楊蕊萍，鐘 武

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，四川 瀘州 646000)

膿毒癥是機(jī)體對感染反應(yīng)失調(diào)的一系列全身炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重時可導(dǎo)致器官功能障礙或循環(huán)衰竭，也是誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征的重要原因[1-3]。膿毒癥早期機(jī)體呈現(xiàn)出一種促炎狀態(tài)，主要表現(xiàn)為過量炎性因子、促炎介質(zhì)的釋放及大量炎性細(xì)胞的激活，晚期由于免疫細(xì)胞的凋亡及炎性介質(zhì)的耗竭，機(jī)體表現(xiàn)為免疫抑制狀態(tài)[4-5]。單核/巨噬細(xì)胞在膿毒癥中不僅參與非特異性免疫監(jiān)視和防御作用，還發(fā)揮抗原提呈作用，并產(chǎn)生大量細(xì)胞因子激活其他免疫細(xì)胞。巨噬細(xì)胞主要可極化為經(jīng)典活化的M1型和選擇性活化的M2型2種類型。M1型巨噬細(xì)胞主要參與免疫應(yīng)答，發(fā)揮促炎作用，M2型巨噬細(xì)胞則以抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)為主[6]。目前，對膿毒癥的早期診斷及規(guī)范的治療使患者的急性期存活率有所提高，但遠(yuǎn)期效果尚不理想，病死率仍居高不下[7]。本研究旨在篩選巨噬細(xì)胞極化差異基因，尋找調(diào)節(jié)膿毒癥炎癥反應(yīng)的潛在治療靶點(diǎn)，提高膿毒癥患者的生存率，改善預(yù)后。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源從綜合性基因表達(dá)(gene expression omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫選取GSE5099和GSE57614 2套基因芯片數(shù)據(jù)集，其中GSE5099種屬為人，芯片平臺為GPL96[HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array、GPL97[HG-U133B] Affymetrix Human Genome U133B Array，選取其中的M1型、M2型巨噬細(xì)胞樣本各3例。選取條件：γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作用于巨噬細(xì)胞后將其極化為M1型，白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)作用于巨噬細(xì)胞后將其極化為M2型。GSE57614種屬為人，芯片平臺為GPL6480Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F (Probe Name version)，選取其中M1型、M2型巨噬細(xì)胞樣本各9例，選取條件同GSE5099基因芯片。

1.2差異表達(dá)基因的篩選2個基因芯片的原始數(shù)據(jù)采用GEO2R在線分析軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行分析，以P<0.01的條件篩選出相關(guān)差異基因，再將2組基因芯片篩選出的差異基因取交集，得到最終的差異基因。

1.3差異基因的功能富集分析DAVID(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，網(wǎng)址：https://david.ncifcrf.gov/)是一款在線基因功能分析軟件，能對大規(guī)模的基因信息進(jìn)行處理分析。將篩選出的差異基因提交至該網(wǎng)站，通過進(jìn)行GO (Gene Ontology)分析及KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析，對差異基因進(jìn)行富集統(tǒng)計(jì)，找出差異基因主要富集的生物學(xué)進(jìn)程或細(xì)胞通路，從而找到可能與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的生物學(xué)功能及通路。差異基因顯著性富集的臨界值為P<0.05。

1.4蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建STRING (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，網(wǎng)址：https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫是一個在線分析蛋白質(zhì)的功能及活動形式，反映蛋白質(zhì)之間的相互作用，構(gòu)建蛋白質(zhì)之間交互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫。通過蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)，不僅可以系統(tǒng)地了解蛋白質(zhì)的功能及相互作用，還能依據(jù)交互網(wǎng)絡(luò)中蛋白質(zhì)的模塊化屬性預(yù)測蛋白質(zhì)的功能及蛋白質(zhì)之間可能的相互作用。將得到的差異基因提交至STRING數(shù)據(jù)庫，通過在線分析并整合蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系構(gòu)建出蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1差異基因篩選結(jié)果GSE5099共篩選出 3 023 個差異基因，其中在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的基因有974個，在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因有2 049個；GSE57614共篩選出2 944個差異基因，其中在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的基因有1 464個，在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因有1 480個。將2組基因芯片篩選結(jié)果取交集后得到1 241個差異基因，其中在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的基因有591個，在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因有650個。

2.2差異基因GO分析結(jié)果結(jié)果見表1。在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的差異基因主要富集在免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)的調(diào)控等，在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的差異基因主要富集在能量代謝、氧化磷酸化、細(xì)胞呼吸、細(xì)胞吞噬等生物進(jìn)程。

表1差異基因富集最顯著的前10位生物學(xué)功能

Tab.1Themostsignificanttop10biologicalfunctionsofdifferentialgene

差異基因生物學(xué)功能富集度P在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的差異基因 免疫應(yīng)答86<0.01 防御反應(yīng) 62<0.01 細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)67<0.01 程序性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)67<0.01 病毒的應(yīng)答反應(yīng)23<0.01 細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)67<0.01 細(xì)胞凋亡53<0.01 炎癥反應(yīng)33<0.01 免疫系統(tǒng)的積極調(diào)節(jié)31<0.01 程序性細(xì)胞死亡53<0.01在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的差異基因 前體代謝和能量代謝30<0.01 有機(jī)化合物的氧化代謝18<0.01 磷酸鹽代謝58<0.01 磷代謝58<0.01 氧化磷酸化14<0.01 細(xì)胞的呼吸作用13<0.01 磷酸化46<0.01 線粒體組織14<0.01 氧化還原38<0.01 內(nèi)吞作用的調(diào)節(jié)8<0.01

2.3KEGG信號通路分析結(jié)果結(jié)果見表2。KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的差異基因主要涉及多種受體樣信號通路、細(xì)胞凋亡、趨化因子信號通路等，在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的差異基因主要涉及氧化磷酸化、促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)信號通路，Wnt信號通路等。

表2差異基因富集最顯著的前10位信號通路

Tab.2Themostsignificanttop10signalpathwaysofdifferentialgene

差異基因信號通路富集度P在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的基因維A酸誘導(dǎo)基因蛋白I樣受體信號通路18<0.01 NOD樣受體信號通路 15<0.01 Toll樣受體信號通路18<0.01 細(xì)胞溶質(zhì)DNA傳感途徑13<0.01 細(xì)胞凋亡15<0.01 Jak-STAT信號通路20<0.01 蛋白酶體10<0.01 細(xì)胞因子 - 細(xì)胞因子受體相互作用25<0.01 脂肪細(xì)胞因子信號通路10<0.01 趨化因子信號通路 18<0.01在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因 亨廷頓氏病 21<0.01 帕金森病14<0.01 GnRH信號通路12<0.01 氧化磷酸化13<0.01 胰島素信號通路 13<0.01 纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸的降解7<0.01 阿爾茨海默氏病14<0.01 Wnt信號通路13<0.05溶酶體11<0.05霍亂弧菌感染7<0.05

2.4蛋白質(zhì)交互作用分析結(jié)果結(jié)果見圖1。從蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，NDUFS3、CHCHD10、ATP5G2、ATP5O、ATP5D、ATP5I、NDUFB8、NDUFA12、NDUFB10、UQCR1、UQCR2等基因編碼的蛋白質(zhì)與多種蛋白存在相互作用關(guān)系，在網(wǎng)絡(luò)圖中占據(jù)了較為核心的位置。

圖1差異基因蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)圖

Fig.1PPInetworkdiagramofdifferentiallyexpressedgenes

3 討論

目前，膿毒癥的治療方法仍以控制感染、體液支持為主。研究表明，免疫調(diào)節(jié)的方法在膿毒癥治療中起著舉足輕重的作用[8-9]。巨噬細(xì)胞是膿毒癥炎癥反應(yīng)的重要免疫細(xì)胞，其極化為M1、M2型巨噬細(xì)胞對炎癥反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用，且M1、M2型巨噬細(xì)胞在一定環(huán)境下能夠相互轉(zhuǎn)化[10-11]。M1型巨噬細(xì)胞能促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而M2型巨噬細(xì)胞則抑制炎癥反應(yīng)，本研究通過篩選M1、M2型巨噬細(xì)胞差異基因，尋找在M2型巨噬細(xì)胞中高表達(dá)但在M1型巨噬細(xì)胞中低表達(dá)的基因，以及在M1型巨噬細(xì)胞中高表達(dá)但在M2型巨噬細(xì)胞中低表達(dá)的基因，以促進(jìn)M1、M2型巨噬細(xì)胞的相互轉(zhuǎn)化。在膿毒癥早期促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化可適當(dāng)抑制過度的炎癥反應(yīng)，晚期促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化可以刺激免疫反應(yīng)。

本研究共篩選出1 241個差異基因，其中在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的基因有591個，在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因有650個。GO富集分析結(jié)果顯示，在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的基因主要生物學(xué)功能為免疫應(yīng)答、炎癥調(diào)節(jié)及細(xì)胞凋亡等。膿毒癥是由一系列級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)，最終引起微循環(huán)障礙和多器官功能衰竭的全身炎癥反應(yīng)綜合征，大量的炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子的分泌可引起免疫細(xì)胞及組織細(xì)胞的異常凋亡，細(xì)胞凋亡異常又反過來促進(jìn)膿毒癥的發(fā)展[12-13]。M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)基因則主要富集在能量代謝、氧化磷酸化、細(xì)胞吞噬等生物學(xué)功能，這些生物學(xué)功能與組織的修復(fù)存在密切聯(lián)系。

在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的差異基因的KEGG信號通路分析結(jié)果表明，Toll樣受體信號通路富集程度較高。有研究表明，Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)及其信號通路在膿毒癥的免疫反應(yīng)中起重要作用。作為LPS的主要受體，TLR4與LPS結(jié)合后激活下游信號通路進(jìn)而激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)，從而介導(dǎo)大量炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子的產(chǎn)生，導(dǎo)致炎癥的持續(xù)存在[14-15]。因此，TLR/NF-κB的激活被認(rèn)為在膿毒癥發(fā)病中起關(guān)鍵作用[16]。富集顯著的幾個通路如維A酸誘導(dǎo)基因蛋白I樣受體信號通路、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體信號通路均被報(bào)道在膿毒癥中起著重要的促炎作用[17-18]。在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)而在M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的基因的KEGG信號通路分析結(jié)果中，富集顯著的信號通路的基因多參與細(xì)胞的能量代謝、線粒體呼吸鏈、磷酸化等生物功能，與GO分析結(jié)果一致，因此，這些生物學(xué)途徑可能與M2型巨噬細(xì)胞的組織修復(fù)、炎癥抑制作用密切相關(guān)。

經(jīng)過STRING數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，一些基因如NDUFS3、ATP5D、ATP5I、NDUFA12、NDUFB8、NDUFB10參與了膿毒癥的眾多重要的生物學(xué)功能途徑，在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要的調(diào)控作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，NDUFS3裂解后能破壞線粒體膜電位，干擾煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)氧化和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。ATP5D、ATP5I等基因則編碼ATP合酶的亞基，參與腺苷二磷酸生成ATP[20-21]。基因NDUFA12、NDUFB8、NDUFB10編碼的蛋白為線粒體膜呼吸鏈NADH脫氫酶的亞基，NADH脫氫酶參與線粒體氧化磷酸化，轉(zhuǎn)運(yùn)電子，形成線粒體內(nèi)膜質(zhì)子梯度，為ATP產(chǎn)生提供質(zhì)子動力[22]。因此，推測上述基因在膿毒癥中發(fā)揮著重要作用，可能成為膿毒癥免疫調(diào)節(jié)治療的靶基因。

膿毒癥的高病死率使其成為全球死亡的主要原因，本研究采用多種生物信息學(xué)方法，通過分析膿毒癥中的重要免疫細(xì)胞——巨噬細(xì)胞極化的基因表達(dá)差異，找出核心差異基因，從免疫學(xué)層面為膿毒癥治療靶點(diǎn)的選擇提供參考，期望能降低患者的病死率。但本研究僅是理論上對基因數(shù)據(jù)的分析，仍需要大量的實(shí)驗(yàn)來加以實(shí)踐、論證。