Adβgal-1和Adβgal-2克隆及其在獼猴桃果實軟化中的作用

馮新，賴瑞聯(lián)，高敏霞，陳文光，吳如健，陳義挺

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和gal-2克隆及其在獼猴桃果實軟化中的作用

馮新，賴瑞聯(lián)，高敏霞，陳文光，吳如健，陳義挺

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/福建省落葉果樹工程技術(shù)研究中心，福州 350013）

【目的】-半乳糖苷酶是一類參與細胞壁降解的糖苷酶，在植物的生長發(fā)育和果實成熟軟化過程中發(fā)揮重要作用。通過對獼猴桃2個-半乳糖苷酶基因的鑒定及其表達模式研究，明確它們在獼猴桃果實軟化中的作用，豐富獼猴桃的后熟軟化機理研究。【方法】以‘米良1號’獼猴桃為試材，采用RT-PCR法擴增果實的-半乳糖苷酶基因，利用在線數(shù)據(jù)庫分析其編碼蛋白的特性、功能結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和調(diào)控miRNA，應(yīng)用qPCR研究其在不同組織部位、果實的不同軟化時期、不同貯藏溫度和ABA處理后的表達特征，并結(jié)合酶活性變化，闡釋這2個-半乳糖苷酶基因在獼猴桃果實軟化中的作用?！窘Y(jié)果】克隆得到2個獼猴桃-半乳糖苷酶基因（和），登錄號分別為MH319788和MH319789。的開放閱讀框為2 280 bp，編碼759個氨基酸；的開放閱讀框為2 025 bp，編碼674個氨基酸。結(jié)構(gòu)域分析顯示，Adgal-1和Adgal-2均含有植物糖苷水解酶家族35的功能結(jié)構(gòu)域（Glyco_hydro_35）。基因結(jié)構(gòu)分析表明，由18個外顯子和17個內(nèi)含子組成，而由17個外顯子和16個內(nèi)含子組成。進化樹分析顯示它們位于兩個不同的進化分支中，且序列差異較大，可能源自不同的基因祖先。qPCR分析結(jié)果表明，和在獼猴桃的各組織部位（根、莖、葉、花、幼果、成熟果）均有表達，但表達水平不同；它們均在果實軟化初期上調(diào)表達，隨著果實硬度的下降，表達量持續(xù)增加；在25℃貯藏過程中，它們均在3 d時上調(diào)表達，隨著時間的推移，表達量增加；而在4℃貯藏過程中，的表達受到抑制，的表達呈波浪式；ABA處理誘導(dǎo)和的表達。酶活性測定結(jié)果顯示，-半乳糖苷酶活性在果實軟化初期略有降低，隨著果實硬度的下降逐漸升高?！窘Y(jié)論】和均參與獼猴桃果實的軟化進程。不同貯藏溫度和ABA處理對獼猴桃果實軟化的影響可能是通過改變-半乳糖苷酶基因的表達而實現(xiàn)的。

獼猴桃；-半乳糖苷酶基因；果實軟化；酶活性；基因表達

0 引言

【研究意義】果實采后的軟化速率直接影響貯藏壽命和貨架期。獼猴桃屬于呼吸躍變型果實，具有明顯的生理后熟過程，且果實采后容易變軟腐爛，難于貯藏[1-2]。民間有獼猴桃“七天軟，十天爛，半月壞一半”的說法[3]。因此，探討獼猴桃的后熟軟化機理對指導(dǎo)采后貯藏具有重要意義。【前人研究進展】細胞壁結(jié)構(gòu)和組分的改變被認為是果實軟化的主要原因[4]。-半乳糖苷酶（beta-galactosidase）是一類參與細胞壁降解的糖苷酶，通過水解-D-半乳聚糖非還原末端的-半乳糖殘基，使果膠和半纖維素等細胞壁組分降解，促使細胞壁膨脹，進而引起果實軟化[5]。已有研究表明-半乳糖苷酶在多種果實的成熟軟化中發(fā)揮重要作用。青梅果實的-半乳糖苷酶活性在采后5 d達到最高值，此時果肉的硬度急劇下降[6]。-半乳糖苷酶在桃果實發(fā)生軟化的起始2 d通過降解果膠物質(zhì)，加速果實軟化[7]。Lidster等[8]采用-半乳糖苷酶活性抑制劑處理蘋果后，發(fā)現(xiàn)果實軟化速率減緩，貨架期延長。植物-半乳糖苷酶由多基因家族編碼，目前已從香蕉[9]、草莓[10]、棗[11]、苦瓜[12]、桃[13]、陸地棉[14]和番木瓜[15]等多種植物中分離得到。-半乳糖苷酶基因家族的不同成員在果實生長發(fā)育和成熟軟化過程中的功能不同。Ban等[16]從柿子果實中分離到4個-半乳糖苷酶基因（—），其中在果實生長期的表達量低，但在果實成熟期的表達量顯著增加；而的表達模式相反，在果實發(fā)育早期高表達，隨著果實成熟，轉(zhuǎn)錄水平下降；和主要在葉和莖中表達，在果實生長期和采后的表達水平都很低。日本梨果實中存在8個-半乳糖苷酶基因（—），其中和僅在成熟果中表達；和在果實膨大期和成熟期均有表達，在成熟果中的表達量最高；、和在果實膨大期的表達量最高，隨著果實成熟，表達量急劇下降[17]。抑制成熟果實中相關(guān)-半乳糖苷酶基因的表達，可以提高細胞壁中半乳糖含量，增加果實硬度[18]。【本研究切入點】前人研究發(fā)現(xiàn)成熟的獼猴桃果實中存在多種-半乳糖苷酶的同工酶[19]，說明存在多個-半乳糖苷酶基因參與獼猴桃的成熟軟化過程。然而，目前僅報道了1條獼猴桃果實的-半乳糖苷酶基因，該基因在果實采收時的轉(zhuǎn)錄水平最高，隨后下降[20]；在獼猴桃果實軟化期間高表達的-半乳糖苷酶基因未見報道。本課題組早期對‘米良1號’獼猴桃果實在25℃貯藏和脫落酸（abscisic acid，ABA）處理的轉(zhuǎn)錄組變化研究中，發(fā)現(xiàn)-半乳糖苷酶2條新片段在果實的后熟軟化中差異表達，因此，有待進一步研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以‘米良1號’獼猴桃為材料，以‘紅陽’基因組中的同源序列為參考，設(shè)計引物，對轉(zhuǎn)錄組中差異表達的2條-半乳糖苷酶基因序列進行克隆驗證，并對其結(jié)構(gòu)及調(diào)控miRNA等進行分析，研究其在不同組織部位、果實的不同軟化時期、不同貯藏溫度和ABA處理后的表達特征，結(jié)合酶活性變化，進一步明確這2個-半乳糖苷酶新基因在獼猴桃果實軟化中的作用，豐富獼猴桃的后熟軟化機理研究，以期為獼猴桃的采后貯藏提供新思路。

1 材料與方法

試驗于2017年在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所進行。

1.1 試材與處理

以‘米良1號’獼猴桃（var.‘Miliang-1’）為供試材料，分別取1年生組培苗的根和4年生嫁接苗的莖、葉、花、幼果（花后16 d）和成熟果（花后160 d）各12 g，用液氮速凍，保存于-80℃冰箱待用，每樣品取3次。

以成熟果（花后160 d）為材料，選擇果實大小、可溶性固形物含量和硬度等指標相近的果實，待散去田間熱后，置于25℃條件下貯藏，在貯藏果實軟化的7個時期（硬熟期、軟化初期、軟化I期、軟化II期、軟化III期、軟化末期和軟爛期），分別稱取12 g果肉，經(jīng)液氮速凍后于-80℃冰箱保存待用，每時期15個果，3次重復(fù)。

采用不同溫度對成熟果（花后160 d）進行貯藏處理，分別在25℃貯藏1、3、5、7、9和11 d時各稱取12 g果肉，在4℃貯藏1、3、5、7、9、11、14、21和28 d時各稱取12 g果肉，以未經(jīng)貯藏的成熟果（0 d）作為對照。采用50 mg·L-1ABA浸泡成熟果（花后160 d）2 min后置于25℃貯藏，并在1、3、5、7和9 d時各稱取12 g果肉，以未經(jīng)ABA處理的成熟果（0 d）作為對照。處理結(jié)束后用液氮速凍，并保存于-80℃冰箱待用，每處理15個果，3次重復(fù)。

1.2 獼猴桃果實軟化過程中的生理生化指標測定

采用GY-1型硬度計測定去皮后的獼猴桃果實硬度，每個果重復(fù)測6次，每處理10個果。使用手持式折射儀測定獼猴桃果實的可溶性固形物含量，每個果重復(fù)測定4次，每處理10個果。參照蘇州科銘生物有限公司的-半乳糖苷酶試劑盒說明書，根據(jù)-半乳糖苷酶可分解對-硝基苯--D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，對-硝基苯酚在400 nm處有最大吸收峰的原理，通過測定吸光值升高速率計算獼猴桃果實的-半乳糖苷酶活性。

1.3 總RNA提取與cDNA合成

根據(jù)TIANGEN的RNAprep Pure Plant Kit（Beijing）試劑盒說明書提取獼猴桃的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計法和1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，質(zhì)量合格的總RNA采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific，USA）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為-半乳糖苷酶基因擴增的模板。

1.4 引物合成與PCR擴增

從‘米良1號’獼猴桃果實軟化的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到2條差異表達的-半乳糖苷酶片段，它們分別比對到‘紅陽’獼猴桃（var.‘Hongyang’）基因組數(shù)據(jù)庫[21]中編號為Ach04g123061和Ach09g294421的-半乳糖苷酶序列。根據(jù)Ach04g123061和Ach09g294421的核苷酸序列信息，設(shè)計兩對引物，分別為-F（5′-TGATATTGCTTCACACCCAGG-3′）和-R（5′-GTATTCTCGCTGTAACATTGTTG-3′），-F（5′-ATGTGGGTTCTGTGCAGATGTG-3′）和-R（5′-CTTGACTTACTCGCACTTGATTGG-3′）進行全長擴增驗證。

PCR反應(yīng)體系為：DreamGreen PCR Master Mix（2×）25 μL、上下游引物各2 μL、模板2 μL、補足無菌雙蒸水至50 μL。PCR擴增條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s（Gal1）/56℃ 30 s（Gal2），72℃ 140 s，循環(huán)35次；72℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，對符合預(yù)期大小的片段，采用?Quick Gel Extraction Kit（TransGen，Beijing）試劑盒進行回收純化，并連接到pEASY-T1（TransGen，Beijing）載體上進行TA克隆，經(jīng)菌液PCR檢測后，隨機挑選3個陽性克隆子送測序。

1.5 獼猴桃β-半乳糖苷酶基因的生物信息學(xué)分析

采用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTN和BLASTP功能分析獼猴桃和其他植物-半乳糖苷酶基因的同源性及功能結(jié)構(gòu)域。利用在線軟件ExPASy（http://web. expasy.org/protparam/）、ProtComp v9.0（http://linux1. softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc）、TMPred（https://embnet. vital-it.ch/software/TMPRED_form.html）、NetPhos 2.0（http://www. cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、SOMPA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?pag e=npsa_sopma.html）和Phyre2（http://www.sbg. bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）分別對獼猴桃-半乳糖苷酶基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)、亞細胞定位情況、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析。采用ClustalX軟件對獼猴桃和其他植物的-半乳糖苷酶序列進行多重比對。應(yīng)用psRNA Target（http://plantgrn.noble.org/ psRNATarget/）在線軟件分析調(diào)控-半乳糖苷酶基因的miRNA，Expectation閾值為4.0，其他參數(shù)為默認值。應(yīng)用Mega軟件的鄰位相連法（Neighbor Joining）構(gòu)建獼猴桃與其他植物-半乳糖苷酶的分子系統(tǒng)進化樹。采用Gene Structure Display Server（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線工具分析獼猴桃-半乳糖苷酶基因的外顯子與內(nèi)含子組成。

1.6 獼猴桃β-半乳糖苷酶基因的實時熒光定量PCR分析

各處理樣品分別取500 ng總RNA作為模板，參照?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal; TransGen, Beijing)說明書合成第一鏈cDNA。根據(jù)獲得的2條-半乳糖苷酶基因序列設(shè)計熒光定量引物，分別為-QF（5′-CACAGAAGACGGATCGAGTAAAG-3′）和-QR（5′-GGGTGCGTCAAATGTAGTCTTA-3′）、-QF（5′-CGGTCTCTTGGAGCAACTAAA-3′）和-QR（5′-CGGCCTCCACTAAGAAATGAT-3′）。以獼猴桃Actin isoform B（）基因作為內(nèi)參基因，引物為-QF（5′-GTGCTCAGTGGTGGTTCAA -3′）和-QR（5′-GACGCTGTATTTCCTCTCAG -3′）[22]。

參照?Top Green qPCR SuperMix（TransGen, Beijing）說明書配置總體積為20 μL的實時熒光定量PCR反應(yīng)液，包含10 μL的20×?Top Green qPCR SuperMix、0.6 μL的上下游引物、0.4 μL的Passive Reference DyeI（50×）、2 μL的模板，補足無菌雙蒸水至20 μL。在Eppendorf熒光定量PCR儀上進行擴增，擴增程序為：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，58℃退火15 s（）/60℃退火15 s（），72℃延伸10 s，40個循環(huán)。PCR循環(huán)結(jié)束立即進行熔解，程序為94℃ 15 s，60℃ 15 s，再升溫至94℃保持15 s。在Eppendorf的Mastercycler?ep realplex軟件中自動生成標準曲線、熔解曲線和樣品Ct值。每個樣品重復(fù)3次。采用2-??Ct法計算2個-半乳糖苷酶基因在各樣品中的相對表達量，并應(yīng)用Graphpad prism軟件進行統(tǒng)計和One-way ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 獼猴桃果實軟化過程中的生理生化指標變化

為了分析獼猴桃果實軟化過程中-半乳糖苷酶活性及其相關(guān)基因的變化，將獼猴桃果實軟化過程劃分為7個時期，分別為硬熟期、軟化初期、軟化I期、軟化II期、軟化III期、軟化末期和軟爛期（圖1）。根據(jù)果實硬度和可溶性固形物含量的結(jié)果可知，獼猴桃果實硬度在軟化過程中不斷下降，而可溶性固形物含量逐漸升高（圖2）。-半乳糖苷酶活性分析結(jié)果表明，在果實軟化初期，-半乳糖苷酶活性略有降低，隨著果實硬度的下降，-半乳糖苷酶活性逐漸升高，在軟化III期時酶活性最高，進入軟化末期時，-半乳糖苷酶活性降低，在軟爛期時再次升高（圖2）。

S1—S7：硬熟期（對照）、軟化初期、軟化I期、軟化II期、軟化III期、軟化末期、軟爛期，標尺：1 cm。下同

**表示差異極顯著（<0.01）。下同

** indicate statistically significant differences at<0.01. The same as below

圖2 獼猴桃果實軟化過程的生理生化指標

Fig. 2 The physiological and biochemical indexes of kiwifruit during fruit softening

2.2 獼猴桃β-半乳糖苷酶基因的克隆與生物信息學(xué)分析

2.2.1 獼猴桃-半乳糖苷酶基因序列的獲得與分析 以‘米良1號’獼猴桃果實的cDNA為模板，分別以-F/R和-F/R為引物，經(jīng)RT-PCR擴增，得到2條分別為2 645 bp和2 182 bp的片段，測序結(jié)果經(jīng)BLASTN分析顯示，它們與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的葡萄（，XM019216619.1和NM001281233.1）、芝麻（，XM011071084.2和XM011094524.2）、亞洲棉（，XM017789264.1和XM017756440.1）和可可（，XM018125599.1和XM007042021.2）等植物的-半乳糖苷酶基因具有很高的相似性（>70%），說明所獲得的2條基因為獼猴桃-半乳糖苷酶基因，分別命名為和。進一步的序列分析顯示，的開放閱讀框（open reading frame，ORF）為2 280 bp，編碼759個氨基酸（GenBank登錄號為MH319788）；的ORF為2 025 bp，編碼674個氨基酸（GenBank登錄號為MH319789）。

將和與‘紅陽’獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫中的同源-半乳糖苷酶序列（Ach04g123061和Ach09g294421）進行比對分析，結(jié)果顯示，比Ach04g123061的ORF在中間多了2段插入序列（165 bp和60 bp），進而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄終止密碼子前移，而其余序列基本相同（圖3）；比Ach09g294421的ORF在中間也多了2段插入序列（180 bp和84 bp），其余序列基本一致（圖4）。和的ORF相似性很低，僅43.49%，可見，獼猴桃-半乳糖苷酶基因家族不同成員間的序列差異較大，但不同獼猴桃品種間的同源-半乳糖苷酶基因具有較高的相似性，說明-半乳糖苷酶基因在獼猴桃不同品種間具有較高的保守性。

圖3 Adβgal-1和Ach04g123061的ORF區(qū)序列比對

2.2.2編碼蛋白的基本性質(zhì)分析 蛋白的基本理化性質(zhì)分析顯示，Adgal-1的分子量為85.48 kD，等電點為7.88，不穩(wěn)定系數(shù)為39.66，總親水值為-0.376，說明Adgal-1具有親水性，是穩(wěn)定的堿性蛋白；Adgal-2的分子量為75.35 kD，等電點為5.83，不穩(wěn)定系數(shù)為38.40，總親水值為-0.280，說明Adgal-2也較穩(wěn)定、具有親水性，但屬酸性蛋白。采用Softberry的ProtComp 9.0工具分析亞細胞定位情況，結(jié)果顯示Adgal-1和Adgal-2均定位在胞外的可能性最大，分值分別為8.4和8.3?？缒そY(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，Adgal-1含2個跨膜螺旋，優(yōu)先跨膜模型為N末端朝外，而Adgal-2僅含有1個跨膜螺旋，優(yōu)先跨膜模型為N末端向內(nèi)，Adgal-1和Adgal-2均具有跨膜結(jié)構(gòu)域，可進行跨膜運輸。綜上，推測Adgal-1和Adgal-2可通過跨膜的方式運輸?shù)桨庑惺构δ堋?/p>

磷酸化修飾是基因在翻譯后水平表達的重要調(diào)控方式，對獼猴桃-半乳糖苷酶蛋白的磷酸化位點分析結(jié)果顯示，Adgal-1的磷酸化位點均勻地分布在整條肽鏈上，共包含45個絲氨酸磷酸化位點、26個蘇氨酸磷酸化位點和16個酪氨酸磷酸化位點；而Adgal-2的磷酸化位點主要分布在第300—674個氨基酸的肽鏈上，共包含有34個絲氨酸磷酸化位點、19個蘇氨酸磷酸化位點和9個酪氨酸磷酸化位點；說明Adgal-1和Adgal-2在翻譯后水平的表達調(diào)控不同。蛋白二級結(jié)構(gòu)分析表明，Adgal-1含有24.90% α-螺旋、21.74%延伸鏈、8.70%-折疊和44.66%自由卷曲；而Adgal-2含有20.03% α-螺旋、22.55%延伸鏈、6.53%-折疊和50.89%自由卷曲，且Adgal-1和Adgal-2蛋白的三維空間構(gòu)型存在明顯差異，暗示它們行使的具體功能不同。

在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLASTP分析顯示，Adgal-1和Adgal-2均含有植物糖苷水解酶家族35的功能結(jié)構(gòu)域（Glyco_hydro_35）。多重序列比對分析結(jié)果如圖5所示，與其他植物的-半乳糖苷酶一樣，獼猴桃Adgal-1含有保守基序GGPIILSQIENEY；而Adgal-2中，該保守基序的第7個氨基酸由絲氨酸（S）變?yōu)楦彼幔≒），香蕉Mugal中則由絲氨酸（S）變?yōu)樘K氨酸（T），該基序與-半乳糖苷酶的活性催化相關(guān)。

2.2.3 調(diào)控的miRNA預(yù)測與分析 miRNAs作為一類非編碼RNA，通過調(diào)控靶基因的表達水平，進而參與植物的生長發(fā)育、衰老和逆境脅迫等過程。采用在線工具psRNA Target[23]和獼猴桃果實miRNA數(shù)據(jù)庫（未發(fā)表）對調(diào)控和的miRNA進行預(yù)測分析，結(jié)果表明的表達受miR408d、miR408b、miR393a-3p的調(diào)控，miR408d、miR408b和miR393a-3p均通過裂解靶基因mRNA的方式調(diào)控的表達；的表達則受miR396g-5p的調(diào)控，miR396g-5p通過抑制靶基因翻譯的方式調(diào)控的表達。

2.2.4 獼猴桃的系統(tǒng)進化分析 為了分析獼猴桃的系統(tǒng)進化，以放線菌-半乳糖苷酶序列作為外群，采用Mega軟件的鄰位相連計算法對獼猴桃和其他25種植物的-半乳糖苷酶序列進行聚類分析，結(jié)果如圖6所示，植物-半乳糖苷酶共聚為兩大分支（A和B），A和B分支均包含2個小分支，即單子葉植物分支和雙子葉植物分支。獼猴桃Adgal-1聚在A分支的雙子葉植物分支，與芝麻的親緣關(guān)系近；Adgal-2則聚在B分支的雙子葉植物分支，與核桃的親緣關(guān)系近。說明獼猴桃Adgal-1和Adgal-2屬于植物-半乳糖苷酶家族的不同成員，可能由兩個不同的-半乳糖苷酶基因祖先進化而來，而且它們具有明顯的種屬特征，在進化上較為保守。

圖4 Adβgal-2和Ach09g294421的ORF區(qū)序列比對

一致性為100%的氨基酸序列用黑色陰影表示，一致性較低的用灰色陰影表示，糖苷水解酶家族35的保守基序用方框標出

分支節(jié)點的數(shù)字表示Bootstrap驗證中基于1000次重復(fù)時該節(jié)點的可信度的百分比。標尺表示分支長度

2.2.5 獼猴桃的基因結(jié)構(gòu)分析 如圖7所示，由18個外顯子和17個內(nèi)含子組成，外顯子的大小在67—297 bp，內(nèi)含子大小在74—4 611 bp；由17個外顯子和16個內(nèi)含子組成，外顯子的大小在67—203 bp，內(nèi)含子大小在76—960 bp。內(nèi)含子剪切位點分析結(jié)果表明，和的所有內(nèi)含子均在“GT-AG”處剪切，這與真核生物內(nèi)含子的剪接規(guī)律一致。

A：獼猴桃Adβgal的外顯子與內(nèi)含子組成。B：Adβgal的外顯子與內(nèi)含子大小，內(nèi)含子長度用括號標注，長度單位（bp）

2.3 Adβgal的表達特征

2.3.1在獼猴桃不同組織部位的表達模式 實時熒光定量PCR分析結(jié)果如圖8所示，和在獼猴桃的各組織部位（根、莖、葉、花、幼果和成熟果）均有表達，但表達水平存在明顯差異。在葉中的表達量最高，其次是根、幼果、花、莖和成熟果；而在幼果中的表達水平最高，其次是莖、根、花、葉和成熟果。

圖8 獼猴桃Adβgal基因在不同組織部位的相對表達量

2.3.2在獼猴桃果實軟化中的表達模式和均在果實軟化初期上調(diào)表達，其中的表達量上調(diào)了38倍，的表達量上調(diào)了8倍。隨著果實的進一步軟化（果實硬度的下降），和的轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)增加；的表達量在軟化末期達到最大值，是硬熟期表達量的679倍；而的表達量在軟化III期時達到最大值，是硬熟期表達量的42倍；說明和均從軟化初期開始參與獼猴桃果實的軟化（圖9）。

2.3.3 不同貯藏溫度對獼猴桃果實表達的影響 溫度影響獼猴桃果實的軟化進程，為了明確不同溫度對獼猴桃β-半乳糖苷酶基因表達的影響，采用qPCR法進行分析，結(jié)果如圖10所示。獼猴桃果實在25℃貯藏過程中，和呈現(xiàn)相似的表達模式。和均在25℃貯藏3 d時上調(diào)表達，隨著時間的推移，表達水平持續(xù)增加，在9 d時達最大值，表達量分別是硬熟期（對照）表達量的940倍和149倍，在11 d時，表達量明顯下降至硬熟期的4.4倍和1.4倍。

圖9 獼猴桃Adβgal在果實軟化過程的相對表達量

*表示差異顯著（P<0.05）indicates statistically significant differences at P<0.05

獼猴桃果實在4℃貯藏過程中，和的表達模式不同。在4℃貯藏的整個過程均下調(diào)表達。的表達量隨4℃貯藏時間的推移呈波浪式，在4℃貯藏7 d時顯著增加，表達量是硬熟期（對照）表達量的7.4倍，之后下降至對照水平，在14 d時再次顯著升高至對照的3.8倍，之后一直維持在較高的表達水平。

2.3.4 ABA處理對獼猴桃果實表達的影響 外源ABA處理促進獼猴桃果實的軟化。實時熒光定量PCR分析結(jié)果如圖11所示，和在ABA處理過的果實中上調(diào)表達。在ABA處理后1 d，表達量是對照的4.5倍，并維持該表達水平，至7 d時進一步上升，在9 d時達到最大值（為對照表達量的43.7倍）。在ABA處理后3 d顯著上調(diào)（為對照表達量的22.3倍），5 d時降至對照表達量的5.1倍，7 d時再次升高并達到最大值（為對照表達量的29.9倍），9 d時的表達量是對照的27.6倍。可見，和在獼猴桃果實中的表達受ABA的誘導(dǎo)。

圖11 獼猴桃Adβgal基因在ABA處理果實中的相對表達量

3 討論

3.1 獼猴桃2個Adβgal的序列特征

植物-半乳糖苷酶基因家族含有多個成員，根據(jù)氨基酸序列長度和結(jié)構(gòu)域差異分為2個類群，類群I編碼712—731個氨基酸，C端不含半乳糖結(jié)合的凝集素結(jié)構(gòu)域（Gal_lectin），類群II編碼832—888個氨基酸，C端含凝集素結(jié)構(gòu)域（Gal_lectin）[5]。本研究獲得的2個分別編碼759個和674個氨基酸，均含有植物糖苷水解酶家族35的功能結(jié)構(gòu)域（Glyco_hydro_35）和保守基序，但不含凝集素結(jié)構(gòu)域（Gal_lectin），因而它們應(yīng)歸類于植物-半乳糖苷酶家族的類群I。然而，和的序列具有較大差異（相似性僅43.49 %），在系統(tǒng)進化樹中處于兩個不同分支，推測它們由不同的-半乳糖苷酶基因祖先進化而來。油菜-半乳糖苷酶家族基因由11—19個外顯子和10—18個內(nèi)含子組成[24]。獼猴桃和分別含有18個和17個外顯子，這與油菜-半乳糖苷酶家族的基因結(jié)構(gòu)類似。雖然和編碼的蛋白都是穩(wěn)定的親水性蛋白，但它們的磷酸化修飾位點、蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)均存在明顯差異，說明和行使的具體功能存在差異。

3.2 獼猴桃2個Adβgal在各組織中差異表達

植物β-半乳糖苷酶家族基因的不同成員在各組織器官中的表達模式不同。鱷梨的轉(zhuǎn)錄本僅在果實中檢測到，且隨著果實成熟不斷積累；在葉、芽、根和果實中均有表達，且參與果實成熟過程；僅在根中表達，但短時氣調(diào)貯藏誘導(dǎo)果實中表達；轉(zhuǎn)錄物在所有組織中都能檢測到（除了果實）[25]。植物-半乳糖苷酶基因在不同組織器官的差異表達與其行使的特定功能有關(guān)。陸地棉在棉纖維的伸長階段高表達，可能參與原代細胞壁的代謝[14]。擬南芥在生長發(fā)育末期的基部節(jié)間和葉片末端高表達，且受表油菜素內(nèi)脂和H3BO3誘導(dǎo)，說明其參與細胞壁變化，導(dǎo)致伸長停止和剛性增強[26]。矮牽?；ò曛械?半乳糖苷酶基因被抑制表達，可防止果膠半乳糖降解，導(dǎo)致開花時的花瓣完整性降低[27]。因而，-半乳糖苷酶廣泛存在于植物的各組織中，參與植物的生長、花發(fā)育和果實成熟等一系列生理生化過程。本研究獲得的和在獼猴桃的各組織部位（根、莖、葉、花、幼果和成熟果）均有表達，但表達水平存在明顯差異，這與它們的氨基酸序列、基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白的磷酸化位點和高級結(jié)構(gòu)不同相符，說明它們行使的具體功能不同。綜上所述，本研究獲得的和并非在果實中特異表達，它們可能還參與根、莖、葉和花的多種生理生化進程。

3.3 Adβgal-1和Adβgal-2參與獼猴桃果實的軟化進程

本研究中，-半乳糖苷酶活性在‘米良1號’（美味獼猴桃）果實軟化過程呈“降-升-降-升”的特征，且在果實軟化中期酶活性最高。這與陳昆松等[20]對中華獼猴桃果實后熟過程的-半乳糖苷酶活性分析結(jié)果類似，中華獼猴桃果實在采收時，-半乳糖苷酶活性較高，隨后略下降，乙烯躍變期間酶活性最高，之后下降。轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果表明和均在‘米良1號’果實軟化初期上調(diào)表達，隨著果實硬度的下降，基因表達量持續(xù)增加，直至軟爛期，表達量仍維持在較高水平。在果實軟化過程中，和雖然在轉(zhuǎn)錄水平的變化與酶活性變化并非一一對應(yīng)，但總體都表現(xiàn)為升高，說明和從軟化初期開始參與果實軟化過程中細胞壁的降解。

冷藏是延長果實貯藏期的高效手段，低溫貯藏是目前應(yīng)用最普遍的獼猴桃保鮮措施[28]。和在25℃貯藏的獼猴桃果實中呈現(xiàn)相似的表達模式，均在25℃貯藏3 d時上調(diào)表達，隨著時間的推移，表達水平持續(xù)增加。而在4℃貯藏的獼猴桃果實中，其的表達水平始終低于硬熟期的表達水平，的表達量隨4℃貯藏時間的推移呈“升-降-升-降-升”模式，但較25℃貯藏相同時間點的表達量低很多。本課題組早期對不同貯藏條件下‘米良1號’果實硬度的分析表明，與貯藏0 d相比，低溫貯藏7、14和28 d時果實硬度下降緩慢，室溫貯藏7 d時果實硬度下降了90.63%[29]。獼猴桃果實硬度在不同貯藏溫度下的下降速度與相同條件下的表達量變化相似。徐秋紅[30]對中國李的采后貯藏研究也表明，低溫可以推遲轉(zhuǎn)錄高峰的出現(xiàn)。除β-半乳糖苷酶基因外，低溫處理還可下調(diào)獼猴桃木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（XET）的mRNA，抑制細胞壁解聚，延緩果實軟化[31]。因而，低溫對獼猴桃果實軟化進程的延緩作用可能是通過抑制β-半乳糖苷酶等細胞壁降解酶基因的表達而實現(xiàn)的。

獼猴桃屬于呼吸躍變型果實，但乙烯躍變峰出現(xiàn)在果實完熟之后[32]。獼猴桃果實在采后初期，ABA含量增加明顯，其峰值出現(xiàn)的時間比乙烯躍變峰早很多，因而認為ABA在獼猴桃采后軟化中的作用更重要[33]。外源ABA處理獼猴桃果實可以提高內(nèi)源ABA含量，加速果實軟化[32]。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，和在25℃貯藏3 d才上調(diào)表達，而在ABA處理后貯藏1 d就上調(diào)表達。說明和的表達受ABA的誘導(dǎo)。因此，ABA對獼猴桃果實軟化進程的促進作用是通過誘導(dǎo)-半乳糖苷酶等細胞壁降解酶基因的上調(diào)表達而實現(xiàn)的。此外，的表達受miR408d、miR408b、miR393a-3p的調(diào)控，而的表達則受miR396g-5p的調(diào)控。和在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達受不同miRNA的調(diào)控，可能與其在特定條件（低溫、ABA處理）下的表達模式差異有關(guān)，但仍需進一步的試驗驗證，今后將采用基因編輯等方法進一步明確這些miRNA在果實軟化中的作用，及其對和的調(diào)控模式。

4 結(jié)論

克隆得到2個新的獼猴桃-半乳糖苷酶基因（和），它們均含有植物糖苷水解酶家族35的功能結(jié)構(gòu)域和保守基序，但它們的基因結(jié)構(gòu)不同，在進化樹中聚在不同的分支。酶活性和熒光定量PCR分析結(jié)果表明，和均從果實軟化初期開始通過上調(diào)基因表達量，提高-半乳糖苷酶活性的方式參與獼猴桃果實的軟化進程。

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Cloning ofandGenes and Their Roles during Fruit Softening of Kiwifruit

FENG Xin, LAI RuiLian,GAO MinXia,CHEN WenGuang, WU RuJian, CHEN YiTing

(Fruit Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences/Research Centre for Engineering Technology of Fujian Deciduous Fruits, Fuzhou 350013)

【Objective】Beta-galactosidase is one type of glycosidases involving in cell wall degradation, which plays an important role in plant growth and fruit ripening and softening. In this paper, the identification and expression analysis of two-galactosidase genes in kiwifruit, as well as their functions during fruit softening, were carried out to provide new insights for the mechanism of kiwifruit softening.【Method】var.‘Miliang-1’ was used as material to amplify the-galactosidase genes by RT-PCR, then their characteristics, functional domains, phylogenetic relationships, gene structures and miRNAs were analyzed by using online databases. qRCR was applied to analyze their expression patterns in different tissues, different stages of softening, different storage temperatures, and ABA treatment. Enzymes activities were also analyzed to clarify the function of these two-galactosidase genes during fruit softening.【Results】Two-galactosidase genes (and) were obtained from kiwifruit. Their accession numbers were MH319788 and MH319789, respectively.had an open reading frame (ORF) of 2 280 bp and encoded 759 amino acids, while the ORF ofwas 2 025 bp encoding 674 amino acids. Protein domain analysis showed that both Adgal-1 and Adgal-2 harbored a functional domain (Glyco_hydro_35) of plant glycoside hydrolase family 35. Gene organization analysis revealed thathad 18 exons and 17 introns, whileharbored 17 exons and 16 introns. Moreover, Adgal-1 and Adgal-2 were clustered in different evolutionary branching in the phylogenetic tree, which was due to the great difference in their sequences. This implied thatandmight originate from different ancestral genes. qPCR analysis showed thatandwere expressed in all tested tissues (root, stem, leaf, flower, young fruit and ripe fruit) although their expression levels were different. The expression levels of bothandwere increased at the start stage of fruit softening, and the amount of gene expression continued to increase as the firmness of fruit decreased. When stored at 25℃, both theandwere upregulated at 3 d, and the amount of gene expression continued to increase as time over. When stored at 4℃, the expression ofwas inhabited, while that ofwas like wavy. ABA induced the expression ofand.【Conclusion】Bothandparticipated in the process of fruit softening of kiwifruit. The effect of storage temperatures and ABA on fruit softening might be achieved by changing the expression of-galactosidase genes.

; beta-galactosidase genes; fruit softening; enzyme activity; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.010

2018-07-01；

2018-11-12

福建省自然科學(xué)基金（2018J05051、2017J01044）、福建省屬公益類科研院所基本科研專項（2018R1013-2、2015R1014-3）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才計劃（YC2017-2）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（STIT2017-3-6）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士科研啟動基金（DC2017-2）

馮新，E-mail：fengxin1506@163.com。通信作者陳義挺，E-mail：fujiankiwifruit@163.com

（責任編輯 趙伶俐）