吳 凡,賈曉晨,趙小明,尹 恒

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,遼寧省碳水化合物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116023;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

農(nóng)藥的使用已成為防治植物病蟲害、去除雜草、調(diào)節(jié)農(nóng)作物生長(zhǎng)及提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的重要措施。然而，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，常常引發(fā)農(nóng)作物藥害并導(dǎo)致高超標(biāo)的農(nóng)藥殘留，直接危害人類健康和生存環(huán)境。因此，尋找有效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的農(nóng)藥降解方法對(duì)實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物高效、安全生產(chǎn)和發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要意義。

尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)是植物4相代謝解毒過程中第2階段的關(guān)鍵家族之一，能夠糖基化修飾多種官能團(tuán)，降低或去除外源物質(zhì)毒性，對(duì)多種外源毒物均有代謝能力，例如農(nóng)藥、微生物源的植物毒素、環(huán)境污染物等[1-2]。研究表明擬南芥中大約40%的UGT能夠參與異源物質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)，主要?dú)w屬于D、E、H和L類群，并且體外試驗(yàn)證明其中的13個(gè)UGT基因能夠同時(shí)對(duì)羥基、巰基、氨基表現(xiàn)出活性[3-4]，UGT基因的廣譜結(jié)合能力得到證明。UGT參與農(nóng)藥代謝的功能已有相關(guān)報(bào)道，例如：體外試驗(yàn)證明擬南芥的UGT72B1對(duì)2種污染物3,4-二氯苯胺(DCA)和2,4,5-三氯苯酚(TCP)具有高度的結(jié)合活性，敲除UGT72B1后對(duì)TCP和DCA的結(jié)合活性顯著下降[5]。進(jìn)一步研究證實(shí)UGT72B1具有O-糖基化和N-糖基化的雙功能催化活性[6]。擬南芥中的UGT72E1、UGT75B1、UGT75D1、UGT84A1、UGT84A2、UGT84B1經(jīng)體外試驗(yàn)證明均能代謝外源TCP[7]。并且，Edwards等[8]通過體外試驗(yàn)證明糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransferase，GT)的表達(dá)還會(huì)受到除草劑安全劑的誘導(dǎo)，在小麥、玉米和擬南芥中，使用多種除草劑安全劑后，GT對(duì)TCP和DCA的活性相對(duì)于對(duì)照組均增強(qiáng)了10倍。盡管植物來(lái)源的UGT基因的殺蟲劑代謝功能未見報(bào)道，但小菜蛾中的UGT2B17能夠提供對(duì)氯蟲苯甲酰胺的抗性，該基因被RNA沉默后，毒性作用顯著增強(qiáng)[9]。因此，UGT不僅參與農(nóng)藥代謝，并且具備廣譜的底物結(jié)合能力，但對(duì)具備廣譜農(nóng)藥代謝能力的UGT基因鮮有研究。

目前，關(guān)于UGT家族在農(nóng)藥代謝中的應(yīng)用研究依然較少，而且由于農(nóng)業(yè)環(huán)境的復(fù)雜性，往往會(huì)同時(shí)存在多種農(nóng)藥殘留，因此研究具備廣譜糖基化功能的UGT家族具有重要意義。此外，UGT作為自然界中最大的功能酶家族之一，其數(shù)量龐大，難以通過生物化學(xué)試驗(yàn)快速有效地鑒定出具有這種特性的UGT基因。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的各種高通量測(cè)序手段如Microarray和RNA-sequence，均能快速反映出試驗(yàn)對(duì)象對(duì)處理?xiàng)l件的響應(yīng)，提供了一個(gè)強(qiáng)有力的手段來(lái)分析預(yù)測(cè)基因的生物學(xué)功能。

因此，本研究利用NCBI中的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行擬南芥基因芯片的篩選，采用差異表達(dá)分析、聚類分析及共表達(dá)分析等多種生物信息學(xué)的分析手段對(duì)擬南芥中的UGT基因進(jìn)行研究，為探索植物中具備廣譜糖基化農(nóng)藥的UGT基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選并收集關(guān)于農(nóng)藥與除草劑安全劑的66個(gè)樣本數(shù)據(jù)，所有樣本都基于GPL198平臺(tái)。芯片信息經(jīng)處理后，其對(duì)比試驗(yàn)注釋如表1所示。

表1 對(duì)比試驗(yàn)注釋表Table 1 Annotation of comparative experiments

1.2 差異表達(dá)分析

編寫一份R語(yǔ)言腳本使用Bioconductor limma函數(shù)包中的Empirical Bayes方法進(jìn)行基因的差異表達(dá)計(jì)算，選擇以| log2(Fold change)(簡(jiǎn)稱logFC)|>=1，作為顯著差異閾值。

1.3 熱圖分析

本研究使用R語(yǔ)言中的pheatmap函數(shù)包制作熱圖。對(duì)UGT基因聚類距離的計(jì)算采用歐氏距離。

1.4 相關(guān)性

使用皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient，PCC)計(jì)算基因間的相關(guān)系數(shù)，設(shè)定顯著性閾值為0.8。為排除不同試驗(yàn)的背景差異，使用logFC向量計(jì)算基因間的相關(guān)系數(shù)。

1.5 GO分析

使用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)進(jìn)行在線GO分析，富集的顯著性閾值為P<0.01。

1.6 構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

編寫一份R語(yǔ)言腳本獲取UGT基因的相關(guān)基因，構(gòu)成共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)點(diǎn)(基因)集合。計(jì)算所有UGT基因的相關(guān)基因間的相關(guān)性，設(shè)置PCC閾值為0.8以產(chǎn)生基因關(guān)聯(lián)(邊)，使用Cytoscape[10]構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥UGT的表達(dá)譜分析

首先，依照注釋信息對(duì)擬南芥106條UGT基因的表達(dá)譜進(jìn)行分析，其結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，UGT家族受到農(nóng)藥誘導(dǎo)后發(fā)生強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)錄重編程(圖1-A)，暗示UGT家族在農(nóng)藥代謝中的重要作用。聚類結(jié)果顯示，UGT73C1、UGT73B4、UGT73B5、UGT73C6、UGT73B2、UGT76B1、UGT87A2和UGT74E2在多種農(nóng)藥處理中均高度上調(diào)，其平均上調(diào)倍數(shù)如表2所示，其中UGT74E2的轉(zhuǎn)錄上調(diào)高達(dá)26.25倍(表2)。Edwards等[8]對(duì)擬南芥UGT家族的底物選擇性研究發(fā)現(xiàn)，UGT73C1、UGT73B1、UGT73B2、UGT73B4和UGT73B5能夠糖基化含有羥基或巰基的一種或多種底物，佐證了本研究中候選基因的廣譜結(jié)合能力。在收集的芯片數(shù)據(jù)中，所采用農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)存在明顯差異，包含多種末端基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，暗示這8個(gè)UGT基因具有廣泛的底物選擇性，具有更重要的研究?jī)r(jià)值，是多農(nóng)藥代謝相關(guān)的關(guān)鍵候選UGT基因。

A.擬南芥106條UGT基因在8種農(nóng)藥處理前后的轉(zhuǎn)錄水平變化,方框內(nèi)標(biāo)記的為8個(gè)候選UGT基因 Transcriptional fold-change of 106 UGTs in 8 kinds of pesticides,respectively, UGTs in the box are candidates to metabolize multiple pesticides; B. 8個(gè)候選UGT基因在5種不同的安全劑處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄水平變化,每一個(gè)單元格內(nèi)的數(shù)字代表該基因的logFC值 Transcriptional fold-change of 8 key UGTs in 5 kinds of safener treatments,the number in each cell represents logFC value

圖1 擬南芥UGT的表達(dá)譜分析Fig.1 Analysis of UGT expression profiles in Arabidopsis thaliana

除草劑安全劑可增強(qiáng)作物對(duì)除草劑的代謝能力，是目前最受關(guān)注和普遍認(rèn)同的一種機(jī)制，并且一般認(rèn)為僅改變除草劑的代謝速率，而不改變其代謝途徑，其中受到誘導(dǎo)的基因也包括糖基轉(zhuǎn)移酶[11-12]。因此，筆者收集了NCBI中有關(guān)除草劑安全劑的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)譜分析，其結(jié)果如圖1-B所示。候選UGT基因在不同的除草劑安全劑中，轉(zhuǎn)錄水平均受到強(qiáng)烈的誘導(dǎo)上調(diào)，這進(jìn)一步證明了候選UGT基因參與了解毒過程。

2.2 候選UGT與植物解毒過程的相關(guān)性

共表達(dá)基因是指在多種外界條件下，這些基因的表達(dá)均表現(xiàn)出高度的相關(guān)性，具有更大的可能性參與相同的生物學(xué)途徑或生物學(xué)功能[13]。因此，通過UGT基因的共表達(dá)基因功能可以對(duì)UGT的功能進(jìn)行探索。通過計(jì)算候選UGT基因與全基因組基因的相關(guān)性，篩選得到772個(gè)高度相關(guān)的基因，對(duì)這個(gè)基因集合進(jìn)行GO富集分析。結(jié)果如圖2所示，在生物學(xué)過程分類中，共表達(dá)基因主要富集于谷胱甘肽代謝過程、毒性催化過程、響應(yīng)毒性底物、響應(yīng)鎘離子等；在細(xì)胞組分分類中，共表達(dá)基因主要存在于胞漿，蛋白酶體復(fù)合物，過氧化物酶體，液泡膜中；按分子功能分類，這些基因主要具有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性和反向轉(zhuǎn)運(yùn)體活性。植物解毒過程通常是經(jīng)過活化反應(yīng)(CYP450家族等)、結(jié)合反應(yīng)(UGT家族、GST家族等)和區(qū)室化反應(yīng)(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族)共同完成，最終異源毒物交聯(lián)物會(huì)在液泡中等待進(jìn)一步的代謝反應(yīng)。共表達(dá)基因富集的分子功能、生物學(xué)過程以及細(xì)胞定位均與植物的解毒過程高度重疊，表明候選UGT與其他解毒酶系構(gòu)成完整的4相代謝解毒過程，以完成對(duì)農(nóng)藥的解毒作用。

a.谷胱甘肽代謝過程 Glutathione metabolic process；b.毒素分解過程 Toxin catabolic process；c.響應(yīng)毒性底物 Response to toxic substance；d.響應(yīng)鎘離子 Response to cadmium ion；e.三羧酸循環(huán) Tricarboxylic acid cycle；f.氧化還原過程 Oxidation-reduction process；g.藥物跨膜運(yùn)輸 Drug transmembrane transport；h.細(xì)胞質(zhì) Cytosol；i.蛋白酶體復(fù)合物 Proteasome complex；j.過氧化物酶體 Peroxisome；k.液泡膜 Vacuolar membrane；l.谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性 Flutathione transferase activity；m.逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性 Antiporter activity

圖2擬南芥候選UGT共表達(dá)基因的GO富集分析
Fig.2GOenrichmentanalysisofco-expressiongenesof8keyUGT

2.3 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)揭示解毒過程的關(guān)鍵基因

為了進(jìn)一步探索UGT基因與其共表達(dá)基因之間的聯(lián)系，筆者將候選UGT基因及共表達(dá)基因的相關(guān)關(guān)系以網(wǎng)絡(luò)圖的形式呈現(xiàn)(圖3)。網(wǎng)絡(luò)圖中共包含780個(gè)結(jié)點(diǎn)(基因)，PCC大于0.8的結(jié)點(diǎn)間會(huì)形成一條邊。在網(wǎng)絡(luò)圖中，對(duì)植物4相代謝過程中重要的功能酶家族進(jìn)行標(biāo)記。網(wǎng)絡(luò)中包含的解毒第1階段代謝酶系主要有2OG加氧酶超家族、細(xì)胞色素P450超家族及alpha/beta水解酶超家族等；第2階段代謝相關(guān)酶系包括除候選基因以外的UGT超家族、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶超家族及SAM甲基轉(zhuǎn)移酶超家族等；第3階段相關(guān)酶系主要是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族。目前，4相代謝前3個(gè)階段中的關(guān)鍵酶系已經(jīng)得到大量的研究，但第4個(gè)階段涉及到異源物質(zhì)偶聯(lián)物在液泡或胞質(zhì)的進(jìn)一步代謝，還不具備代表酶系[14-15]，因此未予標(biāo)記。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)顯示，8個(gè)候選UGT基因之間是直接相連或間接相連，證明了這些UGT基因之間也具備高度的相關(guān)性。

橋接多個(gè)候選UGT的基因同樣具有重要作用，部分基因的解毒功能已經(jīng)明確。例如，GSTU24在網(wǎng)絡(luò)圖中與4個(gè)候選UGT基因相關(guān)，能夠催化TNT脫硝并且形成谷胱甘肽交聯(lián)物[16]。PMAT1基因在網(wǎng)絡(luò)中同時(shí)與5個(gè)候選UGT基因相關(guān)，編碼丙二酰轉(zhuǎn)移酶，盡管一般認(rèn)為丙二酰轉(zhuǎn)移酶系在植物解毒第2個(gè)階段發(fā)揮作用，但目前有研究表明煙草PMAT1能夠丙二?；喾N酚類糖苷，并且其表達(dá)水平與酚類糖苷的體外排出與液泡儲(chǔ)存直接相關(guān)[17]，暗示PMAT1參與了異源物質(zhì)的代謝解毒的第4階段。ABCC4與3個(gè)候選UGT相關(guān)，雖然沒有直接的證據(jù)表明擬南芥來(lái)源的ABCC4能夠參與農(nóng)藥代謝，但是斑馬魚來(lái)源的ABCC4基因有助于多種農(nóng)藥的排出[18-19]。這些橋接節(jié)點(diǎn)不但本身具備重要的解毒功能，并且還進(jìn)一步的暗示候選UGT基因參與植物的農(nóng)藥代謝過程。此外，在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，UGT73B4和UGT73B5的共表達(dá)基因集合中含有最豐富的植物解毒相關(guān)酶，暗示了這2個(gè)UGT基因的底物更為廣泛，是參與廣譜農(nóng)藥代謝的關(guān)鍵UGT基因。

圖3 由8個(gè)候選的UGT及其相關(guān)基因構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Co-expression network of 8 key UGTs and their co-expression genes

3 討 論

農(nóng)藥殘留問題直接威脅到人類健康與生存環(huán)境，尋找一個(gè)綠色環(huán)保的解決方案是目前研究的熱點(diǎn)。植物在對(duì)抗異源物質(zhì)的過程中，進(jìn)化出了一套復(fù)雜的解毒系統(tǒng)，能夠代謝大量的外源物質(zhì)，包括微生物源的植物毒素、異種化合物、污染物以及農(nóng)藥等[20]。如何利用植物自身的解毒功能完成農(nóng)殘降解或者開發(fā)新型安全劑等具有廣泛的應(yīng)用前景。同時(shí)，在植物的解毒過程中，最廣泛存在的異源物質(zhì)結(jié)合過程是利用UDP-葡萄糖作為供體形成結(jié)合物，該過程的代表是UGT家族。因此筆者以此為出發(fā)點(diǎn)，試圖找出具備廣譜農(nóng)藥代謝能力的UGT基因。

本研究收集公共基因芯片數(shù)據(jù)，通過表達(dá)譜分析在擬南芥的UGT家族中篩選出8個(gè)候選UGT基因，可能具備廣譜農(nóng)藥代謝能力。對(duì)這些候選UGT基因的共表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果表明這些基因參與的生物學(xué)途徑最富集于谷胱甘肽代謝過程、催化和響應(yīng)毒性物質(zhì)中，分子功能則主要具有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)活性。谷胱甘肽中半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán)，能夠在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的催化下與毒性物質(zhì)交聯(lián)，從而轉(zhuǎn)化成無(wú)毒物質(zhì)，在許多異源物質(zhì)的脫毒中起到至關(guān)重要的作用[6]。GST在農(nóng)作物針對(duì)除草劑代謝中有廣泛的報(bào)道，Milligan等[21]將玉米GST27導(dǎo)入小麥中，表現(xiàn)出對(duì)甲草胺、二甲酚草胺和撲草滅的抗性。水稻的GSTU3對(duì)酰胺類除草劑具有顯著的脫毒作用[22]。GO富集分析的結(jié)果顯示，候選UGT基因與GST等重要的解毒酶系共同參與解毒過程，暗示了這些UGT基因的農(nóng)藥解毒活性。進(jìn)而，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)不但顯示UGT73B4和UGT73B5是廣譜農(nóng)藥代謝的關(guān)鍵基因，還揭示了一批與植物解毒相關(guān)的重要基因。在網(wǎng)絡(luò)中，與多個(gè)候選UGT相關(guān)的基因通常也具備農(nóng)藥代謝能力，例如，有研究推測(cè)沿?zé)煵軵MAT1可能涉及到異源物質(zhì)的代謝調(diào)控[17]，共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)為PMAT1基因參與農(nóng)藥代謝提供了新的依據(jù)，其與5個(gè)關(guān)鍵的UGT基因存在高度相關(guān)性。

本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)的基因芯片數(shù)據(jù)，對(duì)擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶1家族進(jìn)行了農(nóng)藥代謝相關(guān)的整體生物信息學(xué)分析與驗(yàn)證，為解決農(nóng)業(yè)上的農(nóng)藥殘留問題提供了參考，為新的農(nóng)藥解毒劑或安全劑研發(fā)提供依據(jù)，為擬南芥UGT基因下一步的生理學(xué)和毒理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。