桃果實(shí)番茄紅素β-環(huán)化酶基因的克隆及表達(dá)分析

梁敏華，楊震峰，蘇新國(guó)，宋春波

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院 食品學(xué)院，廣州 510520；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江寧波 315100；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣州 510640)

桃(PrunuspersicaL.)，原產(chǎn)于中國(guó)，為薔薇目薔薇科多年生大型木本植物，其果實(shí)色、香、味俱全，營(yíng)養(yǎng)豐富。按照果實(shí)色澤分類，現(xiàn)在市場(chǎng)上的桃果實(shí)可分為白肉桃、紅肉桃和黃肉桃，其中黃肉桃果實(shí)中的主要色素成分為類胡蘿卜素[1]。類胡蘿卜素是一類天然植物色素的總稱，共軛雙鍵的分子結(jié)構(gòu)使得其在可見(jiàn)光條件下可呈黃、橙、紅3種顏色或以上3種顏色的混合色[2-3]。

番茄紅素β-環(huán)化酶(lycopene β-cyclase，LCYb)是催化類胡蘿卜素中間產(chǎn)物番茄紅素向β-胡蘿卜素或其他含β環(huán)的類胡蘿卜素組分轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵限速酶[4]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明隨著果實(shí)發(fā)育成熟進(jìn)程的推進(jìn)，果實(shí)中番茄紅素或含β環(huán)的類胡蘿卜素含量變化與LCYb基因的表達(dá)密切相關(guān)[5-7]。研究表明，成熟時(shí)期的黃肉桃果實(shí)，其類胡蘿卜素的主要組分為β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素和玉米黃素等[1, 8]。目前，有關(guān)桃果實(shí)中LCYb基因表達(dá)與β-胡蘿卜素和β-隱黃素等含β環(huán)類胡蘿卜素含量積累之間聯(lián)系的研究鮮有報(bào)道，桃果實(shí)中LCYb基因的分離和鑒定研究也尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以黃肉品種桃果實(shí)為試材，采用基因克隆技術(shù)從桃果實(shí)中獲得LCYb基因全長(zhǎng)序列，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在果實(shí)不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，為闡明其在桃果實(shí)類胡蘿卜素生物合成與積累過(guò)程的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 產(chǎn)自浙江奉化的黃肉品種桃果實(shí)‘金麗’是本試驗(yàn)主要材料。當(dāng)果實(shí)發(fā)育處于盛花后35～45 d、55～65 d、95～105 d、105～120 d、120～150 d 5個(gè)階段，也就是果實(shí)分別發(fā)育至軟核期、硬核期、膨大期、硬熟期和完熟期時(shí)進(jìn)行采樣，分別選取大小均勻、無(wú)蟲(chóng)害及無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 美國(guó)Omega公司的植物RNA提取試劑盒用于提取桃果實(shí)總RNA；北京康為世紀(jì)公司的反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA合成試劑盒用于合成反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA；日本TaKaRa公司的3′、5′-Full RACE cDNA試劑盒用于擴(kuò)增目的基因3′、5′末端序列；美國(guó)Thermo公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA合成 桃果實(shí)果皮和果肉總RNA的提取采用Omega公司的植物RNA提取試劑盒并按說(shuō)明操作。在提取總RNA的過(guò)程中，為防止總RNA中混雜的微量DNA對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的干擾，加入適量無(wú)Rnase活性的DNaseⅠ酶液。反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA的合成采用康為世紀(jì)公司的反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA合成試劑盒并按說(shuō)明操作。

1.2.2 LCYb基因序列克隆與生物信息學(xué)分析 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)用于搜索與桃果實(shí)LCYb氨基酸序列同源性較高的其他植物物種LCYb氨基酸序列。比對(duì)查找上述氨基酸序列的保守區(qū)域，并通過(guò)在線軟件(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)在上述保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表1)。以反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA為模板，采用簡(jiǎn)并引物法PCR擴(kuò)增LCYb基因中間核苷酸序列片段，PCR程序如下：94 ℃預(yù)變性2 min，然后進(jìn)行33個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)，72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠分離、凝膠回收純化、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化及測(cè)序后得到基因的中間核苷酸序列片段。采用TaKaRa公司的3′、5′-Full RACE cDNA試劑盒，按照說(shuō)明，以簡(jiǎn)并引物法得到的LCYb基因核苷酸序列片段為模板分別設(shè)計(jì)LCYb基因3′、5′末端序列擴(kuò)增特異性引物(表1)進(jìn)行3′、5′末端序列PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物同樣經(jīng)凝膠分離、凝膠回收純化、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化及測(cè)序后得到LCYb基因3′、5′末端核苷酸序列片段。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

注Note:*R=A/G；Y=C/T。

1.2.3 LCYb基因生物信息學(xué)分析 基因全長(zhǎng)cDNA序列拼接采用DNAMAN5.2.2軟件?；蚓幋a區(qū)、編碼基因、蛋白性質(zhì)預(yù)測(cè)采用ExPASy在線軟件(http://web.expasy.org)。氨基酸序列比對(duì)分析采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)及GeneDoc2.7.0軟件。蛋白亞細(xì)胞定位及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用在線軟件Predictprotein(https://www.predictprotein.org)。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及展示采用SWISS-MODEL服務(wù)器(http://swissmodel.expasy.org)?；蛳到y(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析采用MEGA 5.1 軟件。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 基因表達(dá)情況分析采用美國(guó)Thermo公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行。按照試劑盒操作說(shuō)明，以上述克隆所得LCYb基因全長(zhǎng)核苷酸序列的編碼區(qū)序列為模板設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)。分別加入1 μL cDNA、1 μL上游引物(100 μmol/L)、1 μL下游引物(100 μmol/L)、13 μL SYBR Green PCR混合液、9 μL DEPC水混合成25 μL PCR反應(yīng)體系。95 ℃預(yù)變性7 min，然后95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，重復(fù)上述步驟40次。以PpTEF2作為內(nèi)參基因[9]，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行陰性對(duì)照。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用2-ΔΔCT法對(duì)目的基因進(jìn)行表達(dá)分析，不同批次及不同果實(shí)組織中基因的表達(dá)情況比較采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析(P≤0.05)，采用OriginPro 9.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LCYb基因的克隆與凝膠分析

通過(guò)簡(jiǎn)并引物法得到的LCYb基因凝膠電泳條帶清晰，測(cè)序得到長(zhǎng)度為606 bp的序列片段(圖1)。通過(guò)3′RACE擴(kuò)增技術(shù)得到LCYb基因3′端PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物凝膠電泳條帶稍暗，經(jīng)后期純化富集測(cè)序仍能得到長(zhǎng)度為706 bp的序列片段(圖1)。通過(guò)5′RACE擴(kuò)增技術(shù)得到的LCYb基因3′端凝膠電泳條帶清晰，測(cè)序得到長(zhǎng)度為1 027 bp的序列片段(圖1)。準(zhǔn)確拼接上述3段序列得到桃果實(shí)LCYb基因的全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度為1 699 bp。通過(guò)調(diào)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有序列數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)顯示，上述克隆獲得的LCYb基因全長(zhǎng)序列與玫瑰LCYb基因(NCBI搜索號(hào)：KP768074)和草莓LCYb基因(NCBI搜索號(hào)：JN979375)全長(zhǎng)序列同源性分別達(dá)88%和86%，因此將它命名為PpLCYb。具體克隆成果已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索號(hào)為KJ789377。

M.100 bp DNA Marker；1.RT-PCR產(chǎn)物 The product of RT-PCR；2.3′RACE產(chǎn)物 The product of 3′RACE；3.5′RACE產(chǎn)物 The product of 5′RACE

2.2 LCYb基因生物學(xué)分析

2.2.1 基本理化性質(zhì)分析PpLCYb基因具有完整的基因編碼區(qū)，長(zhǎng)度為1 515 bp，編碼504個(gè)氨基酸，呈酸性的天冬氨酸、谷氨酸個(gè)數(shù)為54個(gè)，呈堿性的精氨酸、賴氨酸個(gè)數(shù)為61個(gè)，等電點(diǎn)為8.76，呈弱堿性。所編碼的蛋白分子式為C2587H4011N689O719S25，分子質(zhì)量為57.1 ku，性質(zhì)不穩(wěn)定，脂溶指數(shù)85.32，親水指數(shù)-0.163，易溶于水。

2.2.2 氨基酸序列比對(duì)與功能結(jié)構(gòu)域分析 通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)從其他植物物種中在線搜得到9條與PpLCYb基因編碼的氨基酸同源性較高的氨基酸序列。氨基酸序列比對(duì)及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析結(jié)果如圖2，在PpLCYb基因編碼的氨基酸序列上同樣存在著所有LCYb基因編碼的氨基酸序列所擁有的共同特征結(jié)構(gòu)域(第61～502位氨基酸)，這段特征結(jié)構(gòu)域?qū)儆赟DR超級(jí)家族。第89～453位氨基酸屬于番茄紅素環(huán)化酶蛋白特征編碼區(qū)，如LCYb和ε-環(huán)化酶等，其中第287～292位氨基酸存在著LCYb特征序列(LYAMPF)，第363～381位氨基酸為NAD(P)/FAD結(jié)合區(qū)。

2.2.3 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 采用BLAST軟件將PpLCYb基因編碼的氨基酸序列與已在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)表的其他植物物種LCYb氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果顯示(圖3)，PpLCYb與同屬薔薇目的草莓FaLCYb(gi|498663613)聚類于一個(gè)小分支內(nèi)，親緣性好，可信度高。

2.2.4 蛋白亞細(xì)胞定位與二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示PpLCYb蛋白定位在葉綠體上，但可信度僅為67%，后期仍需做進(jìn)一步的試驗(yàn)分析驗(yàn)證。二級(jí)構(gòu)件中α-螺旋元件占30.36%，無(wú)規(guī)則卷曲元件占58.93%，β-折疊元件占10.71%，其中無(wú)規(guī)則卷曲元件占主要比例，β-折疊元件占比較少，這與使用SWISS-MODEL服務(wù)器預(yù)測(cè)得到的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果基本吻合(圖4)。

2.3 PpLCYb基因在桃果實(shí)不同發(fā)育組織中的表達(dá)分析

由表1設(shè)計(jì)好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物所引發(fā)的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增效率為95%，處于90%～110%合理范圍區(qū)間，擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線在溫度為84.5 ℃時(shí)出現(xiàn)溶解單峰，擴(kuò)增特異性強(qiáng)，以上數(shù)據(jù)表明設(shè)計(jì)好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物可用于桃果實(shí)PpLCYb基因表達(dá)情況分析。在桃果實(shí)整個(gè)發(fā)育期間，PpLCYb基因無(wú)論在果實(shí)果皮還是果肉中均有表達(dá)(圖5)。隨著桃果實(shí)發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，PpLCYb基因在果實(shí)中的表達(dá)總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，并在果實(shí)處于硬熟期時(shí)達(dá)到較大值，隨后在完熟期略有下降，但在這個(gè)過(guò)程中，PpLCYb基因在果皮和果肉中的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果初步表明，PpLCYb基因的表達(dá)與果實(shí)發(fā)育成熟程度在果實(shí)發(fā)育前期(軟核期、硬核期、膨大期、硬熟期)是呈正相關(guān)的，PpLCYb基因可能誘導(dǎo)了桃果實(shí)的發(fā)育成熟。

a.蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) Protein functional domains prediction；b.基酸序列同源性比較 Homology comparison of putative amino acids’sequence

圖3 桃果實(shí)PpLCYb基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.3 Phylogenetic trees of PpLCYb gene

圖4 桃果實(shí)PpLCYb蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The deduced three-dimensional structure of PpLCYb protein

相同字母表示在0.05水平上差異不顯著 The same letter means non-significant difference at 0.05 levels

3 討 論

目前，已從與桃果實(shí)同屬薔薇目薔薇科的草莓(Fragariaxananassa)(NCBI搜索號(hào)：JN979375)、枇杷(Eriobotryajaponica)(NCBI搜索號(hào)：JX089591)、歐李(Prunushumilis)(NCBI搜索號(hào)：KR866276)、蘋(píng)果(Malusdomestica)(NCBI搜索號(hào)：KU508827)等果實(shí)中分離出LCYb基因全長(zhǎng)序列，它們長(zhǎng)度普遍處于1 650～1 900 bp之間，編碼495～505個(gè)氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)，植物中LCYb基因是一個(gè)大家族，不同物種中LCYb所編碼的氨基酸序列也有很大差異[10]，這種現(xiàn)象在本研究中也同樣存在，研究結(jié)果顯示不同植物物種LCYb所編碼的氨基酸序列N端差異性比較大(圖2)，這可能是不同植物進(jìn)化的結(jié)果。但盡管如此，靠近序列C端依然存在幾個(gè)高度保守區(qū)域，如所有植物L(fēng)CYb所固有的特征結(jié)構(gòu)域LYAMPF和NAD(P)/FAD結(jié)合區(qū)等，這些高度保守的結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為與酶的特異性催化功能密切相關(guān)[11-12]。本研究首次從桃果實(shí)中克隆得到PpLCYb基因全長(zhǎng)序列，長(zhǎng)度為1 699 bp，編碼504個(gè)氨基酸，氨基酸序列比對(duì)及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析顯示其上同樣存在著LCYb特征結(jié)構(gòu)域和NAD(P)/FAD結(jié)合域，這表明本研究的克隆分析結(jié)果客觀可信。

LCYb是控制類胡蘿卜素中間產(chǎn)物番茄紅素發(fā)生環(huán)化作用的重要限速酶，LCYb基因表達(dá)水平增高能加快β-胡蘿卜素或其他含有β環(huán)結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素的積累，LCYb基因表達(dá)水平降低則會(huì)導(dǎo)致番茄紅素的積累[13]。Ambrosio等[14]通過(guò)基因工程技術(shù)誘導(dǎo)番茄果實(shí)中LCYb基因進(jìn)行超量表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果實(shí)中大量積累β-胡蘿卜素。紅肉品種柑橘發(fā)育過(guò)程中，果實(shí)果皮和果肉中LCYb基因的表達(dá)水平較低，這可能與果實(shí)中番茄紅素的大量積累有關(guān)[15-17]。Wisutiamonkul等[18]研究發(fā)現(xiàn)在25 ℃貯藏條件下，‘Chanee’榴蓮果實(shí)總類胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和玉米黃素的含量與果實(shí)中LCYb基因的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。增強(qiáng)黃肉品種番木瓜中LCYb基因的表達(dá)，果實(shí)中番茄紅素含量一直保持較低的水平，而β-胡蘿卜素和β-隱黃素的含量則顯著增高，此外，抑制紅肉品種番木瓜中LCYb基因的表達(dá)，果實(shí)中番茄紅素含量持續(xù)增加，β-胡蘿卜素和β-隱黃素的含量則基本保持較低水平[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著桃果實(shí)發(fā)育成熟進(jìn)程的推進(jìn)，PpLCYb基因在果實(shí)中的表達(dá)逐漸增高并在果實(shí)發(fā)育處于硬核期時(shí)達(dá)到較大值，隨后在果實(shí)完熟期時(shí)略有下降。這表明PpLCYb基因的表達(dá)與果實(shí)發(fā)育成熟過(guò)程是基本上呈正相關(guān)的，PpLCYb基因可能參與到果實(shí)成熟過(guò)程中色澤品質(zhì)的調(diào)控環(huán)節(jié)，但具體分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)首次從桃果實(shí)中成功克隆PpLCYb基因，生物信息學(xué)分析結(jié)果與其他物種已報(bào)道的LCYb基因信息基本一致，但上述預(yù)測(cè)分析結(jié)果有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。PpLCYb基因的表達(dá)與果實(shí)的成熟程度基本呈正相關(guān)，數(shù)據(jù)表明其可能參與到類胡蘿卜素生物合成的調(diào)控過(guò)程中。以上結(jié)果可為后續(xù)PpLCYb蛋白功能鑒定、結(jié)構(gòu)分析以及桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中類胡蘿卜素的合成調(diào)控等試驗(yàn)研究提供一定的理論依據(jù)。