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(浙江農(nóng)林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州 311300)

桂花(Osmanthusfragrans)自古深受國人的喜愛，作為中國十大傳統(tǒng)名花之一，是園林綠化中常見的優(yōu)良樹種。桂花按開花特性可分為四季桂和秋桂，秋桂又可根據(jù)花色分為金桂(黃色至金黃色系)、銀桂(黃白色至黃色系)和丹桂(橙色至橙紅色系)三大品種群[1]。前人研究發(fā)現(xiàn)，桂花花瓣呈色的主要物質是類胡蘿卜素，桂花不同品種花色的差異主要是由類胡蘿卜素種類和含量的差異引起的[2-3]。銀桂花瓣中，主要積累了少量的β-胡蘿卜素；金桂花瓣中主要積累了葉黃素和β-胡蘿卜素；丹桂花瓣中積累了大量的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素[3]。β-胡蘿卜素羥化酶( β-carotene hydroxylase，HYB)是植物類胡蘿卜素合成代謝中的關鍵酶之一。在HYB的催化作用下，α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素分別轉化生成葉黃素和玉米黃質[4]，表明HYB對植物類胡蘿卜素組分及其最終含量產(chǎn)生重要作用。目前，已從中國水仙(Narcissustazettavar.chinensis)[5]、金花茶(Camellianitidissima)[6]、文心蘭(Oncidium‘Gower Ramsey’)[7]等植物中分離得到HYB基因序列。本研究利用桂花轉錄組測序數(shù)據(jù)庫[8]中Unigene序列信息，結合RT-PCR技術在桂花不同品種中克隆得到2個桂花HYB基因家族成員HYB1和HYB2的開放閱讀框序列，進行其核苷酸序列和氨基酸序列對比以及進化樹分析，探索其與桂花花色之間的關系，為后續(xù)桂花HYB1和HYB2基因功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試材及取樣

以桂花銀桂品種玉玲瓏(YLL)、金桂品種金球桂(JQG)、丹桂品種堰虹桂(YHG)和四季桂品種日香桂(RXG)為試驗材料，每個桂花品種鈴梗期、半開期、盛開期、盛開末期的花序材料均采摘于浙江農(nóng)林大學桂花資源圃?；ㄐ螂x開植株后迅速放入液氮中冷凍保存，后存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA的第1鏈的合成 總RNA提取方法參照RNAprep pure Plant Kit(天根，北京)說明書。cDNA的第1鏈按照Reverse Transcriptase M-MLV(Takara，大連)說明書合成后，儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2HYB1和HYB2的克隆 根據(jù)前期浙江農(nóng)林大學桂花新品種培育課題組已構建的桂花堰虹桂花瓣轉錄組數(shù)據(jù)庫[8]，從中篩選出與HYB基因相關Unigene序列，設計特異性引物對(表1)，以不同品種RNA反轉錄的cDNA為模板，對桂花HYB1和HYB2基因最大閱讀框序列進行PCR擴增。PCR反應體系為RNase-Free ddH2O 28.5 μL，LATaq0.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，PCR Buffer(Mg2+Plus)10 μL，dNTP 8 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循環(huán)35次后，72 ℃ 10 min。PCR反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收、純化，與pMD18-T載體(Takara)連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選陽性克隆，經(jīng)PCR鑒定后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

表1 桂花HYB1和HYB2基因克隆的引物序列Tab.1 Primer sequences for cloning HYB1 and HYB2 genes of Osmanthus fragrans

1.2.3 生物信息學分析 將測序獲得的序列在NCBI網(wǎng)站進行BLAST分析，用ORF Finder進行cDNA的開放閱讀框查找，序列翻譯、氨基酸序列比對采用DNAMAN 6.0軟件進行。應用Expasy提供的Prot-Param在線軟件預測所編碼蛋白質的理論分子質量、理論等電點。用MEGA 5.1軟件對HYB1和HYB2基因編碼的氨基酸序列進行比對,構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 桂花HYB1和HYB2基因的克隆

運用PCR技術完成HYB1和HYB2基因的克隆，擴增產(chǎn)物電泳圖顯示，4個桂花品種HYB1和HYB2基因的PCR產(chǎn)物均在Marker 1 000 bp左右有1條清晰條帶(圖1)。通過測序得到HYB1目的片段大小為996 bp，HYB2目的片段大小為1 021 bp。

用Prot-Param在線軟件預測該4個桂花品種HYB1、HYB2編碼蛋白的理論分子質量、理論等電點(表2)，得出玉玲瓏、金球桂、堰虹桂、日香桂HYB1基因的最大閱讀框序列均為909 bp，編碼的氨基酸殘基為302個，理論等電點為8.52～9.01，理論分子質量為33 712.12～33 828.29 u；HYB2基因最大閱讀框序列為915 bp，編碼的氨基酸殘基為304個，理論等電點為9.17～9.28，理論分子質量為34 038.51～34 133.70 u。

泳道1～4分別表示玉玲瓏、金球桂、堰虹桂、日香桂HYB1基因的擴增條帶；泳道5～8分別表示玉玲瓏、金球桂、堰虹桂、日香桂HYB2基因的擴增條帶; M表示DL2000 Marker

Lines 1—4 represent amplified bands ofHYB1 gene in Yulinglong,Jinqiugui,Yanhonggui,Rixianggui,respectively;Lines 5—8 represent amplified bands ofHYB2 gene in Yulinglong,Jinqiugui,Yanhonggui,Rixianggui,respectively;M represents DL2000 Marker

圖1 不同品種桂花HYB1和HYB2基因擴增結果Fig.1 Gel electrophoresis of PCR amplification results of HYB1 and HYB2 genes in different cultivars of Osmanthus fragrans表2 不同品種桂花HYB1和HYB2基因及其編碼的 蛋白質信息Tab.2 Genes and encoded protein information of HYB1 and HYB2 in different cultivars of Osmanthus fragrans

2.2 桂花HYB1、HYB2序列分析

運用DNAMAN軟件將玉玲瓏、金球桂、堰虹桂、日香桂的HYB1、HYB2基因的核苷酸序列比對后，發(fā)現(xiàn)4個桂花品種的核苷酸序列存在若干變異位點(表3和表4)，其中HYB1基因的變異位點比HYB2基因的變異位點多。4個桂花品種的HYB1、HYB2核苷酸序列變異位點分別有27、12處。

將金球桂、玉玲瓏、堰虹桂、日香桂的HYB1、HYB2基因編碼序列翻譯成氨基酸序列，通過DNAMAN 6.0軟件對比，結果表明，4個桂花品種的HYB1相似度高于99%(圖2)，同樣地，HYB2相似度也高于99%(圖3)，且得到2組保守的組氨酸結構域HXXXXH、HXXHH，其作為催化位點，具有膜碳水化合物羥化酶的特點，在電子傳遞中有著重要的作用，作為保守性高的結構域，對羥化酶發(fā)揮著催化作用。4個桂花品種的HYB1、HYB2氨基酸序列的變異位點分別有8、3處(表5)。

2.3 桂花HYB1、HYB2進化樹分析

在NCBI上查找其他植物HYB同源蛋白序列，運用MEGA軟件將4個桂花品種的HYB1、HYB2蛋白序列與番茄(Solanumlycopersicum，GenBank登錄號NP_001265981.1)、辣椒(Capsicumannuum，GenBank登錄號NC_029979.1)、柿子(Diospyroskaki，GenBank登錄號ACM44688.1)、美國油棕(Elaeisoleifera，GenBank登錄號ABS76147.1)、玉米(Zeamays，GenBank登錄號NP_001105907.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，GenBank登錄號NC_003076.8)、葡萄(Vitisvinifera，GenBank登錄號AFP28800.1)、柑橘(Citrussinensis，GenBank登錄號NC_023050.1)、月季(Rosachinensis，GenBank登錄號XP_024191328.1)、南瓜(Cucurbitamaxima，GenBank登錄號NW_019272050.1)、念珠藻(Nostoclinckia，GenBank登錄號PHK38267.1)HYB蛋白序列構建進化樹進行分析(圖4)，4個桂花品種的HYB1與HYB2親緣性較近，其中堰虹桂和日香桂序列的親緣性更近。與其他植物相比，桂花HYB1與HYB2和茄科植物番茄和辣椒HYB親緣性最高。

表3 不同品種桂花HYB1基因核苷酸序列變異位點Tab.3 Nucleotide mutation sites of HYB1 gene sequence in different cultivars of Osmanthus fragrans

表4 不同品種桂花HYB2基因核苷酸序列變異位點Tab.4 Nucleotide mutation sites of HYB2 gene sequence in different cultivars of Osmanthus fragrans

方框標出的是組氨酸結構域HXXXXH和HXXHH，下同 Boxes indicate histidine structure domains HXXXXH and HXXHH,which is the same in the next figure圖2 不同品種桂花HYB1氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of HYB1 in different cultivars of Osmanthus fragrans

圖3 不同品種桂花HYB2氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of HYB2 in different cultivars of Osmanthus fragrans表5 不同品種桂花HYB1和HYB2基因推導的氨基酸序列變異位點Tab.5 Amino acid residue mutation sites in encoded protein sequences of HYB1 and HYB2 genes in different cultivars of Osmanthus fragrans

品種CultivarHYB13136133197225237252266HYB2161 254 264 YLLFQFAIKSERSSJQGFQFTMRSERRLYHGVEYAIKSKKRSRXGFQYAIKRKKRS

圖4 桂花HYB1、HYB2與其他物種HYB的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of HYB1 and HYB2 from Osmanthus fragrans and HYB sequences from other species

3 結論與討論

HYB是植物類胡蘿卜素合成代謝中的關鍵酶之一。蓖麻(Ricinuscommunis)、金花茶、毛竹(Phyllostachysedulis)、南豐蜜橘(Citrusreticulatavar.kinokun)等植物HYB基因陸續(xù)被分離得到，這些植物HYB基因編碼303～311個氨基酸殘基[6,9-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，4個桂花品種HYB1基因均編碼302個氨基酸殘基，而HYB2基因均編碼304個氨基酸殘基，表明桂花存在不同HYB基因家族成員，同一HYB基因家族成員氨基酸序列長度在不同桂花品種中相同。

玉玲瓏、金球桂、堰虹桂、日香桂品種HYB1、HYB2基因的核苷酸序列和氨基酸序列一致性較高，但均存在若干變異位點。4個桂花品種的HYB1核苷酸序列的變異位點有27處，氨基酸序列的變異位點有8處；HYB2核苷酸序列的變異位點有12處，氨基酸序列的變異位點有3處。前人研究報道HYB含若干個保守組氨酸[13],它們形成保守的組氨酸結構域“HXXXXH”+“HXXHH”,在催化過程中起著十分重要的電子傳遞作用，對羥化酶發(fā)揮著催化作用。南豐蜜橘CHY(AM408552)氨基酸序列含有2組“HXXXXH”+“HXXHH”模體[11]，這與本研究的結果相似，4個桂花品種HYB1和HYB2序列中均含有2組“HXXXXH”+“HXXHH”模體。

運用MEGA軟件將4個桂花品種的HYB1、HYB2蛋白序列與其他物種HYB蛋白序列構建進化樹進行分析，發(fā)現(xiàn)與其他植物相比，桂花HYB1與HYB2與茄科植物番茄和辣椒HYB親緣性最高。本課題組前期分離桂花其他類胡蘿卜素代謝基因OfCRTISO、OfZ-ISO1和OfZ-ISO2序列，進化樹分析也發(fā)現(xiàn)相關類胡蘿卜素代謝蛋白與茄科植物親緣性最高[14]。此外，通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)，不管是HYB1還是HYB2，堰虹桂和日香桂序列均在同一小支，表明在桂花品種形成過程中，與其他品種相比，堰虹桂和日香桂親緣性更近。氨基酸序列對比顯示,堰虹桂和日香桂HYB1氨基酸序列僅存在3處差異位點，而這2個品種HYB2氨基酸序列完全一致，同樣說明堰虹桂和日香桂具有更近的親緣性。作為本研究材料的4個桂花品種中，丹桂品種堰虹桂類胡蘿卜素含量最高，金桂品種金球桂類胡蘿卜素含量次之，日香桂和玉玲瓏類胡蘿卜素含量較低[2]。雖然堰虹桂和日香桂HYB1、HYB2氨基酸序列相似，但是這2個品種花色及其類胡蘿卜素含量存在差異，由此可見，桂花不同品種花色呈現(xiàn)與其HYB1、HYB2氨基酸序列差異無緊密關聯(lián)。