Eltayeb Mohamed Eltayeb Elhassan，牛 欣，蘇亞麗，陳守坤，李海峰

(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能會(huì)受到高溫、低溫、干旱、高鹽等不同環(huán)境脅迫。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，影響一系列生理生化反應(yīng)，在非生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。植物特有的轉(zhuǎn)錄因子DREB(Dehydration responsive element binding protein)保守的AP2結(jié)構(gòu)域與DRE/CRT順式作用元件特異性結(jié)合，誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)，提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性[2-6]。

DREB基因在高等植物中廣泛存在，目前已從擬南芥[6-7]、水稻[8]、小麥[9]、大麥[10]等物種中分離得到了DREB基因。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，DREB基因在植物抗逆過(guò)程中發(fā)揮重要功能。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)擬南芥DREB1/CBF基因，提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫、干旱和氧脅迫的耐受性[11]； 在擬南芥中過(guò)表達(dá)OsDREB1A，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高鹽和低溫脅迫的抵抗力增強(qiáng)[8]。過(guò)表達(dá)GmDREB1的轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)鹽脅迫表現(xiàn)出更高的耐受性，幼苗期根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和分蘗數(shù)與野生型相比更高[12]。

二穗短柄草具有生命周期較短，植株較小，易種植，基因組較小，自花授粉和轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)，成為新型的禾本科模式植物[13-15]。二穗短柄草有很多CBF家族基因[16-17]，但有關(guān)BdDREB的功能研究還很少。本研究以二穗短柄草Bd21為材料，克隆得到BdDREB1G基因，分析不同物種中的同源蛋白質(zhì)序列和進(jìn)化關(guān)系和基因的表達(dá)模式，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化得到了擬南芥，為該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)中所用植株為二穗短柄草Bd21。將二穗短柄草種子置于人工氣候箱中催芽萌發(fā)(26 ℃，16 h光照/8 h黑暗)。在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)1周后，移栽至營(yíng)養(yǎng)土中。4 ℃春化2周后，轉(zhuǎn)入西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候室(26 ℃，16 h光照/22 ℃，8 h黑暗)。

1.2 方 法

1.2.1 序列分析及引物設(shè)計(jì) 從Gramene網(wǎng)站[18]上BLASTP檢索同源蛋白，用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，用MEGA 6.0軟件NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2 表達(dá)模式分析 對(duì)2周大的幼苗進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% PEG6000(模擬干旱)、200 mmol/L的NaCl(模擬高鹽)、100 μmol/L的ABA、20 μmol/L的6-BA、1 mmol/L的SA和100 μmol/L的MeJA(模擬激素脅迫)、45 ℃、4 ℃處理2 h，分別采集取幼苗根或者葉片，同時(shí)采集抽穗期植株的根、莖、葉片和花，提取總RNA。RNA提取參考Trizol(TAKARA)說(shuō)明書(shū)。使用羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。qRT-PCR使用SYBR Premix ExTaq(TAKARA)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作。反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件及數(shù)據(jù)分析參考竇艷華等[19]研究。

1.2.3 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建 KOD高保真酶(TOYOBO)進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。用NcoⅠ和PmacⅠ將pCAMBIA1301過(guò)表達(dá)載體雙酶切，將線(xiàn)性化載體與目的片段用重組酶(Vazyme)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli中。具體參考一步克隆法說(shuō)明書(shū)。通過(guò)菌落PCR及雙酶切進(jìn)行鑒定，并經(jīng)測(cè)序(上海生工)確認(rèn)后，選擇陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆。

1.2.4 擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選、鑒定和表型觀(guān)察 用蘸花法侵染擬南芥，收獲種子后曬干。用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇及質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%次氯酸鈉對(duì)種子進(jìn)行消毒后4 ℃處理3 d，播種于含40 mg/L潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基上。黑暗培養(yǎng)3 d后，在光照16 h/黑暗8 h條件下培養(yǎng)2周。待幼苗長(zhǎng)至4～6 葉期時(shí)移至土壤中，繼續(xù)光照16 h/黑暗8 h培養(yǎng)，觀(guān)察表型。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

NCBI上BLASTP結(jié)果顯示，BdDREB1G含有一個(gè)保守DREB結(jié)構(gòu)域，屬于DREB轉(zhuǎn)錄因子家族(圖1)。與黑麥CbfI-1(SecalecerealecultivarLo7 CbfI-1，KY780081.1)、小麥CBFI(TriticumaestivumAP2 domain CBF protein，CBFI，JN987191.1)、大麥CBF1(Hordeumvulgaresubsp.SpontaneumCBF1，JF796655.1)和粗山羊草DREB1G(Aegilopstauschiisubsp.TauschiiDREB1G，XM_020337958.1)的一致性分別為81%、81%、79%和79%。編碼區(qū)不存在內(nèi)含子，序列長(zhǎng)度684 pb，編碼227個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為24.18 ku，等電點(diǎn)為5.87，負(fù)電荷殘基總數(shù)28，正電荷殘基總數(shù)24，親水性平均系數(shù)為-0.486，提示該蛋白質(zhì)可能為親水性蛋白質(zhì)。

圖1 BdDREB1G保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 Conserved domain of BdDREB1G

將BdDREB1G的CDS序列在NCBI中進(jìn)行BLASTN比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與小麥、燕麥、黑麥、大麥等禾本科植物中的DREB轉(zhuǎn)錄因子序列具有較高的同源性。將擬南芥(AtCBF1，NP_567721.1；AtCBF2，ABV27118.1；AtCBF3，ABV27138.1；AtCBF4，NP_200012.1)、水稻(OryzasativaJaponica DREB1G，XP_015624757.1)、二穗短柄草(CBF1，AFD96407.1；CBF2，AFD96408.1；CBF3，AFD96409.1；CBF4，AFD96410.1；CBF5，AFD96411.1；CBF6，AFD96412.1)、粗山羊草DREB1G、玉米(ZeamaysDREB1A，NM_001157386.2)、小麥CBFI、一粒小麥(TriticummonococcumCBF15，EU076383.1)、大麥CBF1、燕麥(AvenasativaCBF1，AM071406.1；CBF2，AM071407.1)、黑麥CbfI-1、高粱(SorghumbicolorDREB1G，XM_002454439.2)、慈竹(NeosinocalamusaffinisDREB1，JN896707.1)、谷子(SetariaitalicDREB1G，XM_004953380.4)中的DREB同源蛋白質(zhì)序列與BdDREB1G進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，圖2結(jié)果顯示，BdDREB1G與AetDREB1G，TaCBF1，HvCBF1和ScCbfI-1在同一個(gè)分支上，它們都屬于早熟禾亞科且具有較近的親緣關(guān)系的結(jié)論一致；與擬南芥的CBF1、CBF2、CBF3和CBF4聚類(lèi)于A-1亞組中，提示BdDREB1G可能具有A-1亞組蛋白質(zhì)功能。

DREB蛋白質(zhì)多重序列比對(duì)結(jié)果顯示(圖3)，在BdDREB1G含有N-末端一段保守的AP2結(jié)構(gòu)域，2個(gè)CBF特征基序(PKKR/PAGR和DSAWR基序)和一個(gè)C-末端的酸性結(jié)構(gòu)域，且在PKKR/PAGR基序的第7位精氨酸(R)和第10位的苯丙氨酸(F)，及AP2結(jié)構(gòu)域的第14位纈氨酸(V)和谷氨酸(E)高度保守。

圖2 DREB蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenic tree of DREB proteins

2.2 非生物脅迫處理及不同組織中的表達(dá)模式分析

由圖4可知，根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果，BdDREB1G在抽穗期的二穗短柄草不同組織中表達(dá)不同，其中莖中表達(dá)量最高，其次是葉片和根，在花序中表達(dá)量最低。不同非生物脅迫處理后其表達(dá)水平也有差異。其中，水楊酸處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)其表達(dá)，高溫和低溫處理后表達(dá)量也顯著上升。干旱脅迫、ABA、6-BA及MeJA處理則對(duì)該基因的表達(dá)無(wú)顯著影響。提示BdDREB1G可能參與溫度脅迫應(yīng)答及SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與擬南芥中的同源蛋白質(zhì)CBFs可能具有相似的功能。

2.3 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

為了初步研究BdDREB1G基因的功能，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體。首先運(yùn)用RT-PCR擴(kuò)增到了目的片段(圖5-A)，電泳圖中目的條帶大小與預(yù)期一致；切膠回收后與過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301進(jìn)行重組反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。菌落PCR結(jié)果表明得到了陽(yáng)性克隆(圖5-B)。選取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行NcoⅠ 單酶切驗(yàn)證，電泳結(jié)果顯示，除質(zhì)粒帶以外，在250 bp與500 bp之間出現(xiàn)一條帶，與基因內(nèi)366 bp處含有一個(gè)NcoⅠ 的酶切位點(diǎn)一致(圖5-C)，表明已經(jīng)成功構(gòu)建了BdDREB1G的過(guò)表達(dá)載體。

圖4 BdDREB1G在不同非生物脅迫下及不同部位中表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of BdDREB1G under different abiotic stresses and in different tissues

A.RT-PCR擴(kuò)增BdDREB1GAmplification ofBdDREB1Gvia RT-PCR； B.菌落PCR結(jié)果 Results of Colony PCR；1～6.6個(gè)單克隆 Different clones；7.陽(yáng)性對(duì)照 Positive control；8.陰性對(duì)照 Negative control；C.單酶切驗(yàn)證NcoⅠ single restriction digestion of recombined plasmid;M.marker 2000

圖5表達(dá)載體構(gòu)建
Fig.5Constructionofoverexpressionvectors

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定和表型觀(guān)察

提取擬南芥葉片總DNA，經(jīng)過(guò)PCR鑒定，可以檢測(cè)到特異條帶，確定為過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株(圖6)。經(jīng)過(guò)篩選鑒定，共獲得11株轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。經(jīng)表型分析，其中OE-BdDREB1G-4和OE-BdDREB1G-72個(gè)株系的表型最強(qiáng)，與野生型植株相比，均表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩、植株矮小和晚花的表型(圖7)。轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性能有待于進(jìn)一步分析。

M.DNA marker 2000;1,4,7.代表3個(gè)不同編號(hào)株系的DNA驗(yàn)證結(jié)果 The results of DNA verification of three differenet strains;PC.陽(yáng)性對(duì)照 Positive control;NC.陰性對(duì)照 Negative control

圖6轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定
Fig.6PCRidentificationoftransgenicArabidopsis

3 討 論

AP2/DREB家族成員都含有一段長(zhǎng)約60個(gè)氨基酸的保守AP2結(jié)構(gòu)域，可以與DNA結(jié)合，尤其是第14位的纈氨酸(V14)和第19位的谷氨酸(E19)可能影響CBF/DREB對(duì)CRT元件的結(jié)合活性。而CBF1轉(zhuǎn)錄因子的N-末端AP2結(jié)構(gòu)域的上游都含有一段堿性氨基酸序列PKKR/PAGRXKFXETRH模體，具有核定位功能，可能與蛋白質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)[20-21]；C-末端含有一段酸性活化區(qū)域DSWAR模體[22]。本研究分析了二穗短柄草DREB1G的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)含有一段63個(gè)氨基酸組成的高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域，N-末端有核定位信號(hào)肽PKRRAGRTKFKETRHP，C-末端含DSPR，而在這些結(jié)構(gòu)域外的氨基酸序列沒(méi)有顯著同源性，這與前人研究一致[23-24]。不同位置氨基酸序列的保守性及多樣性可能與其功能相關(guān)。

進(jìn)化分析顯示，BdDREB1G與粗山羊草、小麥、大麥和黑麥中的CBF/DREB蛋白質(zhì)處于同一分支上，提示這些蛋白質(zhì)可能具有相同的祖先來(lái)源，與這幾種植物都屬于早熟禾亞科且具有較近的親緣關(guān)系的結(jié)論相符。BdDREB1G與擬南芥CBF1/2/3/4在同一分支上，提示可能與之具有相似的功能。

擬南芥CBF1/2/3基因受到低溫誘導(dǎo)表達(dá)[6]，CBF4基因受到干旱誘導(dǎo)表達(dá)[7]。與此相似，在本研究中，BdDREB1G受到干旱誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著下降，在高溫、低溫脅迫后表達(dá)量顯著上升，提示BdDREB1G可能在植物響應(yīng)干旱、低溫和高溫過(guò)程中起重要作用。

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型Fig.7 Phenotypes of transgenic Arabidopsis lines

CBF/DREB是非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程中一類(lèi)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控下游基因的表達(dá)改變植株的抗逆性，為通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗逆性提供更多選擇[25]。過(guò)量表達(dá)DREB1/CBF基因的植株在改變抗逆性的同時(shí)，植株的生長(zhǎng)也可能受到抑制。過(guò)表達(dá)AtDREB1A和OsDREB1A的轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗低溫和抗旱性增強(qiáng)，但在正常生長(zhǎng)條件下，生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻[8,26]。將OsDREB2A在擬南芥中過(guò)量表達(dá)，植株生長(zhǎng)受到抑制，顯著矮化[26]。與此相似，在本研究中，過(guò)量表達(dá)BdDREB1G的轉(zhuǎn)基因擬南芥也表現(xiàn)出嚴(yán)重矮化、生長(zhǎng)遲緩、晚花的表型。可能是因?yàn)镈REB1B/CBF通過(guò)影響GA代謝失活，鈍化酶降低了GA的活性，從而使轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)遲緩[27-28]。而在過(guò)表達(dá)一個(gè)受DREB1A調(diào)控基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，多個(gè)參與光合作用和碳水化合物代謝的基因的表達(dá)受到抑制，這也可能引起轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)抑制[29]。

4 結(jié) 論

本研究克隆了二穗短柄草中的DREB1G基因，編碼一個(gè)含227個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，含有一個(gè)典型的AP2保守結(jié)構(gòu)域，屬于CBF轉(zhuǎn)錄因子亞家族。BdDREB1G基因受到高溫、低溫或SA脅迫后表達(dá)量與對(duì)照相比顯著上調(diào)。將其在擬南芥過(guò)量表達(dá)，通過(guò)潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因植株明顯表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩、植株矮小且晚花，提示BdDREB1G可能參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和開(kāi)花的調(diào)控。