沙棘粕醇提物的定性定量分析及其對(duì)衰老小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

張佳嬋，王昌濤,，趙 丹，王成濤,2，孫寶國,2

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）為胡頹子科（Elaeagnaceae）酸刺屬的灌木或小喬木，是西北地區(qū)特有的高原特色水果。沙棘不僅可以當(dāng)水果食用，其籽還可以榨油。沙棘粕是沙棘籽經(jīng)過脫油處理后的副產(chǎn)物，常被丟棄或當(dāng)作飼料使用。但是研究證實(shí)，沙棘粕中仍然富含部分油脂、肽類、糖類、酚類、黃酮、萜類以及原花青素等活性物質(zhì)[1-4]，具有顯著的抗炎、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化功能，對(duì)心腦血管也有顯著保護(hù)功效[5-7]。

目前很多現(xiàn)代分析技術(shù)應(yīng)用于植物化學(xué)物的分析和檢測(cè)，其中超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography coupled with quadruple time-of-f l ight tandem mass spectrometry，UPLCQTOF-MS/MS）是復(fù)雜樣品化學(xué)組成分析及鑒定的重要工具，在缺少標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，仍然可以通過二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)一步轟擊一級(jí)碎片，通過儀器分析軟件計(jì)算可能的碎片分子式，具有高靈敏度、高分辨率、高精密度等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography coupled with triple quadruple mass spectrometry，UPLC-QQQ-MS）技術(shù)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）是目前最受關(guān)注的定量方法，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度高，可有效避免假陽性，已成為復(fù)雜物質(zhì)痕量分析的主流分析技術(shù)[10]。

本研究前期已對(duì)沙棘粕醇提物（sea buckthorn seed extract，SBSE）進(jìn)行一系列的定量分析和功效評(píng)價(jià)[11-12]，但是并未明確以及定量主要的化學(xué)成分，并且其功效評(píng)價(jià)也僅限于化學(xué)水平以及細(xì)胞水平，未涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)首先采用UPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)鑒定SBSE主要化學(xué)成分，通過UPLC-QQQ-MS技術(shù)對(duì)SBSE的部分化學(xué)成分進(jìn)行定量分析；其次，建立以D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)SBSE灌胃小鼠的肝臟組織總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）和脂褐素（lipofuscin，LP）含量。該研究將為SBSE的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘粕來源于青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰荆簧臣纱继嵛锏闹苽浼凹兓椒ㄒ妳⒄瘴墨I(xiàn)[11-12]。SPF級(jí)ICR雄性小鼠，平均體質(zhì)量（23±3）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

乙腈（色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純）、D-半乳糖（分析純） 美國Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)品：沒食子兒茶素（1#）、原花青素B1（2#）、表沒食子兒茶素（3#）、原花青素B2（4#）、兒茶素（5#）、表兒茶素（6#）、表兒茶素沒食子酸酯（7#）、兒茶素沒食子酸酯（8#）、白藜蘆醇（9#）、楊梅素（10#）、槲皮素（11#）、山柰酚（12#）、異鼠李素（13#）、山柰素（14#）、蘆?。?5#）、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（16#）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（17#），異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（18#）、異鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷（19#）、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷（20#）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（21#） 上海源葉科技有限公司；生理鹽水、無水乙醇（分析純） 北京化工廠；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒、GSH-Px檢測(cè)試劑盒、SOD檢測(cè)試劑盒、CAT檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒、T-AOC檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司；超純水由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC儀、Xevo G2 Q-TOF高分辨四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 美國Waters公司；UPLC-QQQ-MS儀美國Agilent公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；CAP225D分析天平（十萬分之一） 德國Sartorius公司；DSHZ-300恒溫水浴振蕩器 江蘇省太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SPx-250BF-2生化培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FC Multiskan酶標(biāo)儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；Anke 3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 UPLC-QTOF-MS/MS分析條件

UPLC條件：二極管陣列檢測(cè)器；C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；洗脫溶劑：流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2.00 μL；梯度洗脫程序：0～1 min，100% A；1～4 min，100%～40% A；4～7 min，40%～0% A；7～12 min，0% A；12～12.10 min，0%～100% A。

MS條件：ES mode電噴霧離子源，負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～2 000；毛細(xì)管電壓2.3 kV；碰撞氣N2；離子源溫度120 ℃；干燥器溫度400 ℃；錐孔氣流量20.0 L/h；脫溶劑氣流量800.0 L/h；碰撞電壓6.0 kV；飛行管電壓9.0 kV；母離子碰撞能量10～30 eV。

1.3.2 UPLC-QQQ-MS分析條件

UPLC條件：二極管陣列檢測(cè)器；C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；洗脫溶劑：流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2.00 μL。梯度洗脫程序：0～1 min，100% A；1～4 min，100%～40% A；4～7 min，40%～0% A；7～12 min，0% A；12～12.10 min，0%～100% A。

MS條件：ES mode電噴霧離子源，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓2.5 kV；錐孔電壓50 V，脫溶劑氣流量（N2）800.0 L/h；脫溶劑溫度200 ℃；錐孔氣流量（N2）50.0 L/h；離子源溫度150 ℃。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱量1#～21#標(biāo)準(zhǔn)品各1.000 mg，分別置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。因所選標(biāo)準(zhǔn)品中含有同分異構(gòu)體，因此配制成3 個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分組如下：1#、2#、5#、8#、16#、17#、18#、19#、20#及21#為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1，質(zhì)量濃度為25 μg/mL；3#、4#、6#、7#、15#、16#、17#、19#、20#及21#為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2，質(zhì)量濃度為10 μg/mL；9#、10#、11#、12#、13#、14#、17#、19#、20#及21#為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液3，質(zhì)量濃度為5 μg/mL。據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成系列質(zhì)量濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 樣品溶液的制備

精確稱取SBSE 0.050 g，加甲醇25 mL溶解，過0.45 μm濾膜，得到2.00 mg/mL的樣品溶液。

1.3.5 沙棘籽粕化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立

查閱國內(nèi)外沙棘籽、沙棘葉、沙棘枝等植物部位的化學(xué)成分研究相關(guān)文獻(xiàn)[5-7,13-19]，收集可能與沙棘粕相關(guān)的各類化學(xué)成分，并通過Molecular Mass Calculator計(jì)算精確相對(duì)分子質(zhì)量，建立包括化合物名稱、分子式、m/z的醇溶性沙棘化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.3.6 主要化學(xué)成分的鑒定

SBSE樣品以及混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3在1.3.1節(jié)條件下，分析得到SBSE以及混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3的HPLCQTOF-MS/MS總離子流圖。采用MassLynx 4.1軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先，對(duì)比1.3.5節(jié)沙棘籽粕化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，搜索分子離子峰，通過Single Mass Analysis工具在10 μg/mL的質(zhì)量濃度偏差范圍內(nèi)計(jì)算其精確分子式，與相應(yīng)化合物進(jìn)行比對(duì)、鑒定；其次，選擇合適分子離子峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜的裂解，獲得化合物相應(yīng)的碎片離子，根據(jù)離子的裂解情況并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品和文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)一步比對(duì)推測(cè)。

1.3.7 UPLC-QQQ-MS定量分析主要化學(xué)成分

采用MRM定量模式，對(duì)14 種分析物的MS分析條件進(jìn)行優(yōu)化，考慮因素包括母離子和子離子、錐孔電壓和碰撞電壓。分別配制14 種分析物的單標(biāo)工作液，選擇負(fù)離子模式運(yùn)行全掃描的方法測(cè)定單標(biāo)工作液，選擇豐度較高的特征離子作為MRM模式的母離子，采用子離子掃描模式，根據(jù)母離子在不同碰撞電壓條件下的全掃描圖，選擇豐度較強(qiáng)的特征碎片離子作為MRM模式的子離子，優(yōu)化碰撞電壓和錐孔電壓。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行倍比稀釋，配制成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依照色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）和分析物質(zhì)量濃度（X）作線性回歸，求回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)r。進(jìn)一步稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得近似信噪比分別為3和10的質(zhì)量濃度，作為檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantity，LOQ）。

1.3.8 方法驗(yàn)證

精密度實(shí)驗(yàn)：精密吸取3 種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 d內(nèi)連續(xù)重復(fù)6 次，以及連續(xù)測(cè)定6 d，分別記錄分析物的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量濃度，獲得儀器日內(nèi)精密度和日間精密度，用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：分別間隔0、2、4、8、12 h和24 h測(cè)定樣品中分析物的含量，計(jì)算精密度，用RSD表示。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：按照1.3.4節(jié)方法，配制6 份同批次制備的SBSE樣品待測(cè)液，分別測(cè)定分析物的含量，計(jì)算精密度，用RSD表示。

回收率實(shí)驗(yàn)：分別向SBSE樣品待測(cè)液中添加一定量的目標(biāo)分析物，平行6 次，計(jì)算回收率。

表1 SBSE各化學(xué)成分的鑒定分析Table1 Qualitative analysis of chemical constituents in SBSE

1.3.9 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及衰老模型的建立

SPF級(jí)ICR雄性小鼠50 只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分成5 組，每組10 只，分別為：對(duì)照組、模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。除對(duì)照組外，其他各組腹腔注射10% D-半乳糖溶液，劑量為100 mg/（kg·d），以體質(zhì)量計(jì)，下同；對(duì)照組小鼠注射相同劑量生理鹽水；低、中、高劑量組小鼠分別以100、300、600 mg/（kg·d）的SBSE灌胃。對(duì)照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。持續(xù)處理42 d。灌胃期間自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，每隔3 d更換一次墊料，光照充足。

1.3.10 小鼠樣本收集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠處死前12 h禁食，頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟組織以1∶9（g/mL）的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，冰浴條件下勻漿制備10%勻漿液，3 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液用于測(cè)定組織生化指標(biāo)。

1.3.11 小鼠肝臟生化指標(biāo)的測(cè)定

肝臟組織勻漿中SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC活性和氧化產(chǎn)物L(fēng)P和MDA含量的測(cè)定均按照試劑盒說明書的方法進(jìn)行。T-AOC活性以每克組織毫摩爾Trolox計(jì)（mmol/g）；LP含量以每毫克蛋白皮克計(jì)（pg/mg）；MDA含量以每毫克蛋白微摩爾計(jì)（μmol/mg）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P值小于0.05為差異顯著，說明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所得結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-QTOF-MS/MS化學(xué)成分分析

通過比對(duì)分析，共鑒定24 種化合物，如圖1、表1、圖2所示。其中，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)共鑒定出14 種化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)及二級(jí)質(zhì)譜碎片見圖3。

圖1 SBSE的離子色譜圖Fig.1 Base peak ion chromatograms of SBSE analyzed by UPLC-QTOF-MS/MS

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig.2 Base peak ion chromatograms of mixed standard solution by UPLC-QTOF-MS/MS

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)構(gòu)及二級(jí)特征質(zhì)譜信息Fig.3 Structures and MS2 patterns of standard compounds

2.1.1 有機(jī)酸類

如圖1所示，峰1（0.95 min）減去一個(gè)H后，m/z為191.055 6[M－H]－，二級(jí)碎片中存在m/z為127.042 1[M－2H2O－CO－H]－、111.048 5[M－2H2O－CO2－H]－的碎片峰，與參考文獻(xiàn)[20-21]一致，鑒定為奎尼酸。

峰17（7.78 min）m/z為369.302 0[C13H22O12－H]－，二級(jí)碎片存在191.055 1[C7H12O6－H]－，推測(cè)為奎尼酸殘基，存在碎片147.065 7，推測(cè)為戊碳糖殘基，存在319.139 0，推測(cè)為[C12H21O10－H]－，一級(jí)質(zhì)譜碎片369.302 0可能為[M+HCOOH－H]－，二級(jí)碎片173.081 5推測(cè)為C12H21O10脫去C4H7O6和一個(gè)H后的碎片，推測(cè)峰17為奎尼酸戊糖苷。

峰3（3.65 min）減去一個(gè)H后，m/z為153.019 0[M－H]－，二級(jí)碎片中存在m/z為109.028 8[M－CO2－H]－碎片峰，與參考文獻(xiàn)[8]比對(duì)，鑒定為原兒茶酸。峰16（7.67 min）m/z為353.087 2[M－H]－，二級(jí)碎片存在163.038 9[M－3CH2－4CO－2H2O－H]－、191.055 3[M－C9H6O3－H]－的碎片峰，鑒定為綠原酸[8]。

峰2 1（8.2 8 m i n）脫去一個(gè)H后，m/z為279.268 8[M－H]－，二級(jí)碎片離子147.053 9推測(cè)為桂皮酸殘基，133.052 2推測(cè)為戊碳糖脫去OH后的殘基，推測(cè)峰21為桂皮酰戊糖苷。峰23（8.49 min）分子離子峰m/z為281.102 0[M－H]－，二級(jí)碎片離子149.060 4與峰21二級(jí)碎片147.053 9相差2，推測(cè)峰23為二氫桂皮酸殘基，133.047 3為戊碳糖脫去OH后的殘基，推測(cè)峰23為二氫桂皮酰戊糖苷。

2.1.2 原花青素類

如圖1所示，峰2（3.25 min）和峰4（3.62 min）的分子離子峰m/z為305.064 8[M－H]－和305.065 2[MH]－，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，峰2為沒食子兒茶素，峰4為表沒食子兒茶素。峰5（3.70 min）分子離子峰m/z為289.070 3[M－H]－，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，保留時(shí)間（3.70 min）與碎片峰（151.037 6、271.062 2、109.030 1）一致，為兒茶素，可能質(zhì)譜條件的差異，參考文獻(xiàn)中該類物質(zhì)的碎片有差異[9,21-25]。

2.1.3 槲皮素及其衍生物

如圖1所示，峰10（5.20 min）m/z為301.034 0，與標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素的保留時(shí)間、一級(jí)碎片和二級(jí)碎片一致，并且碎片信息與參考文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致，因此鑒定為槲皮素。峰8（4.98 min）減去一個(gè)H后，m/z為609.145 4[MH]－，二級(jí)碎片離子有301.035 2、163.061 9、307.102 8和145.050 8，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，推測(cè)峰8為蘆丁，又名槲皮素-3-O-蕓香糖苷。峰15（7.20 min）分子離子峰為463.086 6[M－H]－，二級(jí)碎片離子有283.021 1[M－2CO2－2H2O－4CH2－H]－、109.030 0[M－9CO－H2O－6CH2－H]－、301.040 1[M－2CO2－H2O－4CH2－H]－，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)確定峰15為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。峰22（8.41 min）的保留時(shí)間、分子離子峰以及碎片離子與標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素-3-O-葡萄糖苷-7-O-鼠李糖苷一致，因此鑒定為該化合物。峰19（8.00 min）m/z為609.144 9[M－H]－，二級(jí)碎片有301.043 1[M－2CO2－H2O－4CH2－H]－，推斷為槲皮素衍生物，此外，二級(jí)碎片存在463.092 4，與一級(jí)碎片離子相差146.052 5，推斷含戊碳糖殘基，碎片163.060 9為脫落下的己碳糖碎片，碎片308.050 4為蕓香糖殘基，推測(cè)峰19為槲皮素-蕓香糖苷異構(gòu)體，因保留時(shí)間不同于蘆丁，又因槲皮素3-O-糖苷鍵與7-O-糖苷鍵最為活躍，判斷峰19為槲皮素-7-O-蕓香糖苷。

2.1.4 山柰酚及其衍生物

峰12（5.54 min）m/z為285.038 8，二級(jí)碎片有135.007 9、243.029 9、109.029 0，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)后鑒定為山柰酚。峰6、11、14和24的二級(jí)碎片均具有285.0的碎片離子峰，軟件分析化學(xué)式為[C15H9O6]－，推測(cè)為山柰酚衍生物。峰6（4.57 min）減去一個(gè)H后，m/z為593.150 3[M－H]－，軟件分析推算其分子式為[C27H29O15]－，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生碎片315.050 7[MC16H11O7]－、4 3 1.0 9 6 8[M－C6H10O5－H]－、151.060 9[C5H11O5]－，與文獻(xiàn)[26]比對(duì)，推測(cè)峰6為山柰酚-鼠李糖-葡萄糖苷。

峰11（5.33 min）一級(jí)碎片m/z為431.096 9[MH]－，二級(jí)碎片離子山柰酚殘基285.038 9[C15H9O6]－，經(jīng)計(jì)算與一級(jí)碎片相差146.058 0，推斷碎片為鼠李糖殘基，推斷峰11為山柰酚-鼠李糖苷。

峰14（6.82 min）分子離子峰m/z為447.092 2[MH]－，推測(cè)分子式為[C21H20O11－H]－，二級(jí)碎片有4 2 9.0 2 5 2 [M－H2O－H]－，己碳糖殘基163.055 7[C6H11O5]－，推測(cè)峰14為山柰酚-己糖苷。

峰24（8.76 min）m/z為593.151 2[M－H]－，二級(jí)碎片離子447.093 3為脫去鼠李糖苷后的碎片峰，經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，確定峰24為山柰酚-3-O-蕓香糖苷。

2.1.5 異鼠李素及其衍生物

峰13（5.63 min）分子離子峰為315.049 3，二級(jí)碎片有299.016 4、135.008 5、151.003 5、315.049 5，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)后鑒定為異鼠李素。峰9（5.10 min）分子離子峰為623.155 8[M－H]－，碎片離子299.019 4[M－Rut－H]－和477.102 2[M－Rha－H]－為分別脫去一個(gè)蕓香糖殘基和一個(gè)鼠李糖殘基后的碎片離子，179.056 5為異鼠李素的C環(huán)碎片，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷。峰18（7.82 min）m/z為479.083 0[M－H]－，二級(jí)碎片離子有315.050 6、179.051 7、299.019 9、149.026 9，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)確定為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷。峰20（8.07 min）m/z為623.161 1[M－H]－，二級(jí)碎片離子有461.109 7、477.103 8、315.050 1，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，鑒定為異鼠李素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷。

2.1.6 楊梅素

峰7（4.85 min）分子離子峰為317.029 6，二級(jí)碎片有151.001 9（C環(huán)逆Diels-Alder裂解產(chǎn)生）、299.018 7[M－H2O－H]－、109.030 9，與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)后確認(rèn)為楊梅素[23]。

2.2 UPLC-QQQ-MS化學(xué)成分定量分析

表2 14 種分析物的質(zhì)譜測(cè)定條件Table2 Mass spectrometric parameters of 14 compounds

表3 14 種分析物的線性回歸方程Table3 Linear regression curves for 14 compounds

通過查閱文獻(xiàn)以及實(shí)驗(yàn)摸索，確定14 種待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果見表2。采用MRM模式，分別檢測(cè)了一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，并對(duì)線性范圍、r、LOQ、LOD、精密度以及回收率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果分別見表3～5。依照檢測(cè)方法進(jìn)行樣品的定量分析結(jié)果見表6。

表4 14 種分析物的精密度結(jié)果（n=6）Table4 Precision for replication determination of 14 constituents (n= 6)

由表4可知，1 4 種分析物的日內(nèi)精密度（0.52%～1.95%）和日間精密度（0.43%～3.12%）較低，表明儀器精密度良好；重復(fù)性RSD為0.35%～2.21%，表明方法的重復(fù)性良好；穩(wěn)定性RSD為0.75%～2.94%，表明14 種分析物穩(wěn)定性好。由表5可知，14 種分析物的回收率為97.18%～101.22%，RSD為0.15%～1.88%。

表5 14 種分析物的回收率結(jié)果（n=6）Table5 Recoveries of 14 compounds from spiked sample (n= 6)

通過對(duì)SBSE進(jìn)行定量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，山柰酚-3-O-蕓香糖苷在所考察14 種分析物中比例最大，其次為槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷，槲皮素-3-O-葡萄糖苷位居第3。通過歸類計(jì)算，山柰酚及其衍生物所占比例最大（（667.94±5.61）μg/mL），其次為槲皮素及其衍生物（（204.01±0.04）μg/mL），原花青素類物質(zhì)僅為（33.97±0.49）μg/mL。Arimboor等[15]也分析了沙棘籽中具有抗氧化性質(zhì)的糖苷類物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)槲皮素-3-O-蕓香糖苷最多，與本結(jié)果不符，可能原因是原料產(chǎn)地以及提取方式的差異所造成。

表6 SBSE中14 種成分含量（n=3）Table6 Contents of 14 components in SBSE (n= 3)

2.3 SBSE對(duì)小鼠肝臟組織T-AOC、LP和MDA水平的影響

D-半乳糖的連續(xù)注射會(huì)破壞小鼠機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)[27]，使細(xì)胞內(nèi)糖代謝紊亂，機(jī)體積累的大量自由基會(huì)攻擊蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子，引發(fā)氧化反應(yīng)產(chǎn)生大量的LP、MDA等，導(dǎo)致機(jī)體衰老[28-29]。T-AOC、LP和MDA水平是公認(rèn)的評(píng)價(jià)機(jī)體衰老的標(biāo)志[30]。

圖4 小鼠肝臟組織中T-AOC（A）、LP（B）和MDA（C）水平Fig.4 Levels of T-AOC (A), LP (B) and MDA (C) in liver of rats

由圖4可知，D-半乳糖誘導(dǎo)的模型組小鼠T-AOC顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），LP和MDA水平顯著高于對(duì)照組（LP，P＜0.05和MDA，P＜0.01），衰老模型建立成功；經(jīng)SBSE灌胃一段時(shí)間后，低劑量組小鼠的T-AOC水平極顯著高于模型組（P＜0.01），中、高劑量組小鼠的T-AOC水平與模型組無顯著性差異；SBSE處理小鼠后，LP和MDA水平均極顯著低于模型組（P＜0.01）。該結(jié)果表明，適當(dāng)劑量SBSE的攝入有助于提高小鼠肝臟組織T-AOC，這與SBSE含有豐富的抗氧化類物質(zhì)是密不可分的。

2.4 SBSE對(duì)小鼠肝臟組織抗氧化酶活性的影響

機(jī)體通過自身的氧化還原系統(tǒng)應(yīng)對(duì)外界刺激導(dǎo)致的氧化應(yīng)激失衡[31-32]。SOD、GSH-Px和CAT的活性直接反映了機(jī)體清除自由基的能力[28,33]。如表7所示，模型組小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px和CAT水平均極顯著降低（P＜0.01），該結(jié)果再一次表明D-半乳糖誘導(dǎo)建立衰老模型的方法是可行的；衰老小鼠經(jīng)過一段時(shí)間SBSE的灌胃，低、中、高劑量組小鼠的SOD、GSH-Px和CAT水平均高于模型組小鼠，且具有顯著性差異（P＜0.05），這同樣與SBSE富含的高抗氧化物質(zhì)息息相關(guān)。

表 7 小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px和CAT水平Table7 Levels of SOD, GSH-Px and CAT in liver of rats

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行SBSE的定性和定量表征。通過與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)以及文獻(xiàn)分析，SBSE共鑒定出24 種化合物。其次，建立其中14 種化學(xué)分析物的定量方法，并對(duì)儀器、樣品和方法進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性以及重復(fù)性的測(cè)定，結(jié)果表明儀器精密度、樣品的穩(wěn)定性以及方法的重復(fù)性均較好。根據(jù)定量結(jié)果排序，14 種分析物中，位居前列的為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷。通過歸類計(jì)算，山柰酚及其衍生物所占比例最大（（667.94±5.61）μg/mL），其次為槲皮素及其衍生物（（204.01±0.04）μg/mL），原花青素類物質(zhì)僅為（33.97±0.49）μg/mL。

本實(shí)驗(yàn)選擇D-半乳糖為誘導(dǎo)劑，通過長期注射，使小鼠機(jī)體氧化還原系統(tǒng)紊亂[34-35]，肝臟各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果顯示，模型組小鼠肝臟組織T-AOC顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），LP和MDA水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其抗氧化酶活力SOD、GSH-Px和CAT水平均極顯著降低，表明D-半乳糖造模成功；SBSE灌胃42 d后，低劑量組小鼠顯示具有提高肝臟抗氧化水平的作用，3 種SBSE劑量下，LP和MDA水平均極顯著低于模型組（P＜0.01），SOD、GSH-Px和CAT水平均顯著高于模型組（P＜0.05）。