劉華玲,史苗苗,2,周亞萍,閆溢哲,2,胡瑞佳,劉延奇,2,*

(1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院,河南鄭州 450002 2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450002)

茶多酚是茶葉中多酚類化合物的總稱,是具有多種生物功能的生物活性物質(zhì)[1]。茶多酚具有抗氧化性、抗癌和抗菌等有益性能,因此,茶多酚作為食品、營養(yǎng)和藥品成分引起了廣泛的關(guān)注[2]。然而,由于茶多酚分子中的羥基非常活潑,對光、熱和堿敏感,在制造、儲存和消費過程中極易發(fā)生氧化、聚合、縮合等反應,失去其抗氧化活性及其他生物學功能,限制了茶多酚在工業(yè)中的應用。為解決這一問題,提出利用直鏈淀粉對茶多酚進行包埋,從而改變茶多酚對光、熱、酸堿的敏感度,使茶多酚保持其原有的化學特性和生物活性[3]。

淀粉主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成,直鏈淀粉主要是由α-1,4糖苷鍵連接而成的聚合物,在配體的存在下,如二甲基亞砜(DMSO)、碘、溴化鉀、氫氧化鉀(KOH)、芳香化合物、脂質(zhì)、脂肪酸和線性醇等[4],直鏈淀粉發(fā)生構(gòu)象變化,形成具有親水性表面和疏水性內(nèi)螺旋孔道左手單螺旋結(jié)構(gòu)的直鏈淀粉復合物[5]。近幾年,淀粉復合物受到越來越多的關(guān)注。Seo等[4]研究了直鏈淀粉-C18脂肪酸復合物的制備與表征。Putseys等[5]研究直鏈淀粉-脂質(zhì)復合物的制備。Luo等[6]研究了脫支淀粉-脂酰膽堿復合物的制備與表征。直鏈淀粉包埋多種分子形成復合物已研究了數(shù)十年,近幾年才有了直鏈淀粉作為生物活性物質(zhì)載體的系統(tǒng)性研究。

本文使用直鏈淀粉為實驗材料,構(gòu)建茶多酚/直鏈淀粉復合物。研究了反應時間、茶多酚添加量和結(jié)晶溫度三個反應參數(shù)對復合物的茶多酚包埋效果及相對結(jié)晶度的影響。并對結(jié)晶結(jié)構(gòu)最佳的茶多酚/直鏈淀粉復合物進行掃描電子顯微鏡(SEM)、X-射線衍射(XRD)、紅外光譜(IR)分析,進一步研究復合物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)和表觀特征,以期為茶多酚/直鏈淀粉復合物的開發(fā)應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯淀粉 固原長城淀粉有限公司;茶多酚 上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、正辛醇、鹽酸均為分析純。

SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;LG10-2.4A型高速離心機 北京醫(yī)用離心機廠;PhilipsXL-3型掃描電子顯微鏡(SEM) 日本日立公司;BrukerTENSOR27型紅外光譜儀(FT-IR)、BrukerD8型X-射線衍射儀(XRD) 德國布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 B型微晶淀粉的制備 參照文獻[7],取一定量的馬鈴薯淀粉,用2.2 mol/L的鹽酸配成質(zhì)量分數(shù)為30%的淀粉懸浮液,35 ℃下恒溫鹽酸酸解3 d,抽濾,用去離子水洗滌4次,再用無水乙醇洗滌3次,收集固體,室溫晾干備用。將酸解得到的馬鈴薯淀粉配成質(zhì)量分數(shù)10%的懸浮液,加熱煮沸使其充分糊化,自然冷卻到室溫,室溫下以4000 r/min離心10 min,除去不溶物,上層清液在-18 ℃下冷凍12 h。將冷凍樣品在室溫下緩慢解凍,當殘余有少量冰晶時,及時抽濾,并用冷水洗滌,收集濾餅在室溫下晾干即為B型微晶淀粉。

1.2.2 直鏈淀粉的制備 短直鏈淀粉-正辛醇復合物的制備參照參考文獻[8]。B型微晶淀粉1.0 g溶解于去離子水中配成5%(w/v)的淀粉溶液,置于三口瓶中加熱至沸騰。將100 μL的正辛醇溶解在10 mL的無水乙醇中,加入熱的淀粉溶液中?；旌暇鶆蚝?加熱回流10 min,隨后在結(jié)晶溫度為60 ℃下將溶液冷至室溫,靜置結(jié)晶完成后,室溫下以4000 r/min離心10 min,分離后冷凍干燥,即得V型短直鏈淀粉-正辛醇復合物。使用無水乙醇以10∶1的量對直鏈淀粉-正辛醇復合物進行洗滌,室溫下4500 r/min離心10 min,重復洗滌離心3次后,除去部分正辛醇,在-50 ℃下冷凍干燥,即得直鏈淀粉。

1.2.3 茶多酚/直鏈淀粉復合物的制備 直鏈淀粉1.0 g溶解于50 mL去離子水中配成2%(w/v)的淀粉懸浮液,加入一定量的茶多酚,混勻后置于恒溫水浴鍋中在一定溫度下攪拌一定時間后,室溫下4500 r/min離心10 min,所得沉淀在-50 ℃下冷凍干燥,即得茶多酚/直鏈淀粉復合物。

1.2.4 不同因子對茶多酚/直鏈淀粉復合物的影響

1.2.4.1 不同淀粉/茶多酚配比對復合物的影響 固定反應時間為2 h,反應溫度為30 ℃,淀粉/茶多酚配比分別為:10∶1、10∶2、10∶3、10∶4、10∶5,探究淀粉/茶多酚配比對復合物制備的影響,每組試驗重復3次。

1.2.4.2 反應溫度對復合物的影響 固定反應時間為2 h,淀粉/茶多酚配比為10∶3,反應溫度分別為:20、30、40、50、60、70 ℃,探究反應溫度對復合物制備的影響,每組試驗重復3次。

1.2.4.3 反應時間對復合物的影響 固定反應溫度為30 ℃,淀粉/茶多酚配比為10∶3,反應時間分別為:0.5、1、2、3、4 h,探究反應時間對復合物制備的影響,每組試驗重復3次。

1.2.5 復合物中茶多酚包埋率的測定 通過酒石酸亞鐵分光光度法[9]測定茶多酚的包埋率。茶多酚的包埋率是指復合物中的茶多酚的量與加入茶多酚的總量的百分比。它是衡量茶多酚包埋效果的指標,反應有多少茶多酚被直鏈淀粉所包埋。

以茶多酚為標準,其濃度在0～1 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),符合比爾定律,線性良好。此標準曲線的回歸方程為:Y=0.1916X+0.1526(決定系數(shù)R2為0.9954,回歸效果顯著)通過分光光度計測定茶多酚的包埋率。將反應所得的上清液稀釋至適當?shù)臐舛群?通過分光光度法測定上清液中的茶多酚含量,無水乙醇作空白,吸光度歸零,按照酒石酸亞鐵法在540 nm下測定上清液中茶多酚的吸光度,測得的吸光度值代入標準曲線,得到茶多酚的包埋率。

其計算公式如下:

式中,m1:復合物的質(zhì)量;c1:茶多酚的總濃度;c2:分光光度計測得的茶多酚的濃度;V:溶劑的體積;m2:茶多酚的質(zhì)量;m3:茶多酚與直鏈淀粉的總質(zhì)量。

1.2.6 X-射線法分析(XRD) 取樣品粉末置于長方形鋁片的孔中(孔大小為15 mm×20 mm,厚為115 mm),隨后壓緊,用BurkerD8型X射線衍射儀測定,所用波長為0.1542 nm的單色Cu-Kα射線。測試條件為:管壓3 kV,管流20 mA,掃描速度4 °/min,掃描區(qū)域5～60 °,采樣步寬0.04°,掃描方式為連續(xù),重復次數(shù)為1。相對結(jié)晶度的計算,由Komiya和Nara等[10]所利用的XRD譜圖計算相對結(jié)晶度的方法。

1.2.7 掃描電子顯微鏡(SEM) 觀察樣品之前,樣品利用噴涂儀對其進行鍍金處理,在操作電壓為20 kV時,使用掃描電子顯微鏡(SEM)觀測樣品的微觀形貌。

1.2.8 紅外光譜(IR) 稱取約2 mg樣品研細,加入150 mg干燥KBr,混合均勻并研細、壓片,壓片厚約0.5 mm,隨后將該薄片進行紅外掃描。測試條件:掃描波數(shù)范圍4000～400 cm-1,分辨率4 cm-1,采用DTGS檢測器,以空氣為空白,掃描3次后取平均值得到樣品的紅外光譜圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

利用Origin 6.1軟件進行數(shù)據(jù)處理,得到復合物中茶多酚包埋效果圖、X-射線衍射圖譜以及紅外光譜,重復三次,茶多酚包埋效果的誤差輸入最大誤差值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對茶多酚包埋率的影響

2.1.1 淀粉/茶多酚配比對茶多酚包埋效果的影響 淀粉/茶多酚配比對茶多酚包埋效果的影響如圖1所示。隨著茶多酚添加量的增加,茶多酚的包埋率也隨之增加。淀粉/茶多酚配比從10∶1變化至10∶3時,茶多酚的包埋率從14.02%迅速增加到38.72%。當茶多酚的添加量進一步增加時,茶多酚的包埋率下降。因此,直鏈淀粉與茶多酚的質(zhì)量比為10∶3。

圖1 淀粉/茶多酚配比對茶多酚包埋率的影響Fig.1 Effect of proportion of starch and tea polyphenols on tea polyphenols embedding rate

2.1.2 反應溫度對茶多酚包埋效果的影響 反應溫度對茶多酚包埋效果的影響如圖2所示。隨著反應溫度從20 ℃升高30 ℃,茶多酚的包埋率從34.66%增加到38.72%。當反應溫度從30 ℃升高到50 ℃時,茶多酚的包埋率降低。反應溫度超過50 ℃時,茶多酚的包埋率下降。因此,直鏈淀粉與茶多酚的最佳反應溫度為30 ℃。

圖2 反應溫度對茶多酚包埋率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on tea polyphenols embedding rate

2.1.3 反應時間對茶多酚包埋效果的影響 如圖3所示,當反應時間從0.5 h增加到1 h時,茶多酚的包埋率從29.39%提高到52.13%。當反應時間低于1 h時,反應時間對直鏈淀粉包埋茶多酚的包埋率較低,可能原因是低于1 h時,直鏈淀粉與茶多酚的反應不充分,造成茶多酚的包埋效果不好。然而,當反應時間超過1 h時,直鏈淀粉與茶多酚充分接觸,直鏈淀粉包埋茶多酚的效率降低,反應時間超過3 h,茶多酚包埋率有增高的趨勢。可能是在水溶液中,直鏈淀粉與茶多酚的包埋是一個動態(tài)過程,直鏈淀粉不斷地包埋與釋放茶多酚。在反應開始時,茶多酚通過疏水作用進入直鏈淀粉的疏水腔,當反應時間太長時,部分茶多酚從疏水腔中釋放出來。

圖3 反應時間對茶多酚包埋率的影響Fig.3 Effect of reaction time on tea polyphenols embedding rate

2.2 不同因素對復合物相對結(jié)晶度的影響

2.2.1 淀粉/茶多酚配比對復合物相對結(jié)晶度的影響 圖4為不同茶多酚配比時,所得復合物的XRD圖。從圖4中可以看出,5種復合物衍射曲線均在5.90 °、17.16 °、22.47 °和24.03 °左右出現(xiàn)了衍射峰,說明茶多酚與V型淀粉復合形成了B型復合物[7]將圖4所得各衍射曲線進行處理,得出各衍射峰強度、面積和結(jié)晶度列于表1。

圖4 不同淀粉/茶多酚配比時所得復合物的XRD圖Fig.4 XRD pattern of the complexes at different proportion of starch and tea polyphenols

表1 不同淀粉/茶多酚配比時所得復合物結(jié)晶度和相關(guān)衍射數(shù)據(jù)Table 1 Crystallinity and related diffraction data of complexes at different proportion of starch and tea polyphenols

從表1可以看出,當?shù)矸?茶多酚配比為10∶1時,此時結(jié)晶度最大,為51.92%。茶多酚添加量太多,多余的茶多酚會阻礙茶多酚和淀粉發(fā)生復合,因此此時的結(jié)晶度明顯下降。這表明,加入配體量的多少直接影響著復合物的結(jié)晶程度。

2.2.2 反應溫度對復合物相對結(jié)晶度的影響 從圖5中可以看出,5種復合物衍射曲線均在5.90 °、17.16 °、22.37 °和24.03 °左右出現(xiàn)了衍射峰,為B型淀粉的特征衍射峰,表明在上述溫度下V型淀粉與茶多酚能形成B型復合物。將圖5所得各衍射曲線進行處理,得出各衍射峰強度、面積和結(jié)晶度列于表2。

表2 不同反應溫度下所得復合物結(jié)晶度和相關(guān)衍射數(shù)據(jù)Table 2 Crystallinity and related diffraction data of complexes at different reaction temperature

圖5 不同反應溫度下所得復合物的XRD圖Fig.5 XRD patterns of the complexes at different reaction temperature

從表2可以看出,當反應溫度為50 ℃時,此時結(jié)晶度最大,為51.33%。隨著反應溫度的升高,淀粉復合物的結(jié)晶溫度在50 ℃達到最高。結(jié)晶度在30～40 ℃變化不大,但超過50 ℃后明顯下降。茶多酚與直鏈淀粉通過疏水作用形成復合物是吸熱過程,反應溫度升高有利于復合物的形成[5]。較高的溫度也使直鏈淀粉與茶多酚分子活動增強,使直鏈淀粉與均勻分散的茶多酚充分結(jié)合形成更多的復合物。然而,溫度過高易使直鏈淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)破壞,進而影響復合物的形成[11]。

2.2.3 反應時間對復合物相對結(jié)晶度的影響 從圖6中可以看出,5種復合物衍射曲線均在5.90 °、17.16 °、22.47 °和24.03 °左右出現(xiàn)了衍射峰,說明茶多酚與V型淀粉復合形成了B型復合物。將圖6所得各衍射曲線進行處理,得出各衍射峰強度、面積和結(jié)晶度列于表3。

圖6 不同反應時間下所得復合物的XRD圖Fig.6 XRD patterns of the complexes at different reaction time

由表3可知,隨著反應時間的增加,淀粉復合物的結(jié)晶度逐漸增加,當反應時間為1 h時,達到最大值。繼續(xù)增加反應時間,淀粉復合物的結(jié)晶度下降,可能是由于攪拌時間過長造成直鏈淀粉螺旋結(jié)構(gòu)的破壞,與配體結(jié)合后為形成較好的晶型。經(jīng)計算分析,反應時間為1 h時得到的B-型微晶淀粉結(jié)晶較好,其結(jié)晶度為50.24%。

表3 不同反應時間下所得復合物結(jié)晶度和相關(guān)衍射數(shù)據(jù)Table 3 Crystallinity and related diffraction data of complexes at different reaction time

2.3 最佳茶多酚包埋效果所得V型復合物的結(jié)構(gòu)表征

上述XRD相對結(jié)晶度的計算發(fā)現(xiàn),當直鏈淀粉與茶多酚配比為10∶1,反應溫度為50 ℃,反應時間為1 h時,所得復合物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)最好,結(jié)晶度最高,達到61.51%,根據(jù)以上條件制得晶型較好的茶多酚/直鏈淀粉復合物,采用XRD、SEM和IR對其結(jié)構(gòu)性能進行表征。

2.3.1 X射線衍射儀分析(XRD) 圖7是茶多酚、B型馬鈴薯淀粉、直鏈淀粉-正辛醇復合物和茶多酚/直鏈淀粉復合物的X射線衍射圖,從圖7可以看出茶多酚無明顯特征衍射峰,B型馬鈴薯淀粉在6.06 °、17.51 °、22.59 °、24.40 °處出現(xiàn)特征衍射峰,V型直鏈淀粉-正辛醇復合物在7.48 °、12.95 °、19.79 °處出現(xiàn)特征衍射峰,這與Liu等[7]、閆溢哲等[8]的結(jié)果一致。以水為溶劑制備所得的茶多酚/直鏈淀粉復合物在5.9 °、17.16 °、22.47 °、24.03 °處出現(xiàn)特征衍射峰,為B型結(jié)晶結(jié)構(gòu),此時的結(jié)晶度為61.51%。

圖7 X-射線衍射圖Fig.7 X-ray diffraction pattern注:a.茶多酚;b.B型淀粉微晶;c.直鏈淀粉-正辛醇復合物;d.茶多酚/直鏈淀粉復合物。

2.3.2 掃描電鏡分析(SEM) 圖8是B型馬鈴薯淀粉、直鏈淀粉-正辛醇復合物和茶多酚/直鏈淀粉復合物的掃描電子顯微鏡照片。圖8a顯示,B型馬鈴薯淀粉微晶顆粒大小較為均勻,球晶顆粒形狀比較圓滑,呈圓形,顆粒之間有輕微的黏連。這與淀粉晶體在溶液中凍結(jié)以及冰塊之間的互相擠壓有一定的關(guān)系[9]。圖8b顯示,直鏈淀粉-正辛醇復合物呈紅細胞狀結(jié)構(gòu),直徑約為5 μm,表面相對光滑,但是部分晶體中心部分有裂縫。這與淀粉鏈在晶體表面沉積以及部分淀粉表面結(jié)晶不完整有一定的關(guān)系[10]。圖8c是茶多酚/直鏈淀粉復合物的掃描電子顯微鏡照片。從圖8中可以看出,復合物呈現(xiàn)無規(guī)則顆粒狀,表面較為粗糙,部分晶體之間有較多的黏連,這是因為直鏈淀粉在水溶劑中穩(wěn)定性較差造成的[11]。

圖8 復合物電子掃描顯微鏡Fig.8 Scanning electron microscope of complexes注:a.B型淀粉微晶(3000×);b.直鏈淀粉-正辛醇復合物(2000×);c.茶多酚/直鏈淀粉復合物(1000×)。

2.3.3 紅外波譜分析(IR) FT-IR光譜已經(jīng)廣泛應用于分析復合物的形成。圖9是茶多酚、B型馬鈴薯淀粉、直鏈淀粉-正辛醇復合物和茶多酚/直鏈淀粉復合物的淀粉紅外光譜圖。從圖中可以看出,B型馬鈴薯淀粉在3410 cm-1處出現(xiàn)一個寬而強的峰,即淀粉的-OH基的振動吸收峰。直鏈淀粉-正辛醇復合物在3400 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,與B型馬鈴薯淀粉相比,此峰向低波數(shù)方向移動,淀粉的-OH和正辛醇中的-OH基發(fā)生締合、疊加造成的[12]。茶多酚/直鏈淀粉復合物在3410 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,可能是復合物中不含正辛醇,從而不能對淀粉的-OH產(chǎn)生影響。2930 cm-1處出現(xiàn)峰為亞甲基的特征峰,直鏈淀粉-正辛醇復合物的峰強度和尖銳程度均強于茶多酚/直鏈淀粉復合物與B型淀粉,這是正辛醇上的亞甲基與淀粉的亞甲基疊加所致。在IR光譜中,由于直鏈淀粉-正辛醇復合物中淀粉和正辛醇發(fā)生疊加,其特征吸收峰的峰強度比茶多酚/直鏈淀粉復合物與B型淀粉特征吸收峰的峰強度大[13]。

圖9 FT-IR 圖譜Fig.9 Fourier transform infrared spectroscopy pattern注:a.茶多酚;b.B型淀粉微晶;c.直鏈淀粉-正辛醇復合物;d.茶多酚/直鏈淀粉復合物。

3 結(jié)論

以直鏈淀粉為原料,茶多酚為配體,采用控溫攪拌方法制備茶多酚/直鏈淀粉復合物,并對影響茶多酚包埋率的因素進行研究。制備茶多酚/直鏈淀粉復合物的最佳條件如下:反應時間1 h,直鏈淀粉與茶多酚比例10∶3,反應溫度30 ℃。并對茶多酚包埋率較好的復合物通過XRD、FT-IR和SEM進行結(jié)構(gòu)表征,XRD測試結(jié)果顯示,茶多酚/直鏈淀粉復合物在5.9 °、17.16 °、22.47 °和24.03 °處出現(xiàn)特征衍射峰,表明淀粉與茶多酚配體發(fā)生絡合作用形成了明顯的B型結(jié)晶,結(jié)晶度可達61.51%。茶多酚/直鏈淀粉復合物制備簡單、反應時間短、成本低,因此,其在食品、藥品等方面有廣闊的應用前景。