陳宏，樂占線，羅立津*，王美燕

(1.福建省微生物研究所 環(huán)境微生物研究室，福州 350007；2.福建中醫(yī)藥大學，福州 350108)

中國每年因加工對蝦而產生大量的蝦殼，而蝦殼含有豐富的幾丁質、鈣、蝦青素、蛋白質、氨基酸和不飽和脂肪酸等物質[1-2]。蝦殼由于含有約20%活性鈣質，在利用其中幾丁質前必須進行脫鈣預處理，目前工業(yè)上大規(guī)模利用蝦殼和蝦頭制備幾丁質和殼聚糖的主要方法是用酸堿法[3]，使得豐富的鈣質和其他可溶性物質被當作污水隨意排放，既污染環(huán)境又浪費資源。而鈣卻是動物體內含量最多且最重要的礦物元素之一[4]，蝦頭、蝦殼中的活性鈣質可提取出來制備鈣營養(yǎng)強化劑。因此，研究如何高效提取蝦殼中的鈣質資源具有重要的現(xiàn)實意義。果酸鈣(Calcium citrate malate, CCM) 是新一代優(yōu)質鈣源，與以往的補鈣劑相比，具有高溶解性、高生物利用率、低鐵吸收阻礙、口味良好、安全無毒五大特點，是國際公認的優(yōu)質鈣源[5]。劉宏超曾報道了用檸檬酸與蘋果酸混合液(摩爾比為2∶3)處理堿提后的蝦殼，將活性鈣成分制成高生物效價的果酸鈣，所得果酸鈣的溶解度為0.83 g[6]，但其提取的果酸鈣的溶解度仍然不高，且該工藝需要先通過堿性有機溶劑處理。本研究通過均勻設計試驗對蝦殼用檸檬酸-蘋果酸混合液脫鈣預處理的工藝進行優(yōu)化，建立條件溫和、環(huán)境友好、產物溶解度高的蝦殼脫鈣工藝，從而為蝦殼資源綜合利用的脫鈣前處理提供經(jīng)濟可行的方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蝦殼取自福建東威食品有限公司對蝦加工車間，用水沖洗干凈，清除黏附在蝦殼表面上的血污等雜質，80 ℃烘干后，用粉碎機搗碎，過40目篩備用。其余化學藥品：檸檬酸、蘋果酸、三乙醇胺、氫氧化鈉、鈣指示劑、乙二胺四乙酸二鈉等均為分析純。

1.2 指標與檢測方法

試驗以提取液中的檸檬酸蘋果酸鈣含量為檢測指標，取不同試驗條件下反應后的提取液，離心，收集上清液50 mL，加去離子水定容至100 mL，參照國家標準《GB 1903.18—2016 食品安全國家標準 食品營養(yǎng)強化劑 檸檬酸蘋果酸鈣》檢測提取液含鈣量[7]，以鈣指示劑指示終點，用乙二胺四乙酸二鈉溶液滴定鈣離子，通過待測液顏色由紫紅色變?yōu)榧兯{色的變化判斷反應終點。

1.3 試驗方法

1.3.1 混合酸摩爾比選定試驗

分別配制(A)0.2 mol·L-1檸檬酸和(B)0.2 mol·L-1蘋果酸，A∶B分別按2∶2、2∶3、2∶5 3種比例混合A和B，即得3種混合酸溶液：(1)0.1 mol·L-1檸檬酸，0.1 mol·L-1蘋果酸；(2)0.08 mol·L-1檸檬酸，0.12 mol·L-1蘋果酸；(3)0.057 mol·L-1檸檬酸，0.143 mol·L-1蘋果酸。分別取混合酸溶液200 mL置于500 mL的三角瓶中，每瓶加入40 g蝦殼粉(即20%m/V添加量)，在60 ℃恒溫水浴反應4.0 h。反應結束后，離心，取上清液50 mL，測定溶液中的鈣離子濃度，由此選定最佳的混合酸配比。

1.3.2 單因素試驗

根據(jù)預備試驗結果，確定混合酸的最佳配比為蘋果酸∶檸檬酸的摩爾比為2∶3，分別配制系列混合酸溶液。以提取液中含鈣量為考察指標，分別考察混合酸濃度、蝦殼投料量、溫度、反應時間對蝦殼脫鈣效果的影響。具體條件如下：

(1)混合酸總濃度：設定反應溫度60 ℃，投料量為20%(m/V)，時間4.0 h，分別配制系列混合酸溶液，使其檸檬酸濃度為0.004 mol·L-1、0.01 mol·L-1、0.02 mol·L-1、 0.04 mol·L-1、0.08 mol·L-1、0.16 mol·L-1、0.24 mol·L-1，蘋果酸為相應摩爾濃度，即分別為0.006 mol·L-1、0.015 mol·L-1、0.03 mol·L-1、 0.06 mol·L-1、0.12 mol·L-1、0.24 mol·L-1、0.36 mol·L-1，則酸總濃度分別為0.01 mol·L-1、0.025 mol·L-1、0.05 mol·L-1、 0.10 mol·L-1、0.20 mol·L-1、0.40 mol·L-1、0.60 mol·L-1。

(2)蝦殼投料量：設定混合酸總濃度為0.40 mol·L-1，反應溫度60 ℃，時間4.0 h，蝦殼投料量(m/V)分別為1.0%、5.0%、10%、15%、20%、25%、30%。

(3)溫度：設定混合酸總濃度為0.40 mol·L-1，投料量(m/V)為10%，時間4.0 h，反應溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃。

(4)時間：設定混合酸總濃度為0.40 mol·L-1，反應溫度40 ℃，投料量為10%(m/V)，反應時間分別為0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、5.0 h、6.0 h、7.0 h、8.0 h。

1.3.2 均勻設計試驗

在單因素試驗基礎上，選取X1(投料量)、X2(溫度)、X3(酸總濃度)、X4(反應時間)試驗因素為自變量，以提取液中鈣離子的含量為指標，采取擬水平均勻設計U10*(54)進行試驗，檢測結果用Design Expert 7.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到回歸方程，預測最優(yōu)反應條件，并對最優(yōu)所得條件進行驗證試驗。

表 1 試驗因素水平Table 1 Factors and level of experiment

水平X1(蝦殼投料量)/%X2(溫度)/℃X3(酸總濃度)/(mol·L-1)X4(反應時間)/h18 30 0.302.5 29350.35 3.0 310 40 0.40 3.5 411 45 0.45 4.0 512 50 0.50 4.5

表 2 擬水平均勻設計U10*(54)及試驗條件Table 2 Quasi-horizontal uniform design U10*(54)and experimental conditions

實驗號蝦殼投料量/%溫度/℃酸濃度/(mol·L-1)反應時間/h11(8)2(35)2(0.35)3(3.50)21(8)3(40)4(0.45) 5(4.50)32(9)5(50)1(0.30)2(3.00)42(9)1(30)3(0.40)5(4.50)53(10)2(35)5(0.50)2(3.00)63(10)4(45)1(0.30)4(4.00)74(11)5(50)3(0.40)1(2.50)84(11)1(30)5(0.50)4(4.00)95(12)3(40)2(0.35)1(2.50)105(12)4(45)4(0.45)3(3.50)

1.4 數(shù)據(jù)分析

上述各項指標取其平均值±標準差為結果。差異性顯著分析采用 SPSS軟件中Duncan 法進行比較分析，不同小寫字母表示組內顯著性差異(P<0.05)，不同大寫字母表示組內極顯著性差異(P<0.01)。

1.5 紅外光譜定性鑒別

樣品的紅外光譜采用溴化鉀壓片法,按照《GB/T 6040-2002 紅外光譜分析方法通則》的規(guī)定進行試驗[8]，試樣的紅外光譜與《GB 1903.18-2016 食品安全國家標準 食品營養(yǎng)強化劑 檸檬酸蘋果酸鈣》的圖譜進行比對。

2 結果與分析

2.1 檸檬酸與蘋果酸比例對鈣提取率的影響

圖 1 檸檬酸和蘋果酸不同配比 對脫鈣效果的影響Figure 1 Effects of different ratio of citric acid and malic acid on decalcification efficiency

由圖1可知，在其他反應條件不變的前提下，檸檬酸與蘋果酸比例的變化會對蝦殼脫鈣效果產生影響。當鈣和檸檬酸、蘋果酸發(fā)生絡合反應時，其兩種酸比例的不同會導致生成的果酸鈣的分子結構不同，使得溶解性能有所差異。選定檸檬酸與蘋果酸2∶2、2∶3、2∶5 3種配比進行脫鈣效果的比較試驗，通過實驗表明，3種比例之間的鈣含量具有極顯著性差異，其中2∶3比例是最佳的，所制成的溶液從蝦殼中溶出的鈣含量最多，鈣含量可達到0.199 mol·L-1。依此選定檸檬酸與蘋果酸混合的最佳比例為2∶3。

圖 2 酸濃度對脫鈣效果的影響Figure 2 Effects of acid concentration on decalcification

2.1.1 單因素分析

(1)混合酸濃度對脫鈣效果的影響

在實驗過程中，觀察到當混合酸總濃度為0.60 mol·L-1(即檸檬酸0.24 mol·L-1，蘋果酸0.36 mol·L-1)時，蝦殼粉會與混合酸溶液反應，可見大量的氣泡產生，蝦殼粉膨脹。因此，選定的混合酸濃度必須低于0.60 mol·L-1。由圖2可知，在其他條件不變的前提下，當混合酸總濃度小于0.40 mol·L-1時，隨著混合酸濃度的提高，混合酸從蝦殼中溶出的鈣含量逐漸提高，當酸總濃度為0.40 mol·L-1時為最大，而當酸濃度大于0.40 mol·L-1時，混合酸溶液從蝦殼中溶出的鈣含量呈略微下降趨勢。故而可知，當混合酸濃度為0.40 mol·L-1時，混合酸溶液從蝦殼中溶出的鈣最多，提取液鈣含量可達0.363 mol·L-1。由此，將0.40 mol·L-1確定為混合酸的最佳濃度。

(2)蝦殼投料量對脫鈣效果的影響

圖 3 蝦殼投料量對脫鈣效果的影響Figure 3 Effects of shrimp shell dosage on decalcification

由圖3可知，當投料量小于10.0%(m/V)時，隨著投料量的增加，混合酸溶液從蝦殼中溶出來的鈣含量逐步增加，當投料量大于10.0%時，隨著投料量的增加，混合酸溶液從蝦殼中溶出來的鈣含量逐步減少，在投料量為10.0%時，果酸溶液從蝦殼中溶出的鈣含量最高，此時果酸鈣溶液中的鈣離子濃度為0.463 mol·L-1。由此可將10.0%(m/V)確定為蝦殼最佳投料量。

(3)反應溫度對脫鈣效果的影響

圖 4 反應溫度對脫鈣效果的影響Figure 4 Effects of temperature on decalcification

由圖4可知，當反應溫度在30～40 ℃時，隨著反應溫度的提高，果酸鈣溶液的鈣離子含量增加，當反應溫度高于40 ℃時，隨著反應溫度的提高，果酸鈣溶液的鈣離子含量反而減少。當溫度為40 ℃時，果酸溶液的鈣離子濃度為0.659 mol·L-1，由此可將40 ℃確定為最佳反應溫度。

(4)反應時間對脫鈣效果的影響

圖 5 反應時間對脫鈣效果的影響Figure 5 Effects of reaction time on decalcification

由圖5可知，在4 h以內，隨著反應時間的增加，果酸鈣溶液中鈣離子含量也逐步增加，當反應時間為4 h時鈣離子含量最高達0.687 mol·L-1。當反應時間大于4 h后，隨著反應時間的增加，果酸鈣溶液中鈣離子含量反而減少。因此，將4 h確定為最佳反應時間。

2.1.2 均勻設計試驗結果

表 3 均勻設計試驗結果Table 3 Uniform design test results

實驗號蝦殼投料量/%溫度/℃酸濃度/(mol·L-1)反應時間/h鈣含量/(mol·L-1)18.00 35 0.35 3.50 0.538 28.00 40 0.45 4.50 0.566 39.00 50 0.30 3.00 0.549 49.00 30 0.40 4.50 0.636 510.00 35 0.50 3.00 0.724 610.00 45 0.30 4.00 0.584 711.00 50 0.40 2.50 0.661 811.00 30 0.50 4.00 0.753 912.00 40 0.35 2.50 0.717 1012.00 45 0.45 3.50 0.701

均勻設計是將數(shù)論的原理和多元統(tǒng)計相結合創(chuàng)立的一種安排多因素多水平的試驗設計，其最主要的優(yōu)點是可大幅度地減少試驗次數(shù)，縮短試驗周期，從而大量節(jié)約人工和費用[9]。本試驗涉及4個因素，每個因素取5個水平，若采用正交設計試驗，則需用L25(56)表，作25次試驗，而選用均勻設計U10*(108),只要作10次試驗，借助Design Expert 7.0軟件可進行回歸分析，依據(jù)回歸方程可對提取液中鈣含量進行預測，從而確定最優(yōu)參數(shù)。

為獲得較佳的從蝦殼脫鈣預處理并制備果酸鈣的工藝，需要研究各影響因素及其水平組合對蝦殼脫鈣效果的影響。因此，在單因素實驗基礎上進行均勻設計試驗。按使用表的推薦用1、3、4、5列。形成擬水平設計表U10*(54)。從表3的均勻設計試驗結果可知，實驗8(X1=11.00%,X2=30 ℃,X3=0.50 mol·L-1,X4=4.00 h)的鈣含量最高，達到0.753 mol·L-1。通過Design Expert 7.0軟件分析，經(jīng)多元一次線性方程逐步回歸，得如下回歸方程：

Y=0.313 4 + 0.038 5X1-0.003 8X2+ 0.391 0X3-0.017 1X4

(1)

經(jīng)方差分析得知，F(xiàn)=40.82(P=0.000 5<0.01)，回歸關系極顯著，表明X1(投料量)、X2(溫度)、X3(酸濃度)、X4(反應時間)與提取液中鈣含量呈極顯著的回歸關系。

由回歸方程可知，X1、X3的系數(shù)為正，表明試驗指標隨因素A、C的增加而增加；X2、X4的系數(shù)為負值，則表示試驗指標隨因素B、D的增加而減少。所以，在確定最優(yōu)方案時，A、C的取值應偏上限，即X1(投料量)取12.00%，X3(酸濃度)取0.50 mol·L-1；同理，因素B、D的取值應偏下限，即X2(溫度)為30 ℃、X4(反應時間)為2.5 h。將以上各值代入上述回歸方程，得到Y=0.813，這一結果明顯優(yōu)于表3中的10個試驗結果。

2.1.3確證試驗結果

圖 6 不同試驗條件對脫鈣效果的影響Figure 6 Effects of different test conditions on decalcification

表 4 回歸模型方差分析Table 4 ANOVA of regression model

方差來源離差平方和自由度均方F值Probe>F回歸模型0.055 0 40.014 0 40.82 0.000 5 殘差0.001 7 50.000 3 總和0.057 09

根據(jù)回歸方程計算得出最佳反應條件，將其與單因素考察最佳條件、均勻設計實驗最佳條件進行比較。經(jīng)確證試驗表明，單因素最佳條件Ⅰ(10%，40 ℃，0.40 mol·L-1，4 h)和均勻設計最佳條件Ⅱ(11%，30 ℃，0.50 mol·L-1，4 h)的鈣離子濃度分別為0.679±0.021 mol·L-1和0.729±0.001 mol·L-1。根據(jù)方程預測最佳條件Ⅲ(12.00%，30 ℃，0.50 mol·L-1，2.5 h)下，溶液中鈣的含量確實高于單因素考察最佳條件、均勻設計實驗最佳條件，溶液中鈣含量達到了0.822±0.002 mol·L-1，略高于理論值。因此，采用此模型優(yōu)化得到的參數(shù)準確可靠(表4)，具有實用價值。

2.1.4 果酸鈣結晶的紅外光譜圖

將制得的果酸鈣溶液置于-18 ℃冷凍結晶，干燥后，經(jīng)溴化鉀壓片法進行紅外光譜定性分析，得圖7所示光譜圖。參考標準[7]進行比對可見，所得譜圖與檸檬酸蘋果酸鈣標準紅外光譜圖基本一致。由于多分子締合O-H形成很強的氫鍵，在3 100～3 500 cm-1區(qū)域形成很強、很寬的吸收譜帶；由于含有C=O基，在1 540～1 620cm-1區(qū)域出現(xiàn)很強的C=O伸縮振動吸收譜帶；由于含有的C-O基，在1 100～1 300 cm-1區(qū)域之間有幾條譜帶。

注：(a)實驗制得結晶樣品的紅外光譜圖；(b)標準[7]檸檬酸蘋果酸鈣紅外光譜圖。圖 7 檸檬酸蘋果酸鈣紅外光譜Figure 7 Infrared spectrum of calcium citrate malate

3 結論與討論

果酸鈣(Calcium Citrate Malate , CCM) 是新一代優(yōu)質鈣源。1993年美國專利“果酸鈣的合成”首次公布了使用檸檬酸、蘋果酸、碳酸鈣生成檸檬酸-蘋果酸鈣復合鹽的合成技術方案[10]。國內也有不少的學者進行利用雞蛋殼、貝殼、牡蠣殼、蟹殼等活性鈣質資源制備果酸鈣的研究，如，段惠敏將雞蛋殼通過950 ℃高溫煅燒獲得蛋殼灰分(CaO)，再將其與檸檬酸、蘋果酸反應制得果酸鈣[11]；殷蓉、汪之和等也分別報道了以雞蛋殼為原料獲得了制備果酸鈣的不同工藝[12-13]，張光杰等采用二次回歸正交設計優(yōu)化雞蛋殼制備檸檬酸-蘋果酸鈣的工藝[14]；張振謙通過正交實驗得到采用中藥牡蠣殼及花蛤殼制備檸檬酸-蘋果酸鈣的最佳原料比、反應條件及結晶條件[15]；潘榮楷報道了采用一次煅燒法研究并改進了以貝殼為原料制備蘋果酸鈣的工藝條件[16]；盧進峰報道了對梭子蟹殼中提取甲殼素產生的含鈣溶液進行鈣回收，制備果酸鈣的工藝研究[17]。本研究通過均勻設計選定了蝦殼脫鈣的最優(yōu)試驗條件，即投料量12.33%，30 ℃，酸濃度0.50 mol·L-1，2.5 h，制得的果酸鈣溶液中鈣含量達到了0.822±0.002 mol·L-1，高于已有的文獻報道。如劉宏超利用蝦殼制備果酸鈣，選取溫度55 ℃，反應10 h，所得到的果酸鈣溶解量8.3 mg·mL-1[6]；盧進峰利用梭子蟹殼制備果酸鈣，在50 ℃反應2.5 h所得果酸鈣溶解量9.635 mg·mL-1[17]；張光杰等優(yōu)化后雞蛋殼制備檸檬酸-蘋果酸鈣的工藝，選定溫度44.6 ℃，所得果酸鈣溶解量為0.356 mol·L-1[14]。比較反應條件，經(jīng)本研究優(yōu)化的制備工藝，條件溫和(30 ℃)，時間短(2.5 h)，明顯提高了蝦殼的脫鈣效率，為后續(xù)的蝦殼發(fā)酵制備殼聚糖酶和殼寡糖提供了很好的前處理工藝參數(shù)。制備所獲得的果酸鈣溶液，除了果酸鈣外，還含有其他營養(yǎng)物質，經(jīng)干燥后，也可用于畜禽養(yǎng)殖的營養(yǎng)強化劑。