劉樹業(yè)

劉樹業(yè), 天津市第三中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 天津市 300170

核心提要: 外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種亞型, 參與癌癥進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、血管生成和組織再生等生理和病理過程.通過外源性或內(nèi)源性方法選擇性操控外泌體內(nèi)容物可以為肝細(xì)胞癌的個(gè)體化治療提供依據(jù), 是癌癥診斷和治療的潛在工具.

0 引言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)死亡率居全球第二, 且發(fā)病率逐年上升.2013年美國(guó)有約30640例新發(fā)病例和21670例死亡病例[1].由于病原學(xué)因素, HCC的發(fā)病率在不同年齡、性別、種族和地理區(qū)域不同.近年來, 盡管預(yù)防和篩查手段有所改善, 診斷和治療的新技術(shù)也得到了發(fā)展, 但HCC的發(fā)病率和死亡率未降反升[2].70%-90%的HCC患者患病主要危險(xiǎn)因素是慢性肝炎和由肝炎發(fā)展而來的肝硬化[3].全球大多數(shù)HCC病例與慢性乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染有關(guān), 其他常見的危險(xiǎn)因素包括丙肝病毒(hepatitis C virus, HCV)感染、酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)和非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)[4].目前, 主要的治療方法包括肝移植和手術(shù)切除.手術(shù)切除患者五年生存率能達(dá)到50%-70%, 肝移植的患者5年的總生存率約為75%-85%.然而, 由于發(fā)現(xiàn)即處于疾病晚期導(dǎo)致只有不到30%的患者能夠進(jìn)行手術(shù)治療[5,6].

任何監(jiān)測(cè)指標(biāo)都需要能做到早期檢測(cè), 從而增加有效手術(shù)干預(yù)的機(jī)會(huì).通常包括血清生物標(biāo)志物[如甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)], 腹部超聲(ultrasound, US),計(jì)算機(jī)成像(computde tonography, CT), 磁共振(magnetic resonance imaging, MRI), 肝臟活檢[7]等.30%的HCC患者血清AFP水平升高, 且AFP水平＞400 ng/mL與HCC[7]高度相關(guān).然而, AFP敏感性較差, 經(jīng)常漏檢早期的小腫瘤.因此, 需要更有效的生物標(biāo)記物來改進(jìn)小腫瘤的檢測(cè).

細(xì)胞外囊泡是惡性腫瘤潛在的生物標(biāo)志物之一.細(xì)胞外囊泡是由細(xì)胞釋放到胞外空間并被雙層脂質(zhì)膜包裹的內(nèi)含細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)、DNA和RNA的微小囊泡.大量證據(jù)表明這些囊泡可以作為細(xì)胞間通信的一種機(jī)制[8].外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種亞型, 參與多種生理和病理過程, 包括癌癥進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、血管生成和組織再生等.外泌體也被認(rèn)為是癌癥診斷和治療的潛在工具[9,10].通過外源性或內(nèi)源性方法選擇性操控外泌體內(nèi)容物可以為HCC的個(gè)體化治療提供依據(jù).本綜述目的在于總結(jié)和評(píng)估外泌體在HCC發(fā)生發(fā)展和治療中的作用.

1 外泌體生物學(xué)及在腫瘤中的作用

外泌體直徑在40-100 nm間, 具有雙層膜結(jié)構(gòu), 由細(xì)胞以胞吐方式分泌到細(xì)胞外.幾乎所有細(xì)胞可以分泌外泌體.外泌體廣泛存在人體的血、尿、腹 腔積液等體液中, 以及培養(yǎng)細(xì)胞[11]的上清液中.

外泌體的形成機(jī)制中最經(jīng)典的是內(nèi)體分選復(fù)合物(endosomal sorting complexs required for transport,ESCRT)途徑[5].多泡體(multivesicular body, MVB)與細(xì)胞膜的融合、胞吐及外泌體的釋放密切相關(guān).CD81、CD63等蛋白可作為外泌體的鑒定標(biāo)志[10].另外, MVB還可以通過多種途徑參與胞內(nèi)多泡體的分選和多種細(xì)胞器形態(tài)的發(fā)生相關(guān)[6].

最新研究顯示腫瘤外泌體的主要效應(yīng)是免疫抑制[9].異常細(xì)胞間信息交流導(dǎo)致腫瘤發(fā)生.外泌體通過激活間質(zhì)纖維母細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用, 產(chǎn)生轉(zhuǎn)移前微環(huán)境, 抑制宿主免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)血管生成等方式參與腫瘤的產(chǎn)生、生長(zhǎng)、發(fā)展和化療耐藥[12].免疫抑制微環(huán)境的產(chǎn)生是腫瘤發(fā)病機(jī)制的重要前提, 而外泌體參與了許多免疫抑制過程[13].

Melo等[14]在癌源外泌體中發(fā)現(xiàn)了與miR生物合成和促進(jìn)腫瘤發(fā)生有關(guān)的復(fù)合物蛋白、DICER、TRBP和AGO2.Chowdhury等[15]發(fā)現(xiàn)來自惡性細(xì)胞的外泌體能夠轉(zhuǎn)化脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)成為支持腫瘤生長(zhǎng)和血管生成的肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞.

miR-126被報(bào)道[16]通過胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1, IRS1)調(diào)節(jié)血管生成和癌癥代謝.IRS1通過何種機(jī)制支持腫瘤生長(zhǎng)還不完全清楚.一種假設(shè)是通過胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF1R)放大信號(hào), 而IGF1R參與細(xì)胞分裂生成、血管生成、轉(zhuǎn)化、分化、組織調(diào)控以及細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力的調(diào)控[17].

癌細(xì)胞通過攜帶高水平microRNA 122(miR-122)[18]抑制非腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取.miR-122是膽固醇和脂肪酸代謝的重要調(diào)節(jié)因子, 可導(dǎo)致脂質(zhì)儲(chǔ)存和代謝失衡[19], 也可通過“轉(zhuǎn)移前微環(huán)境”促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移.此外, 有研究發(fā)現(xiàn)miR-122具肝臟特異性.因其負(fù)載的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Axungemesenchymal stem cell, AMSC)外泌體(122-Exo)使HCC細(xì)胞變得敏感, 提示AMSC外泌體可能是HCC治療中抗腫瘤miR的新型載體[19].

2 外泌體在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用

HCC源性外泌體中蛋白質(zhì)和RNA含量與正常細(xì)胞含量差異很大[20].這些外泌體可以被其他細(xì)胞吸收, 因此在腫瘤的局部擴(kuò)散、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和多灶性生長(zhǎng)中起著重要作用.肝臟微環(huán)境是誘導(dǎo)免疫反應(yīng)如耐受性、抵抗病毒感染的炎癥反應(yīng)和腫瘤免疫監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵因素.外泌體中的生物活性RNA和蛋白能夠影響腫瘤的微環(huán)境, 從而導(dǎo)致HCC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移.

2.1 外泌體對(duì)HCC細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用 HCC源性外泌體促進(jìn)受體細(xì)胞中轉(zhuǎn)化因子的生長(zhǎng)、參與促進(jìn)肝癌的局部擴(kuò)散、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和多灶性生長(zhǎng)[20,21].HepG2細(xì)胞通過分泌IGF1來對(duì)抗導(dǎo)入的miR-122, 進(jìn)而抑制鄰近細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生miR-122, 調(diào)節(jié)微環(huán)境, 促進(jìn)細(xì)胞增殖, 表明miR-122和IGF1都是潛在的治療靶點(diǎn).免疫細(xì)胞中miR在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移可作為抵抗有害細(xì)胞增殖或腫瘤生長(zhǎng)的防御機(jī)制[22].巨噬細(xì)胞通過miR-142和miR-223抑制癌HCC細(xì)胞的增殖[22].

超保守區(qū)域RNA(ucRNA)的轉(zhuǎn)移是外泌體影響細(xì)胞間信號(hào)傳遞的新機(jī)制.在HCC源性外泌體中, 表達(dá)ucRNA量最高的是TUC339.TUC339參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、黏附和擴(kuò)散.有體外研究發(fā)現(xiàn)小干擾RNA(short RNA, siRNA)通過抑制TUC339降低了HCC細(xì)胞的增殖, 其轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞由于ECM細(xì)胞黏附減少, 增殖和轉(zhuǎn)移潛能明顯增加, 促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞間相互作用[23].

外泌體與p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也有著密切的關(guān)系.核孔蛋白Nup98是p53基因選擇性調(diào)節(jié)器.有報(bào)道稱Nup98以Nup98 siRNAs的形式轉(zhuǎn)移到HepG2肝癌細(xì)胞(野生型p53)時(shí), 影響p21的表達(dá), 提示Nup98在調(diào)控p53靶基因選擇方面發(fā)揮著重要作用[24].在人類肝癌細(xì)胞外泌體中還發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(TGM2)和annexin A2兩種肝細(xì)胞相關(guān)蛋白.TGM2通過外泌體介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑分泌,可能是一種有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物[25].

He等[26]發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞系(HKCI-C3, HKCI-8,MHCC97L和MIHA)產(chǎn)生的外泌體通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT和MAPK信號(hào)通路, 導(dǎo)致活性基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌增加, 提示HCC來源的外泌體可動(dòng)員正常肝細(xì)胞.

在體外實(shí)驗(yàn)中, Vps4A抑制HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)、菌落形成和遷移及侵襲[21], 通過PI3K/AKT通路的滅活改善細(xì)胞對(duì)外泌體的反應(yīng), 隨腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移在HCC組織中下調(diào)[27].通過小RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn), VPS4A促進(jìn)了外泌體中致癌miRNA和細(xì)胞中抑癌miRNA的積累和攝取[12].

2.2 外泌體在肝細(xì)胞癌血管微環(huán)境生成中的作用 HCC是一種高密度血管侵潤(rùn)的實(shí)體腫瘤, 索拉非尼等抗血管生成治療對(duì)總體生存率的改善有限[7,10].因腫瘤中存在癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs), CSCs主要通過釋放血管生成因子和外泌體來驅(qū)動(dòng)血管生成.另一方面,腫瘤微環(huán)境中的血管也通過鄰分泌和旁分泌機(jī)制釋放生長(zhǎng)因子, 以支持CSCs的生長(zhǎng)并維持其干細(xì)胞特征.肝腫瘤血管生成與CSCs之間的正反饋循環(huán)加速形成了腫瘤進(jìn)展的血管微環(huán)境[28].

血管加壓素(vasorin, VASN)是一種跨膜蛋白, 在腫瘤發(fā)生和血管生成中起關(guān)鍵作用, 是腫瘤與內(nèi)皮細(xì)胞間通信的關(guān)鍵因素[29].最新研究表明VASN在HCC中的血清和組織樣本中高度表達(dá), 其水平隨增殖和轉(zhuǎn)移程度增加[30].值得注意的是, hepG2來源的VASN通過外泌體可促進(jìn)受體人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的遷移到HUVECs中[29].

3 外泌體在HCC診斷中的作用

外泌體廣泛存在于人體血液、尿液中, 穩(wěn)定、易獲得,故外泌體內(nèi)含物具有潛在生物標(biāo)記功能, 可成為較理想的臨床診斷和疾病復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的生物標(biāo)記物.

miR-939和miR-595都是HCC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[31].此外, 根據(jù)受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic, ROC)分析, miR-939, miR-595和miR-519作為HCC診斷或預(yù)后標(biāo)志物優(yōu)于Alpha fetoprotein (AFP)[31],說明外泌體miRNA作為早期HCC分子生物標(biāo)志物仍值得進(jìn)一步研究.

與慢性乙型肝炎患者和肝硬化患者相比, HCC患者血清外泌體miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224的水平上調(diào), miR-101水平下調(diào).miR-21與慢性乙型肝炎高度相關(guān)(r= 0.636,P= 0.048); mir-221與肝硬化相關(guān)(r=0.770,P= 0.009); mir-222和mir-224與肝癌相關(guān)(r= 0.547,P= 0.012;r= 0.508,P= 0.022)[32].Wang等[33]發(fā)現(xiàn)HCC患者血清外泌體miR-21水平高于慢性乙型肝炎患者或健康志愿者, 且其高表達(dá)與肝硬化和晚期腫瘤有關(guān).血清miR-21的敏感性遠(yuǎn)低于血清外泌體miR-21[33].與血清相比, 血清外泌體miR-21更適合作為HCC診斷的潛在生物標(biāo)志物.

Liu等[34]通過實(shí)驗(yàn)表明, 與血清AFP水平相比, 血清外泌體miR-10b、miR-21、miR-122和miR-200a水平與肝癌顯著相關(guān).當(dāng)外源體和血清miR與AFP聯(lián)合監(jiān)測(cè)HCC時(shí), 其預(yù)測(cè)能力增強(qiáng).

與慢性HCV相比, 丙肝相關(guān)HCC血清外泌體miR-16明顯低于HCV患者.對(duì)HCV患者血清miR-16進(jìn)行ROC分析, 當(dāng)cutoff值為0.904時(shí), 其敏感性和特異性分別為57.5%和70%.血清miR-16與AFP聯(lián)合使用可提高靈敏度(85%)和診斷準(zhǔn)確率(87.5%).此外, 血清miR-199a和miR-16水平與HCC腫瘤的大小和數(shù)量相關(guān)[35].

4 外泌體在HCC免疫治療中的作用

晚期HCC對(duì)傳統(tǒng)化療策略具有耐藥性.一方而在抗腫瘤藥物的刺激下, HCC細(xì)胞可以分泌耐受性外泌體以增強(qiáng)NK細(xì)胞的自溶作用和減弱HSP的抗腫瘤效應(yīng).另一方而, 鉑類和伊立替康等抗腫瘤藥產(chǎn)生更多含HSP的外泌體, 可能會(huì)上調(diào)并激活NK細(xì)胞受體CD69, NKG2D,NKp44的表達(dá), 同時(shí)下調(diào)CD94表達(dá), 增加了顆粒酶B的產(chǎn)生和激活NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性反應(yīng)[36].Takahashi等[37]評(píng)估了外泌體信號(hào)傳遞在肝癌對(duì)TGF-β反應(yīng)中的作用,指出 TGF-β降低了HCC細(xì)胞對(duì)索拉菲尼和鏈霉素的敏感性, 從而增加了化療耐藥性.HCC源性外泌體內(nèi)CD9和CD63激活HGF/c-MET/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)索拉菲尼抗體產(chǎn)生, 并抑制索拉菲尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡.此外, 高侵襲腫瘤細(xì)胞外泌體CD9和CD63表達(dá)更強(qiáng), 因而更易發(fā)生索拉菲尼耐藥[38].

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)通過腫瘤微環(huán)境影響肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)[39,40].骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)能夠自我更新和發(fā)育成多種譜系, 其抗腫瘤活性由白細(xì)胞介素2(IL-2)和干擾素β(IFN-β)等細(xì)胞因子誘導(dǎo)[41].在IFN-?存在的情況下, 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤分泌的外泌體(TEX)在共同培養(yǎng)中, 由于BMSC與細(xì)胞周期的相互作用以及G0/G1期細(xì)胞的阻滯, HCC細(xì)胞(H22細(xì)胞系)的增殖受到抑制[39].骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體也是有效的運(yùn)輸治療性siRNA和紫杉醇等活性藥物的載體[42].說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可能是一種很有前途的藥物傳遞載體.

脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSC)分泌的外泌體促進(jìn)T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)[40].與HCC腫瘤細(xì)胞來源外泌體(exosomes, TEX)脈沖節(jié)律一致的樹突狀細(xì)胞(DC)通過增加激活性T細(xì)胞和干擾素(IFN)-r水平, 降低抗炎cytokines、IL-10和TGF-b水平, 誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)[43].AMSC外泌體可作為miRNA的有效運(yùn)載體, 實(shí)現(xiàn)特定miRNA向肝癌細(xì)胞的傳遞,通過調(diào)控腫瘤相關(guān)靶基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮miRNA的抗肝癌或化療增敏作用.

5 外泌體在HCC肝移植復(fù)發(fā)中的作用

研究發(fā)現(xiàn)在接受肝移植的HCC患者中, 血清外泌體中的miR-718和miR-1246可作為為肝移植手術(shù)后HCC復(fù)發(fā)的標(biāo)志物[44].在微陣列芯片分析時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-718低表達(dá)與肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲性相關(guān).在轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞前體mir-718時(shí), 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖受到抑制[44].miR-718的靶點(diǎn)是HOXB8表達(dá), 其上調(diào)與HCC患者整體生存率和無復(fù)發(fā)率顯著相關(guān).因此, miR可以作為肝細(xì)胞癌肝移植后復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物.

6 結(jié)論

本文旨在總結(jié)外泌體生物學(xué)特性及其在肝癌發(fā)生發(fā)展、診斷和治療中的作用作一簡(jiǎn)要綜述.HCC對(duì)傳統(tǒng)的化療手段有很強(qiáng)的抵抗力.索拉非尼、5-氟尿嘧啶和阿霉素是目前全身性或局部性疾病的標(biāo)準(zhǔn)治療方法, 但療效有限.因此, 需要發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)并開發(fā)新的臨床方法來提高肝癌化療敏感性.腫瘤細(xì)胞來源的外泌體對(duì)癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有著復(fù)雜而重要的作用, 故對(duì)肝癌患者體液中外泌體miRNA進(jìn)行檢測(cè)和分析能夠?yàn)榘┌Y的早期診斷、治療效果評(píng)估和預(yù)后提供一定的參考和依據(jù).

然而, 外泌體廣泛應(yīng)用于肝臟惡性腫瘤尚需解決以下問題: (1)缺乏建立可靠的參考基因來評(píng)估血清外泌體靶miRNA的表達(dá)水平; (2)循環(huán)miR在診斷各種肝臟疾病中的敏感性和特異性之間存在差異; (3)miR診斷受血清、組織、體液和外泌體miR表達(dá)差異的影響[31-34]; (4)外泌體的分泌水平及其所載蛋白質(zhì)組成可能隨體外培養(yǎng)介質(zhì)的不同而變化[45].

未來的研究需要進(jìn)一步闡明外泌體作為肝癌患者篩查、診斷和治療靶點(diǎn)的確切作用和可靠性, 從而實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療.