， ，，，

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004；2.鄱陽(yáng)湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江西農(nóng)業(yè)大學(xué))/江西省菌物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

乳菇屬(Lactarius)是紅菇科(Russulaceae)中最主要的2個(gè)類群之一，全世界已知乳菇屬真菌超過(guò)600種，其中我國(guó)能夠確認(rèn)名稱的有90個(gè)[1]。大多數(shù)乳菇屬真菌通過(guò)與不同植物形成外生菌根共生關(guān)系，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起促進(jìn)和調(diào)控作用，在陸地森林生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[2-3]。還有一些乳菇屬真菌具有食、藥用價(jià)值，如食用菌有松乳菇[Lactariusdeliciosus(L.ex Fr.) Gray]、橙紅乳菇(LactariusakahatsuTanaka)、雞足山乳菇(LactariuschichuensisW.F.Chiu),藥用菌有辣乳菇[Lactariuspiperatus(L.) Pers.][4-5]。

近年來(lái)，DNA序列提高了乳菇屬真菌物種鑒定的準(zhǔn)確性，ITS(Internal transcribed specer)是核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，在國(guó)內(nèi)外廣泛運(yùn)用于新種和新紀(jì)錄種的鑒定[6-10]。通過(guò)對(duì)我國(guó)乳菇的形態(tài)學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)1個(gè)新記錄種，并進(jìn)行描述報(bào)道，為進(jìn)一步研究我國(guó)乳菇屬真菌多樣性提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試標(biāo)本

標(biāo)本分別于2014—2018年采集于江西中醫(yī)藥大學(xué)和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，經(jīng)硅膠干燥后保存于江西中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館(標(biāo)本號(hào)M.S.SU141、M.S.SU141-1、M.S.SU141-2、M.S.SU141-3、M.S.SU141-4、M.S.SU141-5)和鄱陽(yáng)湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與修復(fù)國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江西農(nóng)業(yè)大學(xué))標(biāo)本館(標(biāo)本編號(hào)為JXSB0590和JXSB0592)。

1.2 研究方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)研究 標(biāo)本的外部形態(tài)特征依據(jù)新鮮子實(shí)體的野外記錄和照片，包括菌蓋、菌褶、菌柄等結(jié)構(gòu)的大小、顏色和形狀，顏色的鑒定依據(jù)《Methuen handbook of colour》的方法[11]。用刀片切取觀察結(jié)構(gòu)所在部位的組織塊，用5% KOH溶液固定和1%剛果紅溶液染色，在明視野或相差視野下觀察、記錄、拍照和繪圖。從研究標(biāo)本的成熟擔(dān)子果上，隨機(jī)測(cè)量20個(gè)成熟擔(dān)孢子。擔(dān)孢子的長(zhǎng)或?qū)捯?a)b～c(d)表示，90%的測(cè)量數(shù)值落在b～c，a、d分別為測(cè)量數(shù)據(jù)中的最小值和最大值；擔(dān)孢子的長(zhǎng)寬比用Q表示，Qm表示多個(gè)擔(dān)孢子長(zhǎng)寬比的算術(shù)平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差[12]。并通過(guò)掃描電鏡(FEI Quanta250)進(jìn)一步觀察孢子紋飾形態(tài)。

1.2.2 分子系統(tǒng)學(xué)研究 基因組總DNA提取采用生工生物工程(上海)股份有限公司Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒的方法。擴(kuò)增ITS片段所用的引物為ITS4/ITS5。擴(kuò)增體系：PCR mix 15 μL，模板DNA 5 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水8 μL，反應(yīng)總體積為30 μL；擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min，變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃擴(kuò)增5 min，終止溫度為4 ℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將采集標(biāo)本測(cè)得的ITS序列(表1)與NCBI中的序列進(jìn)行比對(duì)，并從其中下載序列，與所測(cè)序列用Clustal X軟件排序[13]。BioEdit v7.0.9用于序列的核對(duì)和編輯[14]。本研究采用最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，最大似然法借助于RaxML v7.2.6軟件完成，經(jīng)1 000次重復(fù)獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)支持[15]，以Multifurcastenophylla作為外類群[6]。

表1 供試思茅乳菇樣品ITS序列信息及GenBank登錄號(hào)Tab. 1 ITS sequence information and GenBank accession number of Lactarius kesiyae

注：a.用于試驗(yàn)的中國(guó)樣本。

Note: a.Chinese sample for study.

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征描述

思茅乳菇LactariuskesiyaeVerbeken & K.D.Hyde sp.nov.,Phytotaxa,2015,207(3):215-241。

宏觀特征：菌蓋直徑1.7～4.5 cm，幼時(shí)凸起，后漸平展至中間凹陷呈漏斗狀，表面光滑，濕時(shí)黏，乳白色、暗金色至淡橘紅色；邊緣梳狀；菌肉淡白色，厚3～5 mm；乳汁白色或透明，傷不變色；菌褶直生至延生，近白色至淡橙紅色，較密，不等長(zhǎng)，1～3 mm寬；菌柄長(zhǎng)2.5～5.0 cm，直徑0.4～1.0 cm，圓柱形，中生，乳白色或淺粉色，空心；基生菌絲體白色(圖1)。

顯微特征：擔(dān)孢子[(5.0～)5.5～7.1(～8.0)]μm×[(5.0～)5.5～7.0(～7.5)]μm，Q=1.000～1.145，Qm=1.045 4±0.043 9，球形至近橢球形，有明顯的脊紋和疣點(diǎn)，多數(shù)脊之間相互交叉形成不完整的網(wǎng)紋，淀粉質(zhì)；擔(dān)子棒狀，四孢子，(35～42)μm×(11～15)μm，內(nèi)部具圓形顆粒；側(cè)生囊狀體(40～68)μm×(5～9)μm，梭形或近紡錘形，薄壁，頂端短尖狀；褶緣囊狀體彎曲，直徑(35～50)μm×(10～13)μm，窄紡錘形，頂端稍尖；子實(shí)層菌髓由絲狀菌絲和球狀或近球狀末端細(xì)胞組成，末端細(xì)胞(10～19)μm ×(4～12)μm；菌蓋皮層厚143～170 μm，黏性，由菌絲交叉組成；菌柄皮層厚120～150 μm，是一個(gè)由菌絲交叉形成的柵欄組織；鎖狀聯(lián)合缺失(圖2、3)。

模式種產(chǎn)地：越南。

生境：春、秋季散生于馬尾松與闊葉樹混交林中地上。

世界分布：中國(guó)、越南、泰國(guó)、韓國(guó)。

A.菌蓋和菌褶特征;B.生境;C.白色乳汁;D.不變色的菌肉 A.Features of pileus and lamellae;B.Photo of habit;C.White latex;D.Unchanging context圖1 思茅乳菇子實(shí)體Fig.1 Basidiocarp of Lactarius kesiyae

A.12 000倍下的孢子;B.18 000倍下的孢子 A.Spores at 12 000 times; B.Spores at 18 000 times圖2 思茅乳菇擔(dān)孢子電子掃描圖Fig.2 SEM photoes of basidiospores of Lactarius kesiyae

A.擔(dān)孢子；B.擔(dān)子與側(cè)生囊狀體；C.褶緣囊狀體；D.側(cè)生囊狀體；E.蓋表皮層；F.柄表皮層。標(biāo)尺=10 μm A.Basidiospores;B.Basidia and cheilocystidia;C.Pleuromacrocystidia;D.Cheilocystidia;E.Pilerpellis;F.Stipitipellis.Bars=10 μm圖3 思茅乳菇顯微特征Fig.3 Microscopic characteristic of Lactarius kesiyae

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

采自我國(guó)的標(biāo)本序列通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST序列比對(duì)，與L.kesiyae序列同源性達(dá)99%，利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，結(jié)果顯示，采自我國(guó)的標(biāo)本與L.kesiyae聚在一個(gè)分支上，并獲得100%支持率。與模式標(biāo)本相比，采自江西南昌的標(biāo)本M.S.Su141、141-1、141-2、141-3、141-4、141-5、JXSB0590和JXSB0592的形態(tài)特征與模式標(biāo)本較一致。綜合形態(tài)與分子證據(jù)，認(rèn)為所采標(biāo)本屬于L.kesiyae。

圖4 基于最大似然法構(gòu)建的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of ITS sequences based on maximum likelihood method

3 結(jié)論與討論

從系統(tǒng)發(fā)育樹上看，思茅乳菇與L.inconspicuus和L.decipiens的親緣性較為接近，但與它們存在形態(tài)上的差異。思茅乳菇主要的識(shí)別特點(diǎn)是個(gè)體大小中等，整體呈淺棕橙色，在潮濕的環(huán)境下菌蓋表面光滑且黏，淺棕灰色至淺棕紅色，邊緣梳狀；乳汁乳白色或透明；擔(dān)孢子具不完全網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；側(cè)生囊狀體較長(zhǎng)且突出。而L.inconspicuus菌褶近延生至延生，淡黃色至亮黃色，傷變紅棕色，菌柄表面褐橙色至棕色，乳汁白色，暴露后緩慢變淡黃色，擔(dān)子近圓形至近棒狀。L.decipiens菌蓋具有黏性，邊緣無(wú)條紋或近無(wú)條紋，菌褶稍下延或下延，乳汁白色，干后呈淡黃色，擔(dān)孢子多球形，具有更細(xì)更明顯的疣。該種于2011年由WISITRASSAMEEWONG等[7]在越南的思茅松(Pinuskesiya)林下采集到，由此把它命名為L(zhǎng)actariuskesiyae；2014年，LEE等[6]在韓國(guó)于赤松(Pinusdensiflora)林下采集到該種；而本次的研究標(biāo)本是在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)的馬尾松(Pinusmassoniana)林下和江西中醫(yī)藥大學(xué)校園馬尾松和濕地松(Pinuselliottii)混合林采集到的，本次發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了該種的寄主范圍。