史玉卿

肺癌是臨床常見惡性腫瘤，其發(fā)病率上升與我國大氣污染、致癌物增多、煙民增多、人口老齡化等有關(guān)，目前是我國人民死亡的主要疾病之一。非小細(xì)胞肺癌是組織學(xué)分類下的肺癌類型，占所有肺癌的80%，是臨床常見類型[1]。非小細(xì)胞肺癌惡性程度高，早期廣泛遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，新確診的患者中超過70%已近達(dá)到中晚期，導(dǎo)致患者失去手術(shù)機會，死亡率高，即使得到一定有效治療后5年生存率仍然極低；目前在我國惡性腫瘤致死率中占首位[2]。目前主要治療方法包括手術(shù)和放化療，臨床常常采用綜合多種方法進(jìn)行治療。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤血管在腫瘤產(chǎn)生、增殖、轉(zhuǎn)移等方面具有促進(jìn)作用，因此抑制腫瘤血管是抗腫瘤重要途徑。本研究分析了Endostatin、VEGF與非小細(xì)胞肺癌微血管密度、分期、腫瘤直徑等的關(guān)系，現(xiàn)在將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

于2015年3月至2017年8月廊坊市人民醫(yī)院符合研究標(biāo)準(zhǔn)的189例非小細(xì)胞肺癌患者納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：穿刺活檢、組織學(xué)病理或(和)細(xì)胞學(xué)確認(rèn)的非小細(xì)胞肺癌患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：參與本研究前有抗腫瘤治療史；有肝、腦、腎、心等重要臟器嚴(yán)重原發(fā)病變[4]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批同意。共納入189例?；颊哔Y料：男性110例，女性79例；病理類型：腺鱗癌14例，腺癌85例，鱗癌90例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期150例。

1.2 方法

VEGF檢測方法：免疫組化染色單抗VEGF、SP免疫試劑盒。免疫組化染色非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)中取得標(biāo)本蠟塊的癌旁正常組織和腫瘤組織。根據(jù)試劑盒嚴(yán)格操作，DAB顯色用蘇木精復(fù)染。使用EDTA水煮法進(jìn)行抗原修復(fù)。炎性對照采用已知為陽性的標(biāo)本，陰性對照組用PBS代替一抗。細(xì)胞胞質(zhì)未染色為陰性，若呈棕褐色或棕黃色則為陽性。陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果根據(jù)Senger法進(jìn)行判斷，陽性細(xì)胞評分：陽性細(xì)胞>50%為3分，陽性細(xì)胞占26%～50%為2分，陽性細(xì)胞占25%為1分，無陽性細(xì)胞則為0分；染色強度：強陽性為3分，中等強度陽性記為2分，弱陽性為1分，陰性為0分。總積分=染色強度分值×陽性細(xì)胞分值，總分為3～6分可判斷為陽性，0～2分則為陰性。

Endostatin檢測：使用兔抗人Endostatin多克隆體一抗，過氧化酶一鏈親和素復(fù)合物，生物素化羊抗兔抗體。LSAB法，將術(shù)中獲取標(biāo)本石蠟切片常規(guī)脫蠟，使用過氧化氫(3%)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，將羊血清肺部非特異性抗原(3%)加入后加入一抗(1∶50)、二抗(1∶200)、SP復(fù)合物；滴入一抗后在37°溫箱中孵育1h，PBS沖洗，再孵育30 min，再沖洗，行DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片。用健康人體扁桃體組織切片做陽性對照。陽性判斷[5]：若其在漿細(xì)胞、支氣管管壁腺體細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞上均有黃色顆粒則為陽性；用400倍光鏡5～10野的切片，每視野記100～200個支氣管黏膜上皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，共記錄1 000個，計算陽性細(xì)胞百分比，結(jié)果為切片Endostatin陽性水平。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計VEGF陽性率和Endostatin陽性率，對比不同年齡、性別、發(fā)病部位、腫瘤直徑、病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、微血管密度時VEGF陽性率和Endostatin陽性率。將有意義因素進(jìn)行多因素分析，找出與VEGF表達(dá)和Endostatin表達(dá)有關(guān)的因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 單因素分析

Endostatin及VEGF陽性表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系，見表1。

2.2 COX回歸模型分析

Endostatin陽性與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MVD呈負(fù)相關(guān)；VEGF陽性與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、MVD呈正相關(guān)，P均<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

3 討論

VEGF與腫瘤血管生成的關(guān)系及VEGF與腫瘤生長的關(guān)系：本研究證實VEGF與非小細(xì)胞肺癌MVD呈正相關(guān)，P<0.05，即VEGF水平越高則MVD值越高，腫瘤進(jìn)展風(fēng)險越大。①VEGF是腫瘤血管生成刺激因子，當(dāng)腫瘤內(nèi)部缺氧時VEGF上調(diào)，VEGF與新生血管空間及時間均密度有關(guān)[6]。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)VEGF引導(dǎo)一系列血管反應(yīng)，VEGF能提高血管通透性，是目前發(fā)現(xiàn)的最強血管通透性刺激物[7-8]。②在活體實驗中，VEGF被證實對腫瘤血管有增殖作用，是血管新生必須因子，而新生血管又促使腫瘤生長；腫瘤生長到一定體積后，腫瘤中央部分細(xì)胞離血管較遠(yuǎn)而缺氧，低氧狀態(tài)刺激某些分子感受器，激活VEGF等血管新生因子[9-10]。③VEGF經(jīng)腫瘤細(xì)胞釋放后與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，促生心血管，是腫瘤生長的營養(yǎng)供給渠道[11-12]。故本研究中腫瘤直徑較大的患者VEGF陽性率更高，P<0.05。目前臨床已經(jīng)將VEGF作為抗腫瘤血管新生的觀察指標(biāo)，以抑制VEGF的抗腫瘤藥物正在大量實驗。本研究還發(fā)現(xiàn)Endostatin與腫瘤血管生成的關(guān)系：本研究經(jīng)多因素分析發(fā)現(xiàn)VEGF與非小細(xì)胞肺癌MVD有關(guān)，P<0.05。有研究者[13]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素成陽性的非小細(xì)胞肺癌組織中，MVD為(25.49±9.42)；在內(nèi)皮抑素陰性表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌組織中，MVD為(35.18±8.87)，差異顯著，P<0.05；經(jīng)多因素分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素與非小細(xì)胞肺癌MVD呈負(fù)相關(guān)(R=0.641，P=0.000)。與本研究結(jié)果一致。Endostain對血管形成基因(EGFR、VEGF-A等)有下調(diào)作用，能上調(diào)抗血管形成基因(EphrinB3、HIF-AN等)表達(dá)，實現(xiàn)病理性血管雙向調(diào)節(jié)；能使血管形成信號專遞途徑下調(diào)，具有廣泛抗血管形成作用[14-15]。即Endostatin水平越高，MVD值越低，腫瘤進(jìn)展風(fēng)險越低，腫瘤直徑越小。故本研究中腫瘤較小者Endostatin陽性率更高，P<0.05。本研究還發(fā)現(xiàn)Endostatin與非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，P均<0.05。

表1 非小細(xì)胞肺癌中Endostatin及VEGF表達(dá)情況(例，%)

表2 COX多因素分析

綜上，Endostain有抑制腫瘤血管新生作用，VEGF有促腫瘤血管生成作用，前者對非小細(xì)胞肺癌有抑制作用，非小細(xì)胞肺癌組織中Endostain越高則TNM分期越低，腫瘤越小，淋巴轉(zhuǎn)移風(fēng)險越低；后者對非小細(xì)胞肺癌有促進(jìn)作用，癌組織中VEGF越高則癌灶進(jìn)展、轉(zhuǎn)移風(fēng)險越高。Endostain、VEGF為抗非小細(xì)胞癌提供了新思路，通過觀察術(shù)中獲取癌旁組織和癌組織中Endostain、VEGF水平能更準(zhǔn)確評估預(yù)后。