心機(jī)（中國(guó) 湖南赫西儀器裝備有限公司）；HY-3多功能振蕩器 （中國(guó)江蘇光都機(jī)電設(shè)備有限公司）：Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；METTLER TOLEDO ME104分析天平（中國(guó) 梅特勒-托利多（上海）有限公司）。

甲醇、乙腈（HPLC級(jí)，德國(guó)Merck公司）；乙酸銨、甲酸、乙酸（HPLC 級(jí)，美國(guó) Sigma公司）；0.2 μm PTFE膜針頭過濾器 （PALL公司）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。分別移取一定體積的16種霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液 （濃度為0.01～2.5μg/mL，購自Romer公司）于10mL容量瓶中，水定容，得到16種霉菌毒素混標(biāo)，于-20℃保存，濃度詳見表1。

表1 真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度及相應(yīng)的穩(wěn)定同位素混合溶液

穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)混合工作液：分別移取一定體積的14種霉菌毒素穩(wěn)定同位素單標(biāo) （濃度為0.01～2.5μg/mL，購自 Romer公司）于 4mL儲(chǔ)液瓶中，用水稀釋至2mL配制穩(wěn)定同位素混標(biāo)，充分混勻后于-20℃避光保存。準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備液，用乙腈-水-乙酸溶液（35：64.5：0.5）逐級(jí)稀釋，配制成不同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。向400μL內(nèi)插管中加入20μL 14種穩(wěn)定同位素混合工作液，再分別吸取180μL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液于內(nèi)插管中，渦旋混勻后準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。1.2 實(shí)驗(yàn)方法 液相色譜條件：Waters公司CORTECSTM UPLC C18柱 （100 mm ×2.1 mm，1.6μm）；柱溫40℃；進(jìn)樣量2μL；流動(dòng)相A為甲醇，B為含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）的甲酸和1mmol/L乙酸銨的水溶液；流速為0.3mL/min；采用梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：加熱電噴霧離子源溫度為500℃；噴霧電壓為5500 V；離子傳輸管溫度為320℃；gas1和 gas2均為50 psi，氣簾氣為35 psi。EPI掃描速度 10000 Da/s，掃描質(zhì)量范圍50～1000，分段多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式，MRM檢測(cè)窗口設(shè)置為30 s，錐孔電壓50 V；正、負(fù)離子采集；監(jiān)測(cè)離子、碰撞池能量等參數(shù)見表2。

稱取飼料樣品 （5±0.1）g于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入 20mL 乙腈/水/乙酸 （V/V/V：70/29/1）提取溶劑，渦旋2min，振蕩30min，以4000 r/min離心10min使固液分離。準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移0.5mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL水稀釋，渦旋混勻1 min，然后以12 000 r/min離心10min，取上清液用0.22μm的PTFE濾膜過濾，吸取20μL預(yù)先渦旋混勻的穩(wěn)定同位素混合溶液于400μL內(nèi)插管中，再加入180μL的樣品濾液，混合后待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察 本研究選擇的樣品前處理提取溶劑為乙腈/水/乙酸（V/V/V：70/29/1），提取液經(jīng)直接提取稀釋，加入同位素內(nèi)標(biāo)后，上機(jī)檢測(cè)。選擇含有0.1%甲酸的1mmol/L NH4Ac的水相作為弱洗脫流動(dòng)相，甲醇為強(qiáng)洗脫流動(dòng)相，且采用梯度洗脫程序。質(zhì)譜采用正、負(fù)離子模式下獲得［M+H］+、［M+NH4］+吸收峰，采用分段多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）掃描模式，離子源溫度為500℃，駐留時(shí)間為100ms，得到精確保留時(shí)間和選擇離子精確質(zhì)量數(shù)、信號(hào)采集的特征離子對(duì)及質(zhì)譜條件見表2。

表2 16種真菌毒素的精確保留時(shí)間、質(zhì)量數(shù)及質(zhì)譜條件

按照上述優(yōu)化的條件，得到了16種毒素的高質(zhì)量離子信號(hào)、低干擾離子信號(hào)及理想的總離子色譜峰（圖 1）。

圖1 16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的總離子流色譜圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 基質(zhì)效應(yīng) 常見5大類配合飼料和4種原料的基質(zhì)效應(yīng)見圖2所示。以目標(biāo)物在空白基質(zhì)液中的峰面積與溶劑中峰面積的百分比來評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)結(jié)果接近100%時(shí)，表明無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，而高于100%說明有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，低于100%則說明有基質(zhì)抑制效應(yīng)。在5類配合飼料和4種原料基質(zhì)中，16種霉菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)較為相似。FB1、FB2、OTA和T2四種毒素呈現(xiàn)基質(zhì)增強(qiáng)效 應(yīng) ，DON、DON-3G、3-AcDON、15-AcDON、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、NIV 及 ZEN 等 10 種 毒素呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，HT-2和ST毒素的基質(zhì)效應(yīng)較弱。在5類配合飼料和4種原料中，各霉菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)分別為60.3%～122.3%和54.0%～124.3%，說明存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。

圖2 16種霉菌毒素在5種配合飼料及4種原料中的基質(zhì)效應(yīng)（n=3）

然而，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線是一種常見的減少基質(zhì)效應(yīng)的方法，但由于霉菌毒素污染的普遍性，空白基質(zhì)不易獲得，特別是完全匹配的基質(zhì)更難獲得，而代表性基質(zhì)的普適性面臨挑戰(zhàn)，具有較大的不確定性，導(dǎo)致基質(zhì)匹配定量在標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)中的應(yīng)用受到局限。因此，為了更好消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行定量，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

2.2.2 線性范圍、檢出限及定量下限 由表3可知，在各自的線性范圍內(nèi)，16種霉菌毒素線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.998。對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，以3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限（LOD），10倍信噪比計(jì)算定量下限（LOQ）。 16種霉菌毒素的LOQ均低于我國(guó)和歐盟規(guī)定的飼料及原料中的限量值，說明本方法可以滿足日常檢測(cè)的需要。

表3 16種霉菌毒素的線性范圍、檢出限及定量下限

2.2.3 準(zhǔn)確度與精密度 取16種霉菌毒素含量較低（低于方法檢出限）的5類常見的配合飼料和4種常見的飼料原料樣品。分別添加高、中、低3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，添加濃度、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表4和表5。其中，16種霉菌毒素在5種常見配合飼料中的回收率絕大數(shù)為70.2%～129.5%，只有極個(gè)別毒素的回收率為66.9%～69.9%。如犢牛飼料中AFG1、DON、DON-3G毒素的回收率偏低，F(xiàn)B1、FB2毒素的回收率偏高；但FB1、FB2毒素在魚、鴨飼料中的回收率偏低，這可能與這些飼料中含有菜籽粕、DDGS等原料有關(guān)，且與基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果保持一致。同時(shí)，16種霉菌毒素回收率的RSD值均在0.1%～14.5%。

16種霉菌毒素在豆粕、玉米、菜籽粕和魚粉4種常見的飼料原料中的回收率絕大部分為80.2% ～116.1%，只有FB1、FB2毒素在豆粕中的回收率為66.4%～70.9%，稍微偏低，這可能是豆粕中的蛋白質(zhì)含量較高，對(duì)部分毒素具有一定的吸附性而造成。同時(shí)，所有16種毒素回收率的RSD值均在0.1%～7.7%，兩大類基質(zhì)中的回收率和RSD均符合相關(guān)法規(guī)的檢測(cè)要求。

2.2.4 質(zhì)控樣品的考察 為了進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性和適用性，使用本方法FAPAS能力測(cè)試玉米樣品。結(jié)果如表6所示，證書標(biāo)示的8種真菌毒素的檢測(cè)值均在范圍內(nèi)，且接近標(biāo)示中值，表明本方法準(zhǔn)確可靠。相比于傳統(tǒng)的商品化MycoSpin 400多毒素凈化小柱和普通三重四極桿質(zhì)譜 （安捷倫6410B）的檢測(cè)方法，兩種方法的相對(duì)平均偏差均不大于7.1%，結(jié)果無顯著性差異。但Qtrap質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合穩(wěn)定同位素稀釋方法定量更加簡(jiǎn)單，且無需對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，對(duì)多目標(biāo)物的分析時(shí)可有效減少建立儀器方法的難度與時(shí)間，便于實(shí)驗(yàn)室快速建立準(zhǔn)確可靠的定量方法以開展批量樣品的日常檢測(cè)。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè) 按照上述優(yōu)化的各項(xiàng)條件，16種霉菌毒素的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上機(jī)分析，以穩(wěn)定同位素稀釋法進(jìn)行定量。結(jié)果表明，16種毒素標(biāo)準(zhǔn)品能夠有效分離，得到精確保留時(shí)間。同時(shí)，得到了所有的選擇離子精確質(zhì)量，質(zhì)量數(shù)與理論計(jì)算值非常接近。因此，16種毒素的HPLC/MS/MS方法條件優(yōu)化完成，可以滿足實(shí)際應(yīng)用于樣品的日常檢測(cè)。

采用本研究中建立的方法對(duì)某地區(qū)的134份豬飼料、禽飼料、牛飼料及各種原料樣品進(jìn)行檢測(cè)。 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 13078-2001，2001）規(guī)定了飼料及原料中最高限量的6種霉菌毒素：AFB1、ZEN和DON超標(biāo)率分別為4.5%、3.0%、2.2%，T-2、（FB1+FB2）及OTA 超標(biāo)率均為0.0%。對(duì)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定限量值的其他毒素，參考本方法中各毒素的檢出限，16種毒素的檢測(cè)數(shù)據(jù)見表7和表8。結(jié)果顯示，其他尚沒有限量值的霉菌毒素均有 不 同 程 度 的 檢 出 ，15-AcDON、AFG1、AFG2、DON-3G、AFB2、HT-2、ST 等毒素的檢出較高，均超過80%。說明了近年來由于氣候的異常，可能導(dǎo)致我國(guó)部分地區(qū)的飼料及原料中霉菌毒素污染較為普遍。因此，加強(qiáng)日常監(jiān)測(cè)尤為重要，而本方法可適用于大量飼料及原料樣品中多毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及快速準(zhǔn)確定量篩查。

3 結(jié)論

基于Q-trap-UPLC-MS/MS結(jié)合穩(wěn)定同位素稀釋技術(shù)，建立了飼料及原料中16種霉菌毒素的快速準(zhǔn)確檢測(cè)方法。樣品通過簡(jiǎn)單的提取、稀釋、離心和過膜等步驟即可上機(jī)檢測(cè)，無需凈化操作。采用加標(biāo)回收法和測(cè)定基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確度和精密度，方法可適用于國(guó)內(nèi)外的飼料及原料中霉菌毒素的限量檢測(cè)要求。本方法前處理快速，有效避免了基質(zhì)效應(yīng)的干擾及檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可滿足日常批量飼料及原料樣品中霉菌毒素快速定性和精確定量分析的要求。

表4 常見5種飼料中16種霉菌毒素的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

表5 常見4種飼料原料中16種真菌毒素的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

表6 FAPAS能力測(cè)試樣品的檢測(cè)結(jié)果

表7 134份飼料及原料樣品中16種霉菌毒素的檢測(cè)結(jié)果

表8 10份飼料樣品中霉菌毒素的含量

注：“N/F”：未檢出或低于方法檢出限。

化合物 樣品49 樣品52 15-ACDON N/F 1320.57 3-ACDON N/F 4878.66 AFB167.36 102.4樣品58 623.2 83.2 56.24樣品88 N/F N/F 332樣品97 N/F N/F 9.92樣品99 樣品100 樣品101 樣品102 樣品132 88.8 4.728 100 59.6 54.40 35.12 N/F 25.04 25.36 N/F 1.872 0.3336 N/F 2.824 16.48 AFB247.83 75.94 54.64 257.31 4.57 1.647 0.005 0.002 2.147 12.76 AFG12.04 2.544 0.6528 4.464 N/F N/F N/F N/F 0.065 0.1224 AFG236.56 40.08 3.456 N/F 1.72 N/F 1.24 N/F 1.688 1.184 DON 47.12 73.36 1632 145.6 146.4 620 384.8 485.6 583.2 450.4 DON-3G 5.084 242.4 136 110.4 246.4 558.4 112.8 152.8 208.8 125.6 FB1N/F N/F 4216 377.6 64.4 880 210.4 237.6 121.6 1912 FB2N/F 1.168 1380 76.16 27.6 389.6 150.4 57.12 28.88 428 HT-2 6.784 6.16 24.56 5.976 N/F 2.584 12.48 4.176 2.064 3.384 NIV 960.0 N/F N/F N/F 411.2 N/F 297.6 N/F 247.2 N/F OTA 41.76 2.976 14.08 5.248 2.792 2.56 2.76 2.408 2.568 3.400 ST 0.7088 0.4992 5.24 3.20 1.376 2.936 1.760 1.056 1.176 1.632 T2 N/F N/F 1.776 0.2168 0.596 1.976 7.552 3.560 1.264 1.448 ZEN N/F N/F 1360 236.8 N/F 288 108.8 N/F N/F 133.6