楊 虹，謝明寶，于 輝，農(nóng)興新，楊文豪，楊 映

(佛山科學技術(shù)學院 生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231)

益生菌(Probiotics)是一類對宿主有益的活性微生物，它能產(chǎn)生有益于宿主健康的功效，改善宿主的微生態(tài)平衡。國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)應用的益生菌種類主要有乳酸桿菌(Lactobacillusacidophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、雙歧桿菌(Bifidobacteriuminopinatum)、酵母菌(Yeast)和腸球菌(Enterococci)等[1]。益生菌在動物腸道酸性環(huán)境中具有較高的穩(wěn)定性，能有效抑制有害菌生長，提高動物機體免疫力，同時也參與機體的新陳代謝，為機體提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進動物的生長發(fā)育，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中已被廣泛使用[2]。中草藥多糖與益生菌在生理功能上具有高度一致性。同時，中草藥多糖扮演益生元的角色被廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，它不僅具有免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗氧化等生物學功能，還具有無毒副作用、對動物刺激小等優(yōu)點。玉屏風多糖是由黃芪、白術(shù)和防風三味中草藥經(jīng)傳統(tǒng)水提醇沉技術(shù)得到的復合中草藥多糖，研究表明，玉屏風多糖作為水產(chǎn)飼料的添加劑和免疫增強劑，具有改善水生動物腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、提高機體免疫力、促進生長發(fā)育和保障健康的作用[3-4]。

烏鱧(Channaargus)俗稱黑魚，屬鱸形目(Perciformes)、鱧科(Channaidae)、鱧屬(Channa)，是一種兇猛的肉食性魚類，但因其肉味鮮美，且具有祛瘀活血、怯寒調(diào)養(yǎng)、生肌補血等多種藥理功效，使其具有較高的經(jīng)濟價值與營養(yǎng)價值。在抗生素濫用導致水環(huán)境惡化、水產(chǎn)動物疾病頻發(fā)的今天，尋求新型綠色環(huán)保的抗生素替代品成為水產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點。已有研究證實，2種或2種以上不具有拮抗作用的益生菌復合制劑的作用效果明顯優(yōu)于單一益生菌[5-6]。而且中草藥多糖與益生菌聯(lián)合使用對于動物生長[7]、免疫[8]等的影響也顯著優(yōu)于單獨的復合益生菌。將玉屏風多糖與復合益生菌聯(lián)合使用，是微生態(tài)制劑的一種新思路。目前關(guān)于中藥多糖復合益生菌制劑對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物影響的研究報道相對較少。因此，本研究以烏鱧為試驗對象，在飼料中分別添加復合益生菌(乳酸菌、雙歧桿菌和枯草芽孢桿菌)和玉屏風多糖復合益生菌(玉屏風多糖、乳酸菌、雙歧桿菌和桔草芽孢桿菌)，分析2種微生態(tài)制劑對烏鱧的生長、腸道結(jié)構(gòu)和免疫能力的影響，旨在探究復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中的增益作用與效果，為其在生產(chǎn)中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

基礎(chǔ)飼料參照《實用飼料配方集錦》[9]進行配方設計與配制，其組成成分及營養(yǎng)成分見表1。以基礎(chǔ)飼料為對照組，試驗組為在基礎(chǔ)配方中分別添加0.8%復合益生菌、1.6%復合益生菌、 0.8%玉屏風多糖復合益生菌。復合益生菌由乳酸菌、雙歧桿菌、枯草芽孢桿菌按1∶1∶1比例混合而得，有效活菌量為1.0×109cfu/mL。玉屏風多糖復合益生菌由復合益生菌和玉屏風多糖按1∶1比例混合而得。玉屏風多糖由佛山德眾藥業(yè)有限公司提供，其總還原糖、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、水分和粗纖維的含量分別為34.20%、18.52%、0.71%、8.86%、8.21%和0.67%。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ)) Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis)

注：每千克預混料含8 000 IU 維生素A，7.5 mg 維生素B1，15 mg 維生素B2，100 mg煙酸，12.5 mg 維生素B6，5 mg 維生素B12，50 mg D-泛酸，1 mg生物素，200 mg肌醇，5 mg葉酸，2 500 mg氯化膽堿，240 mg 維生素C， 200 IU 維生素D4，300 mg 維生素E，0 mg維生素K3，400 mg 抗氧化劑，5 mg 氯化鈷，1 000 mg左旋肉堿。

Note: 1 kg of premix contained 8 000 IU VA,7.5 mg VB1,15 mg VB2,100 mg niacin,12.5 mg VB6,5 mg VB12,50 mg D-pantothenic acid,1 mg biotin,200 mg inositol,5 mg folic acid,2 500 mg choline chloride,240 mg VC,200 IU VD4,300 mg VE,0 mg VK3,400 mg BHT,5 mg CoCl2,1 000 mg L-carnitine.

1.2 試驗管理

選取平均體質(zhì)量為(23±0.15)g的健康烏鱧240尾隨機分成4組，即對照組和試驗組(Ⅰ～Ⅲ組)，每組3個重復，每個重復20尾。預試期7 d，正式期56 d，試驗期間保持24 h充氧，水溫為(28±0.5)℃，1 d 2次定時(8:00和16:00)投喂，日投喂量為總體質(zhì)量的2%～4%，每次根據(jù)攝食情況適當調(diào)整投喂量。

1.3 試驗方法

1.3.1 生長性能測定 分別于試驗正式開始和第56天試驗結(jié)束時，對禁食24 h后的烏鱧進行活體計數(shù)和體質(zhì)量稱量，并準確記錄采食量、初均體質(zhì)量(IBW)、末均體質(zhì)量(ABW)等指標，計算體質(zhì)量增加率(WGR)、特定生長率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)和成活率。

1.3.2 腸道形態(tài)測定 第56天試驗結(jié)束后，于無菌環(huán)境下解剖烏鱧，選取長度約1 cm的中腸，采用Carnoy’s固定液固定12～24 h后，進行石蠟包埋與切片，利用常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，并用Image-Pro 6.0圖像處理軟件測定絨毛高度、隱窩深度和肌層厚度，計算絨腺比(V/C)。

1.3.3 血清生化指標測定 第56天試驗結(jié)束后，對禁食24 h后的烏鱧進行尾靜脈采血，室溫靜置一段時間后，于4 ℃、3 000 r/min離心5 min，移取并分裝上層血清，測定總超氧化物歧化酶活性(T-SOD)和溶菌酶活性(LZM)。測定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行。

1.3.4MHCⅠ相對表達量測定 第56天試驗結(jié)束后，解剖分離魚體肝臟、腎臟、鰓絲和肌肉，參照Trizol Reagent(Invitrogen公司)和PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa公司)的說明書進行總RNA的提取與cDNA反轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)NCBI上烏鱧β-actin(GenBank：AQU42895.1)和MHCⅠ(GenBank：ACF74832.1)基因序列設計引物，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR引物序列和產(chǎn)物長度見表2。

采用TaKaRa SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(Perfect Real Time)進行實時熒光定量PCR試驗，反應體系20 μL：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，dH2O 6 μL。反應程序為:94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。目的基因的相對表達量采用2-△△Ct法計算。

表2 目的基因引物序列 Tab.2 Primer sequences in PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均以均值±標準差表示，采用SPSS 19.0進行單因素方差分析和Duncan’s法進行多重比較，分析試驗結(jié)果的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧生長性能的影響

由表3可知，利用復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌處理烏鱧后，直至試驗結(jié)束，沒有試驗魚死亡。試驗組的烏鱧體質(zhì)量增加率和特定生長率顯著高于對照組，飼料系數(shù)則顯著低于對照組；以對照組作為參考，試驗Ⅱ組的烏鱧體質(zhì)量增加率和特定生長率分別提高31.15%和31.01%，飼料系數(shù)降低20.77%。此外，試驗Ⅲ組的烏鱧生長性能優(yōu)于試驗Ⅰ組。

表3 復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧生長性能的影響Tab.3 Effect of compound probiotics and Yupingfeng polysaccharide on growth performance of Channa argus

注：同行肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Values with Different lowercase superscripts within the same line indicate significant difference (P<0.05).The same as below.

2.2 復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由表4可知，復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧腸絨毛高度、隱窩深度和肌層厚度有一定的作用。各試驗組的腸絨毛高度較對照組分別提高17.42%、21.42%和16.98%。隱窩深度表現(xiàn)為：試驗Ⅲ組>對照組>試驗Ⅱ>試驗Ⅰ組。絨腺比表現(xiàn)為：試驗Ⅱ組>試驗Ⅰ組>試驗Ⅲ組>對照組，試驗組與對照組比較均有顯著性差異。與對照組相比，試驗組的肌層厚度分別提高10.51%、14.97%和13.08%，其中試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組與對照組有顯著性差異。

表4 復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Tab.4 Effect of compound probiotics and Yupingfeng polysaccharide on intestinal morphology of Channa argus

2.3 復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧血清生化指標的影響

由表5可知，利用復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌處理烏鱧后，經(jīng)過56 d的飼養(yǎng)，試驗組烏鱧的血清溶菌酶活性顯著高于對照組，分別提高34.52%、37.64%、34.02%，其中以試驗Ⅱ組最明顯，而試驗組之間無顯著性差異。試驗組血清總超氧化物歧化酶活性分別較對照組顯著提高了23.61%、36.11%、40.27%，其中，試驗Ⅱ和Ⅲ組高于試驗Ⅰ組，但試驗組之間無顯著性差異。

表5 復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧LZM、T-SOD活性的影響Tab.5 Effect of compound probiotics and Yupingfeng polysaccharide on LZM and T-SOD activity of Channa argus

2.4 復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧MHCⅠ相對表達量的影響

由表6可知，復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧MHCⅠ相對表達量影響的檢測結(jié)果顯示，MHCⅠ在烏鱧腎臟、肝臟、鰓絲和肌肉中均有不同程度的表達。其中，以腎臟MHCⅠ的表達量最高，肝臟、鰓絲次之。試驗Ⅱ組烏鱧腎臟、肝臟和鰓絲中的MHCⅠ表達量最高，但與其他2個試驗組無顯著性差異。試驗Ⅰ組烏鱧肌肉中的MHCⅠ表達量顯著高于其他3組。

表6 MHCⅠ在烏鱧不同組織中的相對表達量Tab.6 The relative expression levels of MHC Ⅰ in the different parts of Channa argus

3 結(jié)論與討論

本研究表明，復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌均可以促進烏鱧生長發(fā)育。這2種微生態(tài)制劑主要是通過提高烏鱧的腸絨毛高度、降低隱窩深度以及增加肌層厚度來保證腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，從而增強魚體免疫力。因此，建議在烏鱧養(yǎng)殖中，適當添加益生菌或玉屏風多糖復合益生菌等綠色飼料添加劑，以促進烏鱧的健康成長，減少病害的發(fā)生。

3.1 復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧生長性能的影響

益生菌在動物腸道內(nèi)的繁殖過程中能合成多種營養(yǎng)物質(zhì)，如揮發(fā)性短鏈脂肪酸、B族維生素等，還能產(chǎn)生多種消化酶，增強機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，從而促進動物的生長發(fā)育。劉淑蘭等[10]等研究發(fā)現(xiàn)，投喂復合益生菌后大西洋鮭的增長率顯著升高，飼料系數(shù)和死亡率顯著降低，使其生長性能得到明顯改善。王純等[11]對虹鱒、江永明等[12]對奧尼羅非魚以及丁麗等[13]對異育銀鯽的研究也得到了類似結(jié)果，即益生菌可以提高動物的生長性能和存活率。本研究結(jié)果表明，在烏鱧基礎(chǔ)飼料中添加復合益生菌能夠不同程度提高烏鱧的特定生長率和體質(zhì)量增加率，并降低飼料系數(shù)，與上述研究結(jié)果一致。值得注意的是，0.8%玉屏風多糖復合益生菌組烏鱧的生長效果優(yōu)于0.8%復合益生菌組，這可能與復合益生菌的代謝作用有關(guān)。益生菌能夠分泌多種消化酶來補充宿主自身內(nèi)源性酶的不足，并與宿主自身產(chǎn)生的消化酶發(fā)揮疊加作用，將玉屏風多糖分解成小分子物質(zhì)，促進機體吸收利用，從而發(fā)揮益生作用。也有研究證明，多糖是難以被宿主腸道直接消化吸收的，一般是通過腸道內(nèi)微生物發(fā)酵降解才能供宿主和腸道微生物消化吸收，并且有利于宿主的健康生長[14]。然而這與肖拉[15]的研究結(jié)果不同，即在基礎(chǔ)飼糧中單獨添加枯草芽孢桿菌或黃芪多糖可提高建鯉生長性能，在基礎(chǔ)飼糧中同時添加枯草芽孢桿菌和黃芪多糖也可以提高建鯉生長及免疫功能，但不如單獨添加的效果好。這種差異可能是受益生菌和多糖的種類、數(shù)量及比例等因素影響。

3.2 復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧腸道結(jié)構(gòu)的影響

腸道既是機體營養(yǎng)物質(zhì)充分消化吸收的重要器官，也是免疫屏障和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[16]。在對腸道形態(tài)的研究中，一般認為腸絨毛高度、數(shù)量和形態(tài)結(jié)構(gòu)決定了腸道消化的吸收能力，肌層厚度影響著營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運速度[17-18]。而且腸絨毛強有力且有規(guī)律的擺動可以有效阻止外界病原微生物入侵宿主腸道，也可促進腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。益生菌代謝中藥多糖所產(chǎn)生的活性小分子物質(zhì)，可以作為腸上皮細胞和腸道微生物的能量來源，從而促進機體免疫系統(tǒng)的發(fā)育成熟[19]。黃燦等[20]研究表明，益生菌能夠減輕致病菌對腸黏膜結(jié)構(gòu)帶來的損傷，進一步保證了腸道結(jié)構(gòu)的完整性。本研究結(jié)果表明，在烏鱧基礎(chǔ)飼料中添加不同濃度的復合益生菌或玉屏風多糖復合益生菌均能促進烏鱧腸道絨毛生長、提高肌層厚度以及降低隱窩深度，與其在草魚[21-22]、長吻鮠[23]、鯉魚[24]、南亞野鯪[25]等水產(chǎn)動物上的研究結(jié)果基本一致。因此，進一步說明益生菌和多糖能夠促進腸道的生長發(fā)育，提高腸絨毛的高度與密度、肌層厚度以及微絨毛的長度與密度。DANIELS等[26]、MERRIFIELD等[27]、KRISTIANSEN等[28]、LAZADO等[29]的研究結(jié)果也支持了以上觀點。本研究結(jié)果還顯示，0.8%玉屏風多糖復合益生菌組的烏鱧隱窩的生長發(fā)育明顯優(yōu)于0.8%復合益生菌組。但是，有關(guān)玉屏風多糖復合益生菌的添加濃度是否影響烏鱧腸黏膜生長發(fā)育還有待進一步深入研究。

3.3 復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧血清生化指標的影響

溶菌酶是一種重要的非特異性生物防御因子，也是一種消化酶，具有殺滅和消化致病菌的功能，在水產(chǎn)動物免疫防御中起到重要的作用[30]?？偝趸锲缁甘且环N抗氧化酶，能清除自由基，也能催化過氧化物自由基發(fā)生歧化，同時還能防御活性氧對機體的傷害和機體衰老[31]。LZM和T-SOD大小在很大程度上能夠直接反映機體的非特異性免疫防御能力和抗氧化能力。潘雷等[5]、趙晶晶等[31]、李桂英等[32]、夏磊等[33]的研究結(jié)果也都表明，益生菌能顯著提高血清LZM和T-SOD，且與添加單一益生菌比，復合益生菌對機體免疫力具有更好的促進作用。本研究結(jié)果表明，復合益生菌能夠顯著提高LZM和T-SOD，與上述的研究結(jié)果一致。而比較添加0.8%復合益生菌組和添加0.8%玉屏風多糖復合益生菌組發(fā)現(xiàn)，添加0.8%玉屏風多糖復合益生菌組中T-SOD大于添加0.8%復合益生菌組。有研究表明，益生菌與宿主多個功能器官協(xié)同作用在宿主的代謝、免疫調(diào)控等方面起到重要作用[34]，而中藥多糖代謝產(chǎn)物可以作為信號分子在宿主細胞與腸道微生物之間傳遞信息[35]。因此，推測玉屏風多糖復合益生菌對動物機體的免疫調(diào)節(jié)作用可能與益生菌發(fā)酵多糖所產(chǎn)生的發(fā)酵物有關(guān)。

3.4 復合益生菌和玉屏風多糖復合益生菌對烏鱧MHCⅠ相對表達量的影響

MHC是由一系列位于染色體上緊密相連的基因位點組成的具有高度多態(tài)性的一類基因家族，是編碼免疫球蛋白樣受體的高度多態(tài)性基因群，也是跟免疫密切相關(guān)的基因家族[36]。MHCⅠ主要位于細胞表面，參與機體免疫反應，將抗原呈遞到T細胞中去攻擊侵入的病原體，從而在動物機體免疫應答的誘導與調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[37]。MHCⅠ基因在哺乳動物上的研究較廣泛，但魚類MHCⅠ基因的研究起步較晚。MUOZ-ATIENZA等[38]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以提高大菱鲆組織器官中免疫相關(guān)因子MHCⅠ的相對表達量。本研究結(jié)果顯示，MHCⅠ在烏鱧腎臟、肝臟、鰓絲和肌肉中均有不同程度的表達，而且所有試驗組均高于對照組。MHCⅠ在腎臟中的相對表達量最高，在肝臟、鰓絲中中等程度表達，在肌肉中表達量較低，與黎建平[39]、王娟等[40]的研究結(jié)果基本一致。原因可能是腎臟、肝臟是機體的主要免疫組織器官，含有較多的骨髓細胞和淋巴細胞。

綜上所述，在一定范圍內(nèi)，復合益生菌的益生作用與其添加量具有高度相關(guān)性，而相同添加水平，玉屏風多糖與復合益生菌疊加作用效果優(yōu)于單獨使用復合益生菌。基于此，后續(xù)將對復合益生菌與玉屏風多糖之間的配比進行優(yōu)化，尋求最適的混配比例以及在烏鱧飼料中的最適添加量，并且探討玉屏風多糖復合益生菌的益生機制，以期為玉屏風多糖復合益生菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應用提供一些理論依據(jù)。