劉恒，李東明，朱蘭玉，賴樂錦，閆婉云，陸玉雙，韋伊，黃月琪，方媚，蘇元港，楊芳，舒?zhèn)?/p>

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利用CRISPR/Cas9敲除人源細(xì)胞系中基因的研究

劉恒1，李東明1，朱蘭玉1，賴樂錦1，閆婉云1，陸玉雙1，韋伊1，黃月琪1，方媚1，蘇元港1，楊芳2，舒?zhèn)?

1. 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳教研室，南寧 530021 2. 廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，桂林 541004

基因編碼A型和C型核纖層蛋白，參與細(xì)胞核核膜的組織，影響基因組穩(wěn)定性并對細(xì)胞分化產(chǎn)生影響。人類腫瘤中表達(dá)異常普遍存在，其突變造成多種核纖層蛋白病，如Emery-Dreifuss 肌營養(yǎng)不良癥(Emery-Dreifuss muscular dystrophy, EDMD)、擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)和兒童早老癥(Hutchinson-Gliford progeria syndrome, HGPS)等。為進(jìn)一步研究在細(xì)胞內(nèi)的功能，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對體外培養(yǎng)的293T與HepG2細(xì)胞株的基因進(jìn)行編輯，獲得兩株基因敲除(KO)的穩(wěn)定細(xì)胞系。與野生型相比，KO細(xì)胞系增殖能力相對減弱，凋亡增加。同時(shí)，細(xì)胞形態(tài)上也發(fā)生顯著改變，核膜凹凸不平。本研究首次報(bào)道了KO永生細(xì)胞系構(gòu)建和形態(tài)研究結(jié)果，為后續(xù)基因功能研究和致病突變體研究奠定基礎(chǔ)。

基因；CRISPR/Cas9；293T；HepG2；細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞核內(nèi)核膜的核纖層在維持核結(jié)構(gòu)和核穩(wěn)定方面起到關(guān)鍵作用，也影響到基因的組織和表達(dá)[1~3]。核纖層由5種中間纖維蛋白組成，包括A型核纖層蛋白(Lamin A)、C型核纖層蛋白(Lamin C)、B1型核纖層蛋白(Lamin B1)、B2型核纖層蛋白(Lamin B2)，以及核纖層相關(guān)蛋白。其中A型與C型核纖層蛋白由基因編碼表達(dá)，基因的功能包括支撐細(xì)胞核膜并調(diào)控核膜的分解與重構(gòu)，穩(wěn)固染色質(zhì)和核周轉(zhuǎn)錄因子，提供基因組需要的活動(dòng)場所，還參與細(xì)胞骨架到細(xì)胞核之間的信號傳導(dǎo)。此外，蛋白直接與核穩(wěn)定性和細(xì)胞可塑性相關(guān)[4]。最近的研究表明，核纖層蛋白在人類惡性腫瘤中異常表達(dá)[5,6]。在前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和胃癌中，研究人員發(fā)現(xiàn)核纖層蛋白表達(dá)下調(diào)，而且常常與預(yù)后不良有關(guān)[7]。在結(jié)直腸癌、前列腺癌和乳腺癌的研究報(bào)告中，Lamin A/C的表達(dá)變化與預(yù)后存在關(guān)聯(lián)[8]?；蛲蛔兣c十幾種退行性疾病有關(guān)，包括肌肉萎縮癥（如Emery-Dreyfus肌肉萎縮癥，EDMD)、外周神經(jīng)病變（如 Charcot-Marie-牙病2B1型, CMT2B1)、脂肪代謝障礙、兒童早老綜合征（如Hutchinson–Gilford早老綜合征，HGPS)，此外還有非典型沃納綜合征(Atypical Werner syndrome, AWS)、硬皮病(restrictive dermopathy, RD)[9~12]等。基因的不同突變能導(dǎo)致同種類型的疾病，而且同一堿基的不同替換也會導(dǎo)致不同的疾病，同樣的突變在一些個(gè)體會導(dǎo)致疾病，一些個(gè)體卻不會有臨床癥狀，這些都表明了功能復(fù)雜而多樣[13,14]。人們對于核纖層蛋白病中的基因型和表型之間的聯(lián)系不甚了解，對基因的生物學(xué)功能也有待進(jìn)一步研究。

Lamin A和C是由基因選擇性剪切產(chǎn)生，位于細(xì)胞核內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，主要在已分化細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[15]。Lamin C是由基因在第10號外顯子選擇性剪切產(chǎn)生，與Lamin A功能類似，共同在細(xì)胞核膜結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用[16]。為研究基因在細(xì)胞內(nèi)的功能，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對不同來源的體外培養(yǎng)細(xì)胞(293T和HepG2)中進(jìn)行基因編輯，通過敲除基因使Lamin A/C都不表達(dá)，并對敲除后細(xì)胞系的形態(tài)和增殖情況進(jìn)行了觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

293T與HepG2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；PX459質(zhì)粒購自美國Addgene公司。

1.2 gRNA設(shè)計(jì)與合成

利用美國麻省理工學(xué)院 CRISPR Design 軟件(http://crispr.mit.edu/)進(jìn)行g(shù)RNA的設(shè)計(jì)，然后用NCBI的Primer-Blast對所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行驗(yàn)證。一共設(shè)計(jì)4條gRNA，如表1所示。gRNA合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)完成。

1.3 載體構(gòu)建

將合成的gRNA正義鏈和反義鏈進(jìn)行復(fù)性處理形成雙鏈，反應(yīng)體系為正、反義鏈各1 μL，T4連接酶緩沖液(10×) 1 μL，T4多核苷酸激酶(PNK) 0.5 μL，雙蒸水6.5 μL，95℃ 5 min，自然冷卻至16℃保存10 min。然后利用Ⅰ內(nèi)切酶對PX4594℃條件下剪切過夜，電泳切膠回收剪切后的質(zhì)粒。將寡核苷酸雙鏈與剪切后質(zhì)粒用T4連接酶進(jìn)行重組。反應(yīng)體系為：PX459質(zhì)粒 50 ng，寡核苷酸雙鏈2 μL，T4連接酶1.5 μL，T4連接酶緩沖液1.5 μL，雙蒸水補(bǔ)至15 μL。反應(yīng)程序：16℃連接10 min后，4℃靜置過夜。將重組后的載體懸液產(chǎn)物5~10 μL加入到50 μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻后冰浴30 min，42℃熱激90 s，冰上靜置2 min，然后直接涂于氨芐抗性的LB平板。37℃培養(yǎng)箱過夜后挑3~5個(gè)白色菌落搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序引物為：上游引物5′-GAGGGCCTATTTCCCATGAT- 3′，下游引物5′-GGGCGTACTTGGCATATGAT-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)合成。

表1 靶向人源LMNA基因敲除的gRNA序列

FO與RO分別為gRNA的正義鏈與反義鏈。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在6孔板中每孔加入2×106個(gè)細(xì)胞，12 h后PBS清洗兩次；將脂質(zhì)體(Lipofectamine 3000 Transfection reagent，美國Invitrogen) 10 μL與250 μL無血清培養(yǎng)基混勻，室溫放置5 min，同時(shí)把5 μg重組質(zhì)粒與250 μL無血清培養(yǎng)基混勻，室溫靜置5 min；然后將兩種液體混勻，室溫靜置20 min，最后加入培養(yǎng)孔。在轉(zhuǎn)染6~8 h后換完全培養(yǎng)基，24 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，并加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選(293T的工作濃度為2.0 ug/mL，HepG2的工作濃度為1.5 μg/mL)。

1.5 單克隆測序分析

在嘌呤霉素篩選3天后，用胰酶把細(xì)胞消化下來，利用有限稀釋法稀釋細(xì)胞至每1個(gè)/100 μL，然后在96孔板的每孔中加入100 μL細(xì)胞懸液，顯微鏡觀察之后將只有單個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔做好標(biāo)記；培養(yǎng)五天后更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞鋪板80%以上消化細(xì)胞，一半提取DNA測序驗(yàn)證，一半細(xì)胞換六孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。

收集單克隆細(xì)胞，在提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為：DNA 100 ng，上下游引物各0.2 μL，2× Taq mastermix 25 μL，雙蒸水補(bǔ)至50 μL；取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠，100 V、25 min電泳，得到目的條帶后，剩余PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測序。由于HepG2 gRNA的設(shè)計(jì)位點(diǎn)(PX-459-gRNA1和PX- 459-gRNA2)與293T gRNA的設(shè)計(jì)位點(diǎn)(PX-459- gRNA3和PX-459-gRNA4)不同，所以設(shè)計(jì)了2對不同的的引物。其中Primer1用于293T細(xì)胞，Primer2用于HepG2細(xì)胞?；蚪M測序引物如表2所示。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)合成。PCR產(chǎn)物電泳切膠回收，在微量離心管中加入T載體1 μL (50 ng)，加入等摩爾數(shù)PCR產(chǎn)物；加入含ATP的10× Buffer 1 μL，T4 DNA連接酶合適單位，用雙蒸水補(bǔ)足至10 μL；低速離心，4℃連接過夜；轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選并菌落PCR測序。

1.6 免疫熒光檢測

將細(xì)胞爬片用PBS浸洗；用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，然后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min；再使用0.5% Triton X-100 (PBS配制)室溫通透20 min；PBS浸洗玻片后用吸水紙吸干PBS，用5%脫脂奶粉(PBST)室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液之后用稀釋一抗(Lamin B, AF0219購自中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin, ab8226購自美國Abcam公司) 4℃孵育過夜；然后用PBST浸洗爬片，吸水紙吸干后滴加熒光二抗，室溫孵育孵育1 h后用PBST浸洗爬片3次，每次3 min；最后用熒光顯微鏡觀察。

表2 LMNA基因敲除位點(diǎn)的測序引物序列

Primer1用于293T細(xì)胞；Primer2用于HepG2細(xì)胞。F為正義鏈，R為反義鏈。

1.7 蛋白免疫印記檢測

293T與HepG2的野生型和KO型細(xì)胞六孔板鋪板24 h后，RIPA裂解液(加pmsf)裂解細(xì)胞收集蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜。封閉后，相應(yīng)一抗(Lamin A，ab8089和Lamin C，ab106682均購自美國Abcam公司) 4℃孵育過夜，二抗室溫1 h。凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

把293T與HepG2的野生型和KO型細(xì)胞胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，在96孔板種板中每孔加入1500個(gè)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；18 h后加入Cell Counting Kit-8，1 h后酶標(biāo)儀450 nm測吸光度，每種細(xì)胞測3個(gè)孔，取平均值。每隔一天測一次吸光度，直到其中一種細(xì)胞鋪板達(dá)70%以上就停止細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

1.9 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

用無EDTA胰酶消化細(xì)胞長滿50%~75%狀態(tài)良好的293T與HepG2的野生型和KO型細(xì)胞，PBS清洗之后1000 r/min 3 min收集細(xì)胞。利用Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒染色，避光孵育10 min后用流式細(xì)胞儀檢測。

1.10 掃描電鏡觀察

收集離心細(xì)胞后，用3%戊二醛在4℃固定2 h后0.1 mmol/L PPS緩沖液4℃下浸泡清洗3次，每次10 min；然后用四氧化鋨在4℃固定1 h，再用0.1 mmol/L PPS緩沖液4℃下浸泡清洗3次，每次15 min；依次從50%、70%、80%、90%、100% (3次)的乙醇濃度浸泡脫水，每次15 min；再使用100%六甲基二硅胺烷浸泡3次，每次10 min，然后放入真空干燥器抽真空干燥；粘樣本到樣本座，IB3 (IB5)離子濺射儀噴鍍后放入電鏡(VEGA 3 LMU型，捷克TESCAN公司)觀察。

1.11 透射電鏡觀察

收集離心細(xì)胞，用3%戊二醛在4℃固定2 h；0.1 mmol/LPPS緩沖液4℃下浸泡清洗3次，每次10 min；用四氧化鋨在4℃固定1 h；0.1 mmol/LPPS 緩沖液4℃下浸泡清洗3次，每次15 min；乙醇濃度依次從50%、70%、80%、90%、1∶1 (90%乙醇∶90%丙酮)、90%丙酮、100%丙酮(3次)浸泡脫水,每次15 min；1∶1(丙酮∶包埋劑)室溫滲透1 h，純包埋劑室溫浸透2 h；環(huán)氧樹脂包埋；依次從35℃ 15 h，45℃ 12 h，60℃ 24 h聚合；在修塊、超薄切片與染色之后，利用電鏡(H-7650型，日本HTACHI公司)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 PX-459-gRNA(LMNA)重組質(zhì)粒構(gòu)建和單克隆測序分析

設(shè)計(jì)并合成gRNA后，把gRNA與PX459載體連接。PX459具有嘌呤霉素抗性，方便于之后的的細(xì)胞單克隆篩選。在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒與挑純之后，提取單克隆細(xì)胞的DNA，擴(kuò)增gRNA兩側(cè)400 bp左右序列，測序結(jié)果顯示在gRNA附近位點(diǎn)開始出現(xiàn)雜峰，經(jīng)人工比對后，雜峰中不存在原始序列，說明成功的剪切了293T和HepG2的兩個(gè)等位基因。然后我們利用TA克隆測序法驗(yàn)證得出兩株細(xì)胞的等位都缺失若干堿基(圖1A)。將測序結(jié)果與全基因序列進(jìn)行比對后，發(fā)現(xiàn)293T單克隆細(xì)胞株在等位基因分別缺失40和42個(gè)堿基，HepG2單克隆細(xì)胞株在等位基因分別缺失35和39個(gè)堿基(圖1B)。

2.2 敲除細(xì)胞內(nèi)LMNA基因表達(dá)分析

LMNA基因共有12個(gè)外顯子，選擇性剪切編碼Lamin A和Lamin C蛋白。Lamin A 由1-12號外顯子編碼，Lamin C由1~10號外顯子編碼(圖2A)。PX-459-gRNA1和PX-459-gRNA2(用于HepG2)的識別位點(diǎn)位于第9號外顯子；PX-459-gRNA3和PX- 459-gRNA4 (用于293T)的識別位點(diǎn)在第7號外顯子。Lamin A蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，293T KO和HepG2 KO不表達(dá)Lamin A (圖2B)。免疫熒光技術(shù)分析結(jié)果顯示，低倍鏡下293T KO和HepG2 KO細(xì)胞 Lamin A (綠色)未見熒光信號(圖2C)。上述兩個(gè)結(jié)果顯示，利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功獲得了敲除基因293T與HepG2細(xì)胞株。同時(shí)，Lamin C蛋白免疫印跡結(jié)果顯示兩株KO細(xì)胞也不能表達(dá)Lamin C (圖2D)。

圖1 LMNA基因敲除單克隆細(xì)胞株的TA克隆測序鑒定

A：陽性單克隆細(xì)胞的鑒定。黑色箭頭指示為CRISPR/Cas9系統(tǒng)開始剪切的位點(diǎn)。B：陽性克隆序列與全基因序列對比。序列比對顯示在gRNA處剪切，293T的等位基因分別缺失40和42個(gè)堿基，HepG2的等位基因分別缺失35和39個(gè)堿基。KO為敲除細(xì)胞。

圖2 LMNA基因敲除細(xì)胞內(nèi)Lamin A和Lamin C表達(dá)分析

A：與敲除細(xì)胞株剪切位點(diǎn)示意圖。兩株敲除細(xì)胞系的剪切位點(diǎn)都位于LMNC選擇性剪切位點(diǎn)之前。B：Lamin A的蛋白免疫印跡。C：敲除后細(xì)胞的免疫熒光比較（400×）。藍(lán)色為DAPI，綠色為Lamin A，紅色為Lamin B。D：Lamin C的蛋白免疫印跡。WT為野生型細(xì)胞，KO為敲除細(xì)胞。

2.3 LMNA基因敲除后對細(xì)胞增殖和凋亡的影響

CCK-8分析結(jié)果顯示，基因敲除之后293T和HepG2兩株細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制(圖3A)，其中對肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制更為明顯。同時(shí)，利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測，Lamin A敲除后，兩株細(xì)胞的凋亡率都顯著上升(圖3：B, C)。

2.4 LMNA基因敲除后細(xì)胞核和細(xì)胞整體形態(tài)的變化

基因敲除后，與野生型對比，光鏡下觀察這兩株細(xì)胞形態(tài)上發(fā)生了明顯改變(圖4A)。293T野生型細(xì)胞有3~4個(gè)突出，在敲除后，293T細(xì)胞胞體變小變圓，突出連接減少變細(xì)；HepG2野生型為長梭型，細(xì)胞核在正中突出，胞質(zhì)主要分布在細(xì)胞的梭型兩端，Lamin A敲除后，細(xì)胞變成多邊形，胞質(zhì)較為均勻的分布在核周。DAPI染色后，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核發(fā)生核凹陷、核畸形等改變(圖4B)。

圖3 LMNA敲除細(xì)胞株和野生細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力和凋亡比較

A：細(xì)胞增殖曲線。敲除后細(xì)胞增殖能力都明顯下降(=3)。B：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果。敲除后細(xì)胞凋亡率都顯著上升，F(xiàn)L1-H為綠光通道(Annexin V-FITC)，F(xiàn)L3-H為紅光通道(PI)。C：細(xì)胞凋亡的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(<0.05,=3)。293T WT為293T野生型細(xì)胞，293T KO為293T基因敲除細(xì)胞，HepG2 WT為HepG2野生型細(xì)胞，HepG2 KO為HepG2基因敲除細(xì)胞。

圖4 LMNA基因敲除后細(xì)胞核和細(xì)胞整體形態(tài)的變化

A：普通光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)。敲除后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。B：DAPI染色后的細(xì)胞核形態(tài)未觀察到顯著差異。C：掃描電鏡下的細(xì)胞形態(tài)。D：透射電鏡下的細(xì)胞核形態(tài)。與野生型對比，KO細(xì)胞核膜凹凸不平WT為野生型細(xì)胞，KO為敲除細(xì)胞。

為了更清楚的觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，利用掃描電鏡把細(xì)胞放大3000倍(圖4C)，形態(tài)差異更為顯著；利用透射電鏡將細(xì)胞膜放大15 000倍，發(fā)現(xiàn)KO細(xì)胞的核膜變得凹凸不平(圖4D)。通過免疫熒光技術(shù)對細(xì)胞骨架(β-actin)進(jìn)行染色，油鏡下也觀察到相同的形態(tài)變化(圖5)。

3 討論

本文首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功敲除293T和HepG2的基因。雖然敲除小鼠早有報(bào)道[17]，研究人員也獲得了敲除小鼠來源的體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞系[18]，但人源基因敲除的細(xì)胞系未見報(bào)道。本研究構(gòu)建的人源基因敲除細(xì)胞系為進(jìn)一步基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

基因不同突變會導(dǎo)致多種疾病，這與核纖層蛋白所發(fā)揮的多種細(xì)胞功能相一致[9,19,20]。核纖層蛋白病是人類疾病中最耐人尋味的退行性疾病之一，基因型與表型之間的關(guān)系仍然不甚清楚[21,22]。有趣的是，盡管核纖層蛋白普遍表達(dá)，但在每一種核纖層蛋白病中，只有一種或幾種組織受到損害，為了解釋這個(gè)復(fù)雜的謎題，研究人員常常構(gòu)建不同的基因突變體(G608G，R527C和H222P突變等)，然后在不同體外培養(yǎng)細(xì)胞系中研究突變體的功能[23]。然而，較多的突變體，尤其是隱性遺傳的致病突變體，往往在有內(nèi)源性Lamin A和Lamin C存在的情況下，很難觀察到突變體對細(xì)胞的影響。本研究構(gòu)建的敲除細(xì)胞系可以避免內(nèi)源性Lamin A和Lamin C對突變體功能研究的影響，是很好的研究隱性遺傳的致病突變體的材料。

圖5 免疫熒光技術(shù)染色微絲觀察LMNA敲除后細(xì)胞形態(tài)的改變

敲除后細(xì)胞骨架微絲的改變更為明顯，藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核，綠色為β-actin 293T WT為293T野生型細(xì)胞，293T KO為293T基因敲除細(xì)胞，HepG2 WT為HepG2野生型細(xì)胞，HepG2 KO為HepG2基因敲除細(xì)胞。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)作為新一代基因編輯技術(shù)，盡管具有設(shè)計(jì)簡單，操作方便，效率高，成本低并且可同時(shí)進(jìn)行多點(diǎn)編輯等優(yōu)勢，但也存在敲除效率不高的問題[24,25]。有研究顯示，CRISPR/ Cas9系統(tǒng)導(dǎo)致的DNA雙鏈斷裂通過同源重組介導(dǎo)的DNA修復(fù)后剪切成功比例常不足10%[26~28]。前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)兩條位點(diǎn)相近的gRNA共同轉(zhuǎn)染能顯著提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的雙等位基因敲除效率。

在本研究中，構(gòu)建的兩株KO細(xì)胞株與野生型細(xì)胞相比增殖能力都明顯下降，其中肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力下降更為顯著，這說明對腫瘤增殖十分重要。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，我們發(fā)現(xiàn)，KO之后兩株細(xì)胞的凋亡情況也大幅上升。雖然使用兩株細(xì)胞特性差異較大的細(xì)胞系，293T為胚腎來源，HepG2為肝腫瘤來源。但是在增殖，凋亡與形態(tài)上的改變都類似效應(yīng)(圖3)。值得一提的是，高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系HepG2，敲除后其增殖和凋亡變化較為顯著。較多的臨床樣本研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的基因在多種腫瘤中異常表達(dá)[29,30]，但異常表達(dá)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義未知，本研究觀察到KO對腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡都有顯著影響，這是否與腫瘤的致瘤性相關(guān)有待進(jìn)一步研究。

文獻(xiàn)報(bào)道在Lamin A缺失的小鼠成纖維細(xì)胞中，微管組織中心(MTOC)就會壓迫細(xì)胞核，形成較多變形的凹型/新月形細(xì)胞核[31]。該文獻(xiàn)提出假說，細(xì)胞核與MTOC相互有一個(gè)作用力，只有當(dāng)這個(gè)力度平衡時(shí)，細(xì)胞核才能維持正常形態(tài)[32]。而核纖層蛋白正是細(xì)胞核的這種作用力的提供者之一[33]。有趣的是，本研究獲得的兩株基因敲除細(xì)胞系，卻并未發(fā)現(xiàn)明顯的核凹陷變形(圖4和圖5)。而只有通過透射電鏡才發(fā)現(xiàn)核膜由平整光滑變得凹凸不平(圖5)。本研究中使用的體外培養(yǎng)的永生化細(xì)胞系與文獻(xiàn)報(bào)道中使用的原代培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞不同，由此推測，可能是由于在Lamin A減少或者缺失時(shí)，Lamin B的表達(dá)相對會增加，而體外培養(yǎng)的永生化細(xì)胞內(nèi)Lamin B的表達(dá)大大增加[34]正好調(diào)整了這種失衡。

本研究發(fā)現(xiàn)兩株KO細(xì)胞與野生型相比形態(tài)發(fā)生明顯改變(圖4)。編碼核纖層蛋白Lamin A/C，為細(xì)胞核提供結(jié)構(gòu)支持。表達(dá)水平與核剛度、組織的硬度和可塑性直接相關(guān)[5, 35,36]。核剛度對于細(xì)胞的生存能力和維持分化細(xì)胞的功能都很重要，尤其是在肌肉和皮膚等承受強(qiáng)烈機(jī)械張力的組織中[36,37]。

綜上所述，基因功能與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)，也影響細(xì)胞骨架的分布。本研究成功獲得兩株體外培養(yǎng)的KO細(xì)胞，為將來研究基因在肝腫瘤中的作用奠定基礎(chǔ)；也為研究中隱性致病突變是如何對不同細(xì)胞產(chǎn)生影響，以及這些突變體如何導(dǎo)致細(xì)胞功能的改變提供實(shí)驗(yàn)材料。

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Research on the knockout ofgene by CRISPR/Cas9 system in human cell lines

Heng Liu1, Dongming Li1, Lanyu Zhu1, Lejin Lai1, Wanyun Yan1, Yushuang Lu1, Yi Wei1, Yueqi Huang1, Mei Fang1, Yuangang Su1, Fang Yang2, Wei Shu1

Thegene encodes the nuclear Lamin A and Lamin C proteins, and is related to nuclear membrane organization, genome stability and cell differentiation. Abnormal expression ofis ubiquitous in human tumors, and its mutation leads to various forms of laminopathies, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD), dilated cardiomyopathy (DCM), and Hutchinson-Gliford progeria syndrome (HGPS). To further determine the functions of thegene in cellular physiology, the present study used the CRISPR/Cas9 technique to edit thegene of 293T and HepG2 cells, which resulted in two stablegene knockout (KO) cell lines. Compared to the respective wild type cells, theKO cell lines showed decrease in proliferation ability, increase in apoptosis, alteration in cellular morphology and uneven structures in the nucleus membrane. In this study, we report for the first time the results on the construction ofKO immortalized cell lines and characterization of their morphological changes, thereby laying the foundation for the further studies of thegene functions and pathogenic mutations.

gene; CRISPR/Cas9; 293T; HepG2; cell morphology

2018-09-13;

2018-11-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31660311)和廣西醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(編號：201710598055)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31660311) and Guangxi Medical University Innovation and Entrepreneurship Project (No. 201710598055)]

劉恒，碩士研究生，專業(yè)方向：分子生物學(xué)與生物化學(xué)。E-mail: 240627592@QQ.com

李東明，碩士研究生，專業(yè)方向：分子生物與生物化學(xué)。E-mail: abcd.1456@163.com

劉恒和李東明并列第一作者。

舒?zhèn)ィ┦?，副教授，研究方向：分子遺傳。E-mail: shuwei7866@126.com

10.16288/j.yczz.18-146

2018/12/6 11:18:49

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20181206.1118.004.html

(責(zé)任編委: 谷峰)