張清華, 陸 芝, 張曉陽(yáng), 劉宏毅, 丁 奕, 葉小真, 馮麗貞

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院/福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所，福建 福州 350002)

殺菌劑的大量使用導(dǎo)致病原真菌對(duì)化學(xué)藥劑逐漸產(chǎn)生抗性，病原真菌的多藥耐藥性已成為動(dòng)植物真菌病害的治療和防治過(guò)程中最急需解決的難題.多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MDR(multidrug resistance)主要與多藥耐藥性相關(guān)，可通過(guò)將外源化學(xué)物質(zhì)排出體外，減少外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)真菌的毒害作用或使病原真菌能夠成功定植到寄主中.MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族.MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，其功能獲得了較為廣泛的研究，如煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的Mdr1蛋白、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)AtrD蛋白和裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的Pmd1蛋白[1-3].植物病原真菌MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白除與多藥耐藥性相關(guān)外，還與其致病過(guò)程，如稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)ABC3(MGG_13762)蛋白與病原菌穿透寄主的過(guò)程有關(guān)[4].小麥赤霉菌(Fusariumgraminearum)FGSG_06771基因突變體菌株的致病力明顯下降[5].

桉樹焦枯病(Calonectrialeaf blight)是熱帶和亞熱帶地區(qū)為害桉樹生長(zhǎng)的重要病害之一，嚴(yán)重威脅桉樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6].桉樹焦枯病由麗赤殼屬(Calonectriaspp.)真菌引起，其無(wú)性態(tài)為帚梗柱孢屬(Cylindrocladium)[7].據(jù)統(tǒng)計(jì)，Calonectria現(xiàn)有集群13個(gè)，共71種，其中CalonectriapseudoreteaudiiYA51是福建省內(nèi)分布最廣、致病力最強(qiáng)的病原菌株[8-10].研究發(fā)現(xiàn)桉樹焦枯病菌CpABCB7基因在焦枯病菌侵染桉樹48 h時(shí)上調(diào)表達(dá)，且在67個(gè)ABC基因中表達(dá)量最高.CpABCB7屬于多藥耐藥蛋白MDR，桉樹焦枯病菌中共有12個(gè)MDR蛋白[11].為了解MDR蛋白在桉樹焦枯病菌的具體功能，本研究通過(guò)生物信息軟件對(duì)桉樹焦枯病菌MDR蛋白家族的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，進(jìn)一步通過(guò)qPCR檢測(cè)在分生孢子階段、孢子萌發(fā)階段、桉樹焦枯病菌接種24、48和72 h后及焦枯病菌在H2O2、NaCl、KCl、LiCl、放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿、百菌清和咪康唑脅迫下的表達(dá)情況，研究結(jié)果可為解析MDR基因的具體功能提供數(shù)據(jù)支撐，也可為闡述MDR基因與桉樹焦枯病菌致病和抗藥分子機(jī)制之間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為C.pseudoreteaudiiYA51，由福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所于福建永安桉樹焦枯病危害區(qū)采集分離獲得.基因組NCBI(National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索編號(hào)MOCD 01000000.

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑 總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；NaCl、KCl、H2O2、葡萄糖和硼酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；百菌清、放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿和咪康唑購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司.真菌培養(yǎng)采用PDB培養(yǎng)基，200 g 去皮土豆，20 g葡萄糖； 每升PDB液體培養(yǎng)基加15 g瓊脂粉，制備PDA培養(yǎng)基.

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性測(cè)定 放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿和咪康唑用乙醇溶解，配成100 mg·mL-1母液，4 ℃保存?zhèn)溆?；百菌清用丙酮配置?0 mg·mL-1母液，4 ℃保存?zhèn)溆?將5種藥物根據(jù)表1配置10倍液.待PDA培養(yǎng)基冷卻至45～50 ℃后，將配置好的10倍液分別與PDA培養(yǎng)基以1∶9的比例充分混勻，制成含藥平板.

表1藥物濃度梯度
Table 1 The gradients of drugs mg·mL-1

藥物梯度一梯度二梯度三梯度四梯度五放線菌酮10.10.010.0010.000 1苦參堿 105.02.501.2500.675 0蘆竹堿 105.02.501.2500.675 0咪康唑 101.00.100.0100.001 0百菌清 30.30.030.0030.000 3

將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)10 d后，在菌落邊緣打取直徑6.0 mm的菌餅，并分別接種于1.4.1制好的含藥PDA平板的中央，菌絲面朝下，以加了等量無(wú)菌水的無(wú)藥PDA平板為對(duì)照，每處理重復(fù)3次.28 ℃培養(yǎng)10 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，按公式(1)計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率.將濃度梯度值的菌絲生長(zhǎng)抑制率，將抑制率轉(zhuǎn)換為相應(yīng)幾率值，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行回歸分析，分別計(jì)算5種殺菌劑的EC50.

(1)

1.2.2 生物信息學(xué)分析 通過(guò)ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析其理化性質(zhì).采用PBIL(https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/services/secondaryStructurePred-iction)在線分析工具PHD分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，該分析基于ASTP和MaxHom.然后采用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)對(duì)MDR基因編碼的蛋白序列進(jìn)行分析，并結(jié)合SWISS-MODEL(https://swismodel.expasy.org/interactive)在線服務(wù)對(duì)MDR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析.最后，用SAVES(https://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)在線服務(wù)對(duì)所構(gòu)建的MDR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證.

1.2.3MDR基因表達(dá)分析 焦枯病菌侵染桉樹葉片處理：同葉小真等[12]的方法.

藥物脅迫：將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，然后放置到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d.根據(jù)1.4中計(jì)算出的5種藥物的EC50配置含藥PDB培養(yǎng)基.取邊緣部位菌餅接種于含藥培養(yǎng)基中，以加入無(wú)菌水的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，每個(gè)錐形瓶中加入3個(gè)菌餅，置于恒溫振蕩器中28 ℃ 150 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h.每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物重復(fù).振蕩培養(yǎng)12 h后，用Miracloth收集菌絲并用錫箔紙包裹后液氮速凍，放入-80 ℃冰箱中保存.

氧脅迫：將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，然后放置到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d.取邊緣部位菌餅接種于H2O2濃度為8 mmol·L-1的YEPD培養(yǎng)基中，以無(wú)菌水的YEPD培養(yǎng)基作為對(duì)照組，每個(gè)錐形瓶中加入3個(gè)菌餅，置于恒溫振蕩器中28 ℃ 150 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h.每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物重復(fù).振蕩培養(yǎng)12 h后，用Miracloth收集菌絲并用錫箔紙包裹后液氮速凍，放入-80 ℃冰箱中保存.

金屬鹽脅迫：將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，然后放置到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d.取邊緣部位菌餅接種于分別含有0.8 mol·L-1NaCl、0.6 mol·L-1KCl、0.1 mol·L-1LiCl的YEPD培養(yǎng)基中，以加入無(wú)菌水的YEPD培養(yǎng)基作為對(duì)照組，每個(gè)錐形瓶中加入3個(gè)菌餅，置于恒溫振蕩器中28 ℃ 150 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h.每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物重復(fù).振蕩培養(yǎng)12 h后，用Miracloth收集菌絲并用錫箔紙包裹后液氮速凍，放入-80 ℃冰箱中保存.

分生孢子樣品制備：將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，然后放置到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d.取邊緣部位菌餅接種于改良PDA培養(yǎng)基(土豆40 g·L-1)中，振蕩培養(yǎng)4 d后離心去上清，沉淀物用錫箔紙包裹后液氮速凍，放入-80 ℃冰箱中保存.

分生孢子萌發(fā)階段樣品制備：桉樹焦枯病菌侵染寄主過(guò)程中，主要通過(guò)自然孔口進(jìn)入桉樹體內(nèi)[13]，暫未發(fā)現(xiàn)其他侵染結(jié)構(gòu)；此外，焦枯病菌在葉片表面4 h即萌發(fā)[14,15].因此，本研究主要從分生孢子階段和孢子萌發(fā)階段(振蕩培養(yǎng)4 h)來(lái)檢測(cè)MDR基因的表達(dá)情況.將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d.取邊緣部位菌餅接種于改良PDB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)4 d后過(guò)濾，收集孢子，將孢子加入YEPD培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)濃度為2×10-7spores·mL-1.置于恒溫振蕩器中28 ℃ 150 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 h，離心去上清后，用錫箔紙包裹后液氮速凍，放入-80 ℃冰箱中保存.

采用1.7.1的樣品制備方法，總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司.采用Talent qPCR PreMix試劑盒進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系為：2×Talent qPCR Mix 10.0 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，cDNA模板1.0 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，并加RNase-Free ddH2O至20 μL.引物設(shè)計(jì)采用Primer premier 6.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(表2)，委托生工生物工程有限公司合成.采用2-△△Ct法計(jì)算焦枯病菌MDR基因的表達(dá)量.

表2 桉樹焦枯病菌內(nèi)參基因及其對(duì)應(yīng)引物Table 2 The primer of reference gene in C.pseudoreteaudii

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物對(duì)桉樹焦枯病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

采用SPSS軟件分析放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿、百菌清和咪康唑?qū)﹁駱浣箍莶【z生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果表明，5種藥劑的不同濃度梯度均能影響桉樹焦枯病菌的菌絲生長(zhǎng)量，且這種抑制作用與濃度呈正相關(guān)，濃度越高菌落直徑越小、抑制率越高，且存在顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明分析結(jié)果具有生物學(xué)統(tǒng)計(jì)意義.放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿、百菌清和咪康唑原藥對(duì)桉樹焦枯病菌的EC50分別為0.27、4.00、2.01、2.16和3.73 mg·mL-1.

2.2 MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam在線分析MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，除CpABCB12的氨基酸酸殘基數(shù)為492 aa外，其余11個(gè)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸殘基數(shù)均在1100個(gè)以上.除CpABCB12外，其余11個(gè)MDR蛋白的分子質(zhì)量均相差不大.其中，CpABCB1最大，分子質(zhì)量為149804.34 u；在等電點(diǎn)處，庫(kù)倫相互作用最小，有利于不同蛋白間接觸.通過(guò)預(yù)測(cè)，MDR蛋白的理論等電點(diǎn)為5.48～8.76，CpABCB12轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的等電點(diǎn)偏堿性，而CpABCB1～CpABCB11轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的等電點(diǎn)偏酸性；當(dāng)不穩(wěn)定系數(shù)>40時(shí)，該蛋白不穩(wěn)定蛋白，通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)除CpABCB4(不穩(wěn)定系數(shù)40.18)屬于不穩(wěn)定蛋白外，其余MDR蛋白均屬于穩(wěn)定蛋白；MDR蛋白的平均疏水性(grand average of hydropathicity, GRAVY)值均>0，表明MDR蛋白均為疏水性蛋白(表3).

表3 MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of MDR transporter

2.3 MDR蛋白結(jié)構(gòu)分析

桉樹焦枯病菌MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)采用PHIL的PHD在線服務(wù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明桉樹焦枯病菌MDR轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白的組成均相同，分別為α-螺旋(α-helix)、β-折疊(β-sheet)和無(wú)規(guī)則卷曲(random coil).且桉樹焦枯病菌MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的占比差異性不大，占比從高到低的排列順序?yàn)棣?螺旋>無(wú)規(guī)則卷曲>β-折疊(圖1).從分布上來(lái)說(shuō)，CpABCB1～CpABCB11轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)域?yàn)?TMD-NBD)2，α-螺旋和β-折疊均勻分布在N端和C端.而CpABCB12的結(jié)構(gòu)域?yàn)門MD-NBD，α-螺旋主要分布在N端.桉樹焦枯病菌MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)采用Swiss-model在線功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果共獲得12個(gè)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的預(yù)測(cè)模型，預(yù)測(cè)結(jié)果與前面的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)基本一致(圖2).CpABCB1～CpABCB11轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由2個(gè)TMD結(jié)構(gòu)域和2個(gè)NBD結(jié)構(gòu)域組成，且N端和C端各有1個(gè)TMD結(jié)構(gòu)和1個(gè)NBD結(jié)構(gòu).而CpABCB12轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白只有1個(gè)TMD結(jié)構(gòu)和1個(gè)NBD結(jié)構(gòu)，N端為TMD，C端為NBD，半分子ABCB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的NBD及TMD結(jié)構(gòu)域可通過(guò)形成二聚體行使功能.上述結(jié)果說(shuō)明這12個(gè)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均有明顯的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)特征，因而具有MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性和功能.

采用SAVES在線軟件對(duì)12個(gè)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，由拉氏構(gòu)象(Ramachandran Plot)發(fā)現(xiàn)，除CpABCB10轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白核心區(qū)域的殘基位點(diǎn)僅占85.9%以外，其余MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白核心區(qū)域的殘基位點(diǎn)均占90%以上.3D-1D Score>0.2的殘基位點(diǎn)占65%以上即可證明，二面角是合理的氨基酸殘基占絕大多數(shù)，具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，為合理的模型.所有MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的3D-1D Score>0.2的殘基位點(diǎn)均占80%以上.上述結(jié)果表明，Swiss-model預(yù)測(cè)的12個(gè)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，所預(yù)測(cè)的模型合理.

圖1 MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)占比Fig.1 Proportion of secondary structure of MDR transporter

圖2 MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 3D structure of MDR transporter

2.4 MDR基因表達(dá)分析

2.4.1 總RNA濃度及質(zhì)量檢測(cè) 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示，提取的RNA濃度在390至3100 μg·μL-1范圍內(nèi)，D260 nm/D280 nm均在1.8至2.2范圍內(nèi)，RNA無(wú)降解，純度較好.總RNA的濃度和純度均滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求.

2.4.2 凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 總RNA凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，總RNA具有典型的3種帶型(28s、18s和5s)，無(wú)可見的DNA污染.且條帶是清晰并無(wú)拖拽的，表明提取的總RNA完整性良好，滿足后續(xù)試驗(yàn).

M為marker，1為CK1，2為H2O2，3為NaCl，4為KCl，5為L(zhǎng)iCl，6為CK2，7為放線菌酮，8為苦參堿，9為蘆竹堿，10為百菌清，11為孢子階段，12為萌發(fā)階段，13為接種48 h的對(duì)照組，14為接種48 h，15為CK3，16為接種24 h，17為CK4，18為接種，19為咪康唑.圖3 總RNA凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of total RNA

2.4.3MDR基因表達(dá)分析 采用qPCR的方法分析桉樹焦枯病菌在分生孢子階段、分生孢子萌發(fā)階段、桉樹焦枯病菌接種桉樹葉片24、48和72 h后及焦枯病菌在含H2O2、NaCl、KCl、LiCl、放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿、百菌清和咪康唑誘導(dǎo)下的表達(dá)情況.采用-△△Ct進(jìn)行計(jì)算，并采用生信人熱圖工具記錄12個(gè)MDR基因在14種條件下的表達(dá)情況.紅色代表下調(diào)表達(dá)，藍(lán)色代表上調(diào)表達(dá)，且顏色越深代表表達(dá)越顯著(圖4).結(jié)果表明，僅CpABCB10基因在分生孢子及分生孢子萌發(fā)階段上調(diào)表達(dá).

圖4 MDR基因不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)情況Fig.4 The expression levels of MDR genes under different induction conditions

MDR基因在NaCl、KCl和LiCl條件下均發(fā)生不同程度的表達(dá).NaCl和KCl脅迫下，均有5個(gè)MDR基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，1個(gè)基因發(fā)生上調(diào)表達(dá).其中，CpABCB4基因在NaCl脅迫下表達(dá)倍數(shù)最高.KCl脅迫下CpABCB4和CpABCB5基因的表達(dá)情況均有較高的表達(dá)倍數(shù)；LiCl脅迫下，僅有2個(gè)基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，4個(gè)基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)，且上調(diào)表達(dá)的CpABCB4和CpABCB9基因均不顯著.

氧脅迫下，僅有CpABCB1基因在H2O2誘導(dǎo)下發(fā)生下調(diào)表達(dá)，CpABCB4、CpABCB6、CpABCB7、CpABCB8、CpABCB9和CpABCB11基因均發(fā)生上調(diào)表達(dá).其中，CpABCB11基因的表達(dá)量最高.上述結(jié)果說(shuō)明，CpABCB4、CpABCB6、CpABCB7、CpABCB8、CpABCB9和CpABCB11基因均能介導(dǎo)氧脅迫，且CpABCB11基因發(fā)揮主要作用.

MDR基因在放線菌酮、苦參堿、蘆竹堿、百菌清和咪康唑脅迫下均發(fā)生不同程度的表達(dá).百菌清誘導(dǎo)下，共有6個(gè)MDR基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，5個(gè)MDR基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)，CpABCB8基因的表達(dá)倍數(shù)遠(yuǎn)高于其他MDR基因.放線菌酮誘導(dǎo)下，除CpABCB3基因外，其余MDR基因均發(fā)生上調(diào)表達(dá).苦參堿和蘆竹堿誘導(dǎo)下，分別有5個(gè)和6個(gè)基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，且均有4個(gè)基因發(fā)生下調(diào)表達(dá).同時(shí)，表達(dá)倍數(shù)最高的均為CpABCB7基因.在咪康唑誘導(dǎo)下，共有6個(gè)基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，3個(gè)基因發(fā)生下調(diào)表達(dá)，且表達(dá)倍數(shù)最高的為CpABCB2基因.此外，有且僅有CpABCB7和CpABCB8基因在5種藥物誘導(dǎo)下均發(fā)生表達(dá).有部分基因在3種或4種藥物誘導(dǎo)下能夠上調(diào)表達(dá)，多數(shù)基因均能在2種及2種以上的藥物誘導(dǎo)下發(fā)生上調(diào)表達(dá).上述結(jié)果表明，CpABCB7和CpABCB8基因與桉樹焦枯病菌對(duì)這5種藥物的交替抗藥性存在一定關(guān)聯(lián)，還有部分基因與桉樹焦枯病菌對(duì)3種或4種藥物的交替抗藥性存在一定關(guān)聯(lián).

圖5 MDR基因不同侵染階段趨勢(shì)圖Fig.5 Trend plot of MDR gene at various infection stages

MDR基因在桉樹焦枯病菌接種24 h、48 h和72 h后均發(fā)生不同程度的表達(dá)，不同基因在不同侵染階段的表達(dá)趨勢(shì)有所不同.圖5顯示，桉樹焦枯病菌接種24 h后，僅有CpABCB7基因發(fā)生上調(diào)表達(dá).桉樹焦枯病菌接種48 h后，上調(diào)表達(dá)的基因由1個(gè)變?yōu)?個(gè)，除CpABCB7基因外，CpABCB1和CpABCB8基因也發(fā)生上調(diào)表達(dá)，且CpABCB7基因的表達(dá)倍數(shù)最高.樹焦枯病菌接種72 h后，上調(diào)表達(dá)的基因增加至5個(gè)，CpABCB1和CpABCB7基因仍然發(fā)生上調(diào)達(dá)標(biāo)，CpABCB8基因由上調(diào)表達(dá)變?yōu)橄抡{(diào)表達(dá)，CpABCB6、CpABCB9和CpABCB12基因在此階段發(fā)生上調(diào)表達(dá).在桉樹焦枯病菌接種24 h、48 h和72 h這3個(gè)階段中，僅CpABCB7基因均發(fā)生上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)倍數(shù)在這3個(gè)階段均為最高，表達(dá)趨勢(shì)先上升后下降.上述結(jié)果說(shuō)明，CpABCB8基因桉樹焦枯病菌僅在接種24 h后發(fā)揮作用；CpABCB1基因可能在桉樹焦枯病菌接種24 h、48 h發(fā)揮較為重要的作用；桉樹焦枯病菌接種72 h時(shí)，CpABCB6、CpABCB9和CpABCB12基因均可能發(fā)揮作用.

3 結(jié)論與討論

MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛存在于植物病原真菌中，主要分布于菌體細(xì)胞膜上，其功能主要與多藥抗藥性有關(guān)，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)抗真菌藥物獲得毒素以達(dá)到對(duì)真菌起到保護(hù)作用.本研究共從桉樹焦枯病菌C.pseudoreteaudiiYA51全基因組進(jìn)發(fā)現(xiàn)12個(gè)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于ABCB亞族，其全分子結(jié)構(gòu)域的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)應(yīng)為(TMD-NBD)2型，除CpABCB12是結(jié)構(gòu)為TMD-NBD半分子ABCB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外，其余均為全分子[11].蛋白功能與蛋白結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，為了解MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能與結(jié)構(gòu)間聯(lián)系，本研究通過(guò)對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，初步獲得MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果.且所預(yù)測(cè)的12個(gè)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的均具有穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，所預(yù)測(cè)模型均是合理的.三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)為典型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[16-19]，說(shuō)明MDR基因的進(jìn)化關(guān)系較為保守.

為解析MDR基因參與調(diào)控桉樹焦枯病菌的具體功能，通過(guò)qPCR檢測(cè)12個(gè)MDR基因在不同條件下的表達(dá)情況.結(jié)果表明，桉樹焦枯病菌MDR基因在各種條件下均發(fā)生不同程度的表達(dá).稻瘟菌ABC4基因被證明與芽管的萌發(fā)有關(guān)[20]，稻瘟菌MoABC5、MoABC6和MoABC7基因也可參與維持分生孢子的穩(wěn)定性[21].但尚未有研究表明ABCB基因參與調(diào)控芽管的萌發(fā).在孢子及孢子萌發(fā)階段，僅CpABCB10基因發(fā)生上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明桉樹焦枯病菌MDR基因中僅CpABCB10基因可能參與調(diào)控孢子萌發(fā).Zwiers et al[22]研究表明M.graminicola的MgAtr7基因與重金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，且可通過(guò)該功能來(lái)維持菌體內(nèi)離子的動(dòng)態(tài)平衡.稻瘟菌ABC4基因還與Na+離子的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān).為明確MDR基因與金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)之間是否存在聯(lián)系，通過(guò)qPCR對(duì)該功能進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，MDR基因在3種離子條件下均有不同程度表達(dá)，NaCl條件下表達(dá)倍數(shù)最高的是CpABCB4基因，而KCl和LiCl條件下表達(dá)量最高的均是CpABCB9基因，說(shuō)明CpABCB4和CpABCB9基因參與調(diào)控金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，而其他基因可能發(fā)揮輔助作用或負(fù)調(diào)控作用.

隨著桉樹焦枯病菌的持續(xù)爆發(fā)，殺菌劑在防治過(guò)程中獲得廣泛應(yīng)用，這可能導(dǎo)致病原菌對(duì)殺菌劑的抗藥性持續(xù)增強(qiáng).MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則可通過(guò)將殺菌劑轉(zhuǎn)運(yùn)出病原菌體外來(lái)獲得抗藥性.樓天靈等的研究表明小麥赤霉菌在戊哇醇和樸海因處理后，F(xiàn)GSG_09697.3(MDR)基因的表達(dá)量比處理前分別上升了13.88倍和5.23倍，由該結(jié)果可知MDR基因與藥劑敏感性之間有一定聯(lián)系[5].粉紅粘帚霉(Gliocladiumroseum)IK726的ABC基因ABC3260在綠針假單胞菌(Pseudomonascholoeaphtis)MA342發(fā)酵液誘導(dǎo)6 h后既發(fā)生上調(diào)表達(dá)等[23,24].而桉樹焦枯病菌在放線菌酮誘導(dǎo)下CpABCB11基因的表達(dá)倍數(shù)最高，在百菌清和咪康唑誘導(dǎo)下CpABCB8和CpABCB2基因中表達(dá)倍數(shù)最高.CpABCB7基因苦參堿、蘆竹堿中表達(dá)倍數(shù)均為最高.上述結(jié)果表明CpABCB7和CpABCB8基因可參與調(diào)控桉樹焦枯病菌對(duì)外源化學(xué)的交替抗藥性.

病原菌侵染寄主過(guò)程中，寄主可通過(guò)釋放大量H2O2和次生代謝物質(zhì)來(lái)抵抗病原菌的侵襲.Sun et al[4]研究表明稻瘟病菌ABC3轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與氧化應(yīng)激應(yīng)答反應(yīng)，并參與調(diào)控稻瘟病菌滲透和突破寄主.稻瘟菌MoABC5、MoABC6和MoABC7基因均可對(duì)H2O2產(chǎn)生應(yīng)激響應(yīng).通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，桉樹焦枯病菌中有多個(gè)MDR基因在H2O2條件下均發(fā)生上調(diào)表達(dá).同時(shí)，樓天靈[5]通過(guò)對(duì)小麥赤霉菌MDR基因FGSG_06771.3的敲除發(fā)現(xiàn)，其致病能力顯著下降.稻瘟菌ABC3基因病原菌對(duì)寄主的突破和滲透相關(guān).本研究推測(cè)桉樹焦枯病菌MDR基因可能存在類似的機(jī)制.CpABCB1、CpABCB6、CpABC7、CpABCB8、CpABCB9基因在焦枯病菌侵染桉樹不同階段均發(fā)生不同程度的表達(dá).此外，MDR基因除轉(zhuǎn)運(yùn)殺菌劑外，還可通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)植物源化學(xué)物來(lái)避免其對(duì)自身的毒害作用，如灰霉菌BcatrB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在侵染擬南芥的過(guò)程中通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)擬南芥分泌的植保素(亞麻芥素)來(lái)現(xiàn)菌株對(duì)擬南芥的成功侵染[25].赤霉菌(Gibberellapulicaris)MDR轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gpabc1參與轉(zhuǎn)運(yùn)馬鈴薯產(chǎn)生的抗真菌毒素，使其能夠抵御馬鈴薯塊莖產(chǎn)生的抗真菌毒素的毒害作用[26].MDR基因在植物源化學(xué)物苦參堿和蘆竹堿誘導(dǎo)下，分別有5個(gè)和6個(gè)基因發(fā)生上調(diào)表達(dá).上述結(jié)果說(shuō)明MDR基因可能與該機(jī)制有關(guān).此外，在H2O2、植物源化學(xué)物誘導(dǎo)下及侵染過(guò)程，有且僅有CpABCB7基因均發(fā)生上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明CpABCB7基因可參與桉樹焦枯病菌侵染寄主的整個(gè)過(guò)程.

上述結(jié)果表明，CpABCB10可能參與調(diào)控分生孢子穩(wěn)定性和孢子萌發(fā)，CpABCB4和CpABCB9基因可參與調(diào)控金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，CpABCB7和CpABCB8基因參與調(diào)控桉樹焦枯病菌的抗藥機(jī)制.此外，CpABCB7基因還能參與調(diào)控桉樹焦枯病菌的整個(gè)致病過(guò)程.其余MDR基因發(fā)揮輔助作用或負(fù)調(diào)控作用.本結(jié)果為研究MDR基因的具體功能提供數(shù)據(jù)支撐，也可為研究MDR基因與桉樹焦枯病菌致病和抗藥分子機(jī)制之間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ).