尹明華，廖 玉，萬志庭

(上饒師范學院 生命科學學院，江西上饒 334001)

表觀遺傳學(Epigenetics)是指在DNA序列沒有發(fā)生變異的情況下基因表達的可遺傳改變，且可隨細胞有絲分裂和(或)減數(shù)分裂遺傳給后代[1]。DNA 甲基化是一種表觀遺傳現(xiàn)象，即在 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以 S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到 DNA分子中特定堿基上的過程，主要形成5-甲基胞嘧啶[2]。DNA甲基化通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA 構(gòu)象、DNA 穩(wěn)定性及DNA 與蛋白質(zhì)相互作用方式，關(guān)閉某些基因的活性從而控制基因表達[3]。DNA甲基化參與植物的生長發(fā)育和組織分化[4]。DNA甲基化作為細胞記憶的一種機制，是表觀遺傳學研究的“主角”[5]。

紅芽芋(ClocasiaescalentaSchott)，單子葉植物，屬天南星科，為多年生宿根性草本植物。江西鉛山素有種植紅芽芋的傳統(tǒng)，種植歷史悠久，藥食兼優(yōu)。食用，肉質(zhì)松，品質(zhì)鮮美、細膩，粉而不粘，口感好；藥用，增強人體的免疫功能，潤腸通便，防止便秘[6]。長期以來，紅芽芋多采用無性繁殖方法，不僅繁殖系數(shù)低，而且易積累病毒，如芋花葉病毒、黃瓜花葉病毒和芋羽狀斑駁病毒等，導致種性退化，品質(zhì)變差，產(chǎn)量下降[7]。超低溫療法(Cryotherapy)是近年發(fā)展起來的基于超低溫保存(Cryopreservation)的一種新型高效的脫毒技術(shù)，相比傳統(tǒng)脫毒法具有脫毒率高和脫毒率不依賴莖尖大小等兩個顯著優(yōu)點[8]?，F(xiàn)有研究表明，超低溫保存實質(zhì)是一種逆境脅迫的過程，在這個過程中，存在多種滲透脅迫，如PEG、甘露醇等，均能引發(fā)基因組 DNA 特異區(qū)段的甲基化[9]。但病毒是一種生物脅迫，用超低溫保存的技術(shù)脫除病毒實際上是一種解除生物脅迫的過程。

有研究[10]表明，植物感染病毒導致的甲基化整體水平上升有利于病毒攻擊時植物基因組的穩(wěn)定。但超低溫療法脫毒后，再生脫毒苗的基因組DNA甲基化有何變化，尚無相關(guān)報道。檢測DNA甲基化的方法主要有色譜法、酶切法、測序法、甲基化PCR檢測法、芯片法等多種方法，MSAP(Methylation sensitive amplification polymorphism，甲基化敏感擴增多態(tài)性)技術(shù)是一種以甲基化修飾敏感性不同限制性內(nèi)切酶和PCR為基礎(chǔ)的新技術(shù)，靈敏度高，不受被測DNA序列信息限制，檢測位點多，成本低，操作簡單，重復性高，已成為檢測植物基因組DNA甲基化水平和模式的重要方法[11]。本試驗以紅芽芋超低溫療法脫毒苗為研究對象，使用MSAP方法并結(jié)合毛細管自動電泳儀對其基因組DNA甲基化水平和甲基化模式進行分析，為超低溫療法脫毒的表觀遺傳研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

江西鉛山紅芽芋帶毒苗(對照組，編號為1～10)；江西鉛山紅芽芋超低溫療法脫毒苗(處理組，編號為11～30)。以上30份材料均由上饒師范學院生命科學學院植物組織培養(yǎng)室提供。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 采取改良的CTAB法進行DNA提取，每個樣本采取0.5 g葉片進行DNA提取。

采取改良的CTAB法進行DNA提取，每個樣本采取0.5 g葉片進行DNA提取。步驟如下：

①在65 ℃水浴鍋中預熱CTAB提取液。

②在液氮中迅速研磨樣品，將粉末狀材料轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入預熱的CTAB提取液(每克樣品加入3～5 mL的提取液)，65 ℃保溫30～60 min，每隔10 min輕輕顛倒混勻。

③11 000 r/min，離心5 min，取上清轉(zhuǎn)入新的離心管中。

④加入等體積酚/氯仿，充分混勻，11 000 r/min，離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管。

⑤加入等體積氯仿，充分混勻，11 000 r/min，離心10 min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管。

⑥重復步驟④和⑤。

⑦加入2/3體積的異丙醇混勻，室溫放置，沉淀15 min。

⑧11 000 r/min，離心6 min，棄上清。

⑨將沉淀用φ=70%的乙醇漂洗1次，室溫條件下11 000 r/min離心2 min，棄上清，重復洗1次。

⑩往沉淀中加入50 μL 1×TE溶液，先混勻，再靜置30 min，中間過程顛倒混勻1～2次。

?提取產(chǎn)物取2～3 μL，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余置于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 酶切 用識別四堿基的HpaⅡ和MspⅠ同裂酶(NEB) 分別與識別六堿基的核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ(NEB) 組合對樣本DNA進行雙酶切，DNA 酶切反應體系為20 μL。第1個反應中，400 ng 樣本DNA，2 μL 10×Buffer 4(NEB)[50 mmol/L KAc、20 mmol/L Tris-acetate、10 mmol/L MgAc2、1 mmol/L dTT(pH 7.9，25 ℃)]，EcoRⅠ和HpaⅡ內(nèi)切酶各0.8 μL，37 ℃保溫過夜。第2個反應中，400 ng 樣本DNA，2 μL 10×Buffer1(NEB) [10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L dTT(pH 7.0，25 ℃)]，EcoRⅠ和MspⅠ內(nèi)切酶各0.8 μL，37 ℃保溫過夜。

1.2.3 連 接 在酶切片段的兩端加上人工設(shè)計的與EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ酶切位點互補的人工接頭(表1)。接頭連接體系為20 μL：2 μL 10×T4Buffer、0.4 μL 20 μmol/LEcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ接頭，其余用ddH2O補齊，16 ℃過夜。

1.2.4 預擴增 預擴增反應體系為20 μL，其中含有0.4 μL 10 mmol/L dNTPs、2 μL 10×Buffer、0.2 μL 5 U/ μLTaq酶、0.5 μL 10 μmmol/L E00-primer、0.5 μL 10 μmmol/L M00-primer，其余用ddH2O補齊。反應條件為：94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，26 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。預擴增產(chǎn)物稀釋20倍，供選擇擴增用。

1.2.5 選擇性擴增 選擇擴增體系同預擴增體系。條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，65 ℃至56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13個循環(huán)，退火溫度每個循環(huán)降0.7 ℃進行降式PCR擴增；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，23 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.6 毛細管電泳 將甲酰胺與分子質(zhì)量內(nèi)標按100∶1的體積比混勻后，取9 μL加入上樣板中，再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物。然后使用3730XL測序儀進行毛細管電泳。電泳結(jié)束后，利用GeneMarker 2.2 軟件對得到的原始數(shù)據(jù)進行分析，將各泳道內(nèi)分子量內(nèi)標的位置與各樣品峰值的位置做比較分析，得到片段大小。再根據(jù)無帶和有帶情況轉(zhuǎn)化為0/1數(shù)據(jù)矩陣。最后進行甲基化率和甲基化模式比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，所提取樣本基因組 DNA主帶清晰，無降解現(xiàn)象(圖1)。再用紫外分光光度計測定，OD260/OD280比值為1.7～1.9，DNA的純度較高，極少含有蛋白質(zhì)，完全能滿足試驗對DNA的要求。

2.2 預擴增結(jié)果

預擴增產(chǎn)物通過20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，預擴產(chǎn)物均勻彌散，且連續(xù)成片； 彌散帶只在100～1 000 bp低分子質(zhì)量區(qū)域出現(xiàn)，而在高分子質(zhì)量區(qū)域沒有出現(xiàn)，表明DNA消化完全，符合MSAP選擴模板的要求。

表1 試驗所用接頭和引物序列信息Table 1 Sequence information on adaptors and primers in this test

2.3 基因組DNA甲基化水平分析

依據(jù)HpaⅡ和MspⅠ對甲基化敏感程度不同，MSAP片段可分為4種類型：第Ⅰ類型EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ中均有條帶，甲基化的位點無改變；第Ⅱ類型EcoRⅠ/HpaⅡ有條帶而EcoRⅠ/MspⅠ中無條帶(僅有1條鏈甲基化的半甲基化位點)；第Ⅲ類型EcoRⅠ/HpaⅡ無條帶(兩條鏈均甲基化)而EcoRⅠ/MspⅠ中有條帶；第Ⅳ類型EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ中均無條帶[12]。本試驗采用10對選擇性擴增引物組合(E32MSP40、E32MSP48、E35MSP48、E36MSP43、E37MSP48、E39MSP44、E40MSP44、E50MSP43、E78MSP40、E86MSP48)對雙酶切后的30個樣本進行擴增(圖2)。紅芽芋超低溫療法脫毒苗基因組DNA甲基化水平分析見表2。從表2可知，對照組總擴增帶數(shù)522條，甲基化總帶數(shù)297條，總甲基化率57.06%，全甲基化帶數(shù)194條，全甲基化率37.22%，半甲基化帶數(shù)103條，半甲基化率19.84%；處理組總擴增帶數(shù)504條，甲基化總帶數(shù)339條，總甲基化率67.33%，全甲基化帶數(shù)253條，全甲基化率50.2%，半甲基化帶數(shù)86條，半甲基化率17.13%。表明超低溫療法脫毒后，總甲基化率提高10.27%，全甲基化率提高12.98%，但半甲基化率下降2.71%。

編號1～30和M分別表示樣本1～30和Marker No. 1-30 and M represent samples 1-30 and marker,respectively

2.4 基因組DNA甲基化模式分析

紅芽芋經(jīng)過超低溫療法脫毒后，其基因組DNA甲基化模式有3種：第1種模式為甲基化條帶數(shù)無變化，可分為A1(非甲基化→非甲基化)、A2(半甲基化→半甲基化)、A3(全甲基化→全甲基化)3種類型，其比例為29.94%。第2種模式為去甲基化模式，可分為B1(半甲基化→非甲基化)、B2(全甲基化→非甲基化)、B3(超甲基化→非甲基化)、B4(超甲基化→半甲基化)、B5(超甲基化→全甲基化)5種類型，其比例為48.53%，表明紅芽芋經(jīng)過超低溫療法脫毒后在去甲基化模式中主要由甲基化位點變?yōu)榉羌谆稽c。第3種模式為甲基化模式，可分為C1(非甲基化→半甲基化)、C2(非甲基化→全甲基化)、C3(非甲基化→超甲基化)、C4(半甲基化→超甲基化)、C5(全甲基化→超甲基化)，其比例為18.20%。表明紅芽芋經(jīng)過超低溫療法脫毒后在甲基化模式中主要由非甲基化位點變?yōu)榧谆稽c。在第2種去甲基化模式中由甲基化位點變?yōu)榉羌谆稽c的比例為48.53%，在第3種甲基化模式中由非甲基化位點變?yōu)榧谆稽c的比例為18.20%(表3)。可見，在紅芽芋經(jīng)過超低溫療法脫毒后，甲基化和去甲基化并存，但主要是以去甲基化為主，說明超低溫療法脫毒后較多的基因表達被激活。

每個引物擴增圖左為HpaⅡ，右為MspⅠ Left of amplification of each primer wasHpaⅡ,and the right wasMspⅠ

圖2E32MSP40、E32MSP48、E35MSP48和E36MSP43引物組合對樣本1的MSAP擴增產(chǎn)物檢測
Fig.2MSAPamplificationproducttestofsample1basedonE32MSP40,E32MSP48,E35MSP48andE36MSP43

3 討 論

病毒侵染植物是一種生物脅迫[13]。目前有關(guān)生物脅迫對植物的表觀遺傳影響的研究已有報道。一般集中于煙草花葉病毒等[14]。對感染煙草花葉病毒植物的后代進一步分析顯示，它們的基因組已大幅度超甲基化[10]。后代的全基因組超甲基化被認為是抵抗脅迫的一般保護機制的一部分，而重組事件的增加和由病毒攻擊導致的特異性甲基化模式可能是植物適應性反應的跡象[14]。而這種適應性反應的跡象將使植物的基因表達得到抑制，病毒的長期積累將使植物的某些基因甲基化從而無法表達，最終導致植物的種性退化、產(chǎn)量和品質(zhì)下降。

研究表明，超低溫處理對植物材料的甲基化有一定程度的影響。朱文濤等[15]的研究表明，超低溫保存玻璃化法保存成活的五葉草莓甲基化水平降低6.73%，這與木瓜[16]、 蛇麻草[17]、擬南芥[18]等植物超低溫保存后的甲基化變化趨勢相類似。而超低溫療法脫毒是以超低溫保存的技術(shù)來快速有效脫除植物病毒，實質(zhì)上是解除病毒這種生物脅迫的過程。從理論上講，超低溫療法脫毒是解除病毒的生物脅迫，將會使植物的某些基因去甲基化，從而在一定程度上恢復植物的種性，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。

表2 紅芽芋超低溫療法脫毒苗基因組DNA甲基化水平分析Table 2 Analysis of genomic DNA methylation level in virus-free plantlets by cryotherapy of red bud taro

注：總甲基化率=[(Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%；全甲基化率=[(Ⅲ+Ⅳ)]/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%；半甲基化率=[Ⅱ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%。

Note:Total methylation rate=[(Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%;full-methylation rate=[(Ⅲ+Ⅳ)]/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%; hemi-methylation rate=[Ⅱ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%.

表3 紅芽芋超低溫療法脫毒苗基因組DNA甲基化模式分析Table 3 Analysis of genomic DNA methylation patterns in virus-free plantlets by cryotherapy of red bud taro

但超低溫療法脫毒不同于莖尖常規(guī)培養(yǎng)脫毒，在超低溫療法脫毒過程中牽涉到超低溫脅迫和滲透脅迫等非生物脅迫的因素，在解除病毒生物脅迫的同時，也遭受到超低溫脅迫和滲透脅迫等非生物脅迫。但目前的研究偏重于對超低溫保存后再生植株的甲基化研究，沒有考慮到脫毒方面的效應，如王芳等[19]對馬鈴薯莖尖玻璃化法超低溫保存后的 DNA 甲基化遺傳變異進行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超低溫保存后去甲基化和甲基化都有發(fā)生，但以去甲基化變化為主。何艷霞等[20]在對擬南芥幼苗的超低溫保存研究中，也發(fā)現(xiàn)有去甲基化現(xiàn)象。這些研究表明，超低溫保存后植物材料存在去甲基化和甲基化，但去甲基化變化是主要趨勢。在本試驗中，以超低溫療法脫毒的紅芽芋為研究對象，考察超低溫保存和脫毒對紅芽芋甲基化水平和甲基化模式的影響，發(fā)現(xiàn)超低溫療法脫毒苗總甲基化率提高10.27%，全甲基化率提高12.98%，但半甲基化率下降2.71%。紅芽芋超低溫療法脫毒苗去甲基化模式和甲基化模式并存，但去甲基化模式高于甲基化模式，說明超低溫療法脫毒后有較多的基因表達被激活。究其原因，可能是脫毒和超低溫保存兩者平衡的結(jié)果，一是解除病毒生物脅迫，二是給予超低溫脅迫和滲透脅迫等非生物脅迫，最終去甲基化模式高于甲基化模式可能也是植物適應性反應的跡象，導致更多的基因得到表達，低溫療法脫毒可恢復種性的機理可以從甲基化水平和甲基化模式去解釋。這種變化趨勢可能是植物對超低溫保存這種逆境處理和病毒脅迫解除的一種綜合適應，其內(nèi)在機制目前未明，需要深入探討。另外，超低溫療法脫毒中的甲基化能否引起基因的差異表達，也需要更深入地探討。本研究結(jié)果可為紅芽芋脫毒苗的種質(zhì)保存和規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。