趙小雙,楊海波,趙蔭濤,劉 源

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052

心室重構(gòu)是引起心力衰竭的主要機(jī)制之一，貫穿整個(gè)心力衰竭的發(fā)展。在心室重構(gòu)的演化過(guò)程中，心肌細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號(hào)通路被激活并轉(zhuǎn)錄入核，誘導(dǎo)相關(guān)的下游炎癥因子(IL-6、IL-1等)的轉(zhuǎn)錄及翻譯，進(jìn)而加速心肌細(xì)胞凋亡、間質(zhì)纖維化。而細(xì)胞凋亡在心室重構(gòu)晚期發(fā)揮著不可或缺的角色，極大地促進(jìn)心室重構(gòu)的發(fā)生及發(fā)展，因此抑制細(xì)胞凋亡可有效地逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的進(jìn)展[1]。但目前臨床尚無(wú)特異性抑制心肌細(xì)胞凋亡的靶向藥物，因此尋找可有效地逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的靶向藥物顯得尤為重要。山奈酚歸屬于黃酮類化合物，主要存在于姜科植物山奈的根莖，也可見于各種水果、蔬菜中。有研究[2-3]結(jié)果提示，其具有防癌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用。還有研究[4]結(jié)果顯示，山奈酚具有抗心肌細(xì)胞肥大及間質(zhì)纖維化的作用，但其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用尚不明確。因此本研究就山奈酚對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用做進(jìn)一步的探討，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料與儀器山奈酚購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司(貨號(hào)520-18-3，分子式C15H10O6，純度>99.9%，檢測(cè)途徑為高效液相色譜法)。取7.16 mg山奈酚溶解于1 mL DMSO中配制成實(shí)驗(yàn)所用的母液(25 mmol/L)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中DMSO在培養(yǎng)液中的體積分?jǐn)?shù)低于0.02%。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、新生小牛血清、雙抗(PS)、CCK-8試劑盒均購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司， DAPI購(gòu)自ThermoFisher公司，抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，LPS購(gòu)自Sigma公司。恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自日本Sanyo公司，DP72倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)Synergy HT購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)大鼠H9c2細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)基成分為：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清+體積分?jǐn)?shù)1% PS。細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞鋪滿80%的培養(yǎng)皿底(密度2×105個(gè)/mL)時(shí)，采用2.5 g/L胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代。在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理之前，將培養(yǎng)細(xì)胞所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+體積分?jǐn)?shù)0.5% PS)，接著饑餓處理18 h，饑餓處理可減少血清對(duì)刺激因素的影響，同時(shí)可使所有細(xì)胞處于同步化。

1.3細(xì)胞活性檢測(cè)采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分為2組：山奈酚組(0、5、25、50 μmol/L山奈酚處理組)和LPS+山奈酚組(10 mg/L LPS+0、5、25、50 μmol/L山奈酚處理組)，另設(shè)只加培養(yǎng)基和CCK-8溶液的空白對(duì)照、只加細(xì)胞和CCK-8溶液的陰性對(duì)照。首先將細(xì)胞接種到96孔板中，為提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性需保證每孔100 μL，且密度約維持在2×105個(gè)/mL，然后置于溫箱連續(xù)培養(yǎng)24 h，再用無(wú)血清培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，進(jìn)行18 h的饑餓處置，最后采用不同濃度山奈酚和(或)LPS處理12 h，將96孔板中的培養(yǎng)基再次換為含有10 μL CCK-8的無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL，在恒溫箱中繼續(xù)孵育2.0～2.5 h后，將其置于酶標(biāo)儀下(波長(zhǎng)450 nm)分別檢測(cè)每孔的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力=[(藥物組A值-空白對(duì)照A值)/(陰性對(duì)照A值-空白對(duì)照A值)]×100%，繪制曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞凋亡的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照、單加10 mg/L LPS和10 mg/L LPS+50 μmol/L山奈酚。培養(yǎng)細(xì)胞在胰蛋白酶消化后調(diào)整密度為1×105個(gè)/mL，制作細(xì)胞爬行片，并進(jìn)行饑餓培養(yǎng)18 h，后加入不同濃度山奈酚和(或)LPS處理細(xì)胞12 h，用PBS漂洗3次，再用10 g/L多聚甲醛進(jìn)行固定10 min，接著用體積比2∶1乙醇/乙酸混合液在-20 ℃恒溫下固定5 min，再次用PBS清洗3 min。加入平衡液室溫下孵育10 s后滴加TdT酶工作液，37 ℃孵育1 h。加入工作液振蕩15 s后孵育10 min，PBS洗3次，吸干液體，滴加Anti-Digoxigenin Fluorescein工作液，進(jìn)行避光孵育約30 min，PBS再洗3次，DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。正常的細(xì)胞核可被染為藍(lán)色，而凋亡的細(xì)胞核則被染為綠色，每組選擇8個(gè)視野(×400)，記錄凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次，取其平均值。

1.5Westernblot檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為5組：對(duì)照、單加10 mg/L LPS、10 mg/L LPS+5 μmol/L山奈酚、10 mg/L LPS+25 μmol/L山奈酚、10 mg/L LPS+50 μmol/L山奈酚。在冰上裂解細(xì)胞10 min，然后將其置于1.5 mL離心管中，超聲裂解儀5 kHz進(jìn)行10～15 s的裂解，4 ℃ 12 000×g離心15 min，上清液移至離心管中，BCA定量檢測(cè)蛋白濃度并加入相同質(zhì)量的蛋白于200 mL EP中進(jìn)行高溫變性。在每組樣本混合均勻后取10 μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將GAPDH設(shè)置為內(nèi)參，然后依據(jù)各樣本的光密度值逐個(gè)調(diào)整上樣劑量，再次對(duì)調(diào)整后的上樣劑量進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，使各樣本間GAPDH的光密度值無(wú)差異，緊接著對(duì)每組以校正后的上樣劑量分別進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，將蛋白以200 mA、90 min的參數(shù)移到PVDF膜上，并使用一抗封閉液進(jìn)行封閉12 h，其中一抗包括p-Iκbα、p-P65、cleaved Caspase(c-Caspase)-8、P65、c-Caspase-3、Iκbα、c-Caspase-9，封閉12 h后使用TBST清洗3次，接著放入對(duì)應(yīng)的加有二抗的稀釋液中進(jìn)行避光孵育1 h，其中二抗為山羊抗兔IgG抗體，孵育結(jié)束后再用TBST清洗3次，并將其放入Amersham Imager 600超靈敏多功能成像儀中檢測(cè)目的條帶，同時(shí)應(yīng)用Gel-Pro Application圖像分析軟件檢測(cè)各組蛋白的光密度值，以代表其蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同組間細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量及TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1山奈酚對(duì)H9c2細(xì)胞活性的影響結(jié)果見圖1。

2.2山奈酚對(duì)LPS誘導(dǎo)下H9c2細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果見圖2、表1。

圖1 山奈酚對(duì)H9c2細(xì)胞活性的影響

A:對(duì)照組；B:LPS組；C：LPS+山奈酚組

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較 %

F=412.690，P<0.001；*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與LPS組比較，P<0.05

2.3山奈酚對(duì)LPS誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖3、表2?？芍?，LPS可提高c-Caspase-8、c-Caspase-9、c-Caspase-3蛋白表達(dá)水平，不同濃度山奈酚可抑制上述凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1：對(duì)照組；2：LPS組；3：LPS+5 μmol/L山奈酚組；4：LPS+25 μmol/L山奈酚組；5：LPS+50 μmol/L山奈酚組

圖3 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與LPS組比較，P<0.05

2.4山奈酚對(duì)LPS誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖4、表3?？芍煌瑵舛壬侥畏涌梢种芁PS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。

1：對(duì)照組；2：LPS組；3：LPS+5 μmol/L山奈酚組；4：LPS+25 μmol/L山奈酚組；5：LPS+50 μmol/L山奈酚組

圖4 各組細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與LPS組比較，P<0.05

3 討論

該研究結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，山奈酚可明顯改善LPS引起的H9c2細(xì)胞活性降低，減少凋亡的發(fā)生，并且這種效應(yīng)可能是通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化從而發(fā)揮作用的，提示山奈酚可發(fā)揮抗心肌細(xì)胞炎癥的作用，為臨床治療心肌炎提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。有研究[5-6]證實(shí)，LPS可直接作用于心肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α等炎性因子，這些炎性因子可刺激心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)可作用于成纖維細(xì)胞誘發(fā)心肌纖維化,從而加重心功能不全，在心肌損傷到心力衰竭的疾病進(jìn)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。因此，如果能抑制LPS引起的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)及凋亡，則可明顯改善并預(yù)防心功能不全，從而改善患者的生存預(yù)后和生活質(zhì)量。

山奈酚歸屬黃酮類化合物，主要存在于姜科植物山柰的根莖，也可見于各種水果、蔬菜中，生活中多食用富含山奈酚的食物可降低多種疾病的發(fā)病率，其具有抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化、抗菌的功效。既往研究顯示，其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化[7]、改善內(nèi)皮功能作用，亦能改善體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷[8]以及阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷[9]。但山奈酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的作用國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道，因此作者選擇了山奈酚作為一種新的抗心肌炎癥藥物進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

既往研究[10-13]顯示，心肌細(xì)胞凋亡在心血管疾病(心肌炎、缺血再灌注損傷、糖尿病心肌病、心力衰竭等)發(fā)展的不同階段扮演不同的角色，在疾病早期可發(fā)揮一定的代償作用，但隨著疾病的進(jìn)展，心肌細(xì)胞凋亡增多，可促進(jìn)疾病的進(jìn)展。心肌細(xì)胞在受到長(zhǎng)期持續(xù)的炎癥刺激后，細(xì)胞凋亡增多，誘發(fā)心室重構(gòu)并發(fā)生類似擴(kuò)張型心肌病樣改變。因此，降低心肌細(xì)胞凋亡率可有效地抑制心室重構(gòu)，改善心室重構(gòu)的發(fā)生及發(fā)展。該研究結(jié)果顯示，細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同干預(yù)因素處理12 h后，對(duì)照組凋亡率為(6.7±0.9)%；LPS組可顯著增加H9c2細(xì)胞的凋亡率[(41.2±4.7)%]；LPS+山奈酚組的凋亡率則降低為(10.0±1.3)%?？梢姡侥畏涌娠@著降低LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率，提示山奈酚具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，進(jìn)而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。

作者進(jìn)一步研究了山奈酚發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。NF-κB是一類經(jīng)典的炎癥信號(hào)分子，在心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的病理過(guò)程中，NF-κB持續(xù)活化可介導(dǎo)炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，炎癥因子又可作用于細(xì)胞膜本身的炎性因子受體，從而誘導(dǎo)內(nèi)源性及外源性凋亡通路的活化發(fā)揮促凋亡作用[14-15]。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)山奈酚可顯著抑制TLR4蛋白的表達(dá)，抑制Iκbα及P65的磷酸化，從而抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位。因此，山奈酚可能是通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路從而發(fā)揮抗H9c2細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)山奈酚可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路從而發(fā)揮抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，為山奈酚的臨床應(yīng)用提供了一定的證據(jù)。