山東省葡萄主要病毒病的分布及病原鑒定

吳斌 徐德坤 姜珊珊 張眉 王升吉 馬永利 辛志梅

摘要：葡萄病毒病嚴(yán)重影響葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，是制約葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。為明確該病害在山東省的最新分布狀況及病原種類，2016—2018年采用田間調(diào)查結(jié)合RT-PCR檢測(cè)等方法對(duì)山東省葡萄主要病毒病進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，186份樣品中共檢出GLRaV-1、GLRaV-3、GRSPaV、GFLV、GFkV 5種病毒，檢出率分別為18.82%、9.68%、16.67%、1.61%、33.87%，且復(fù)合侵染發(fā)生普遍，檢出率為16.67%;樹齡較大的葡萄園以GLRaV-1、GLRaV-3病毒侵染為主，新建葡萄園以GRSPaV、GFkV病毒侵染為主。研究結(jié)果可為山東省葡萄病毒病的早期預(yù)防提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：山東省;葡萄病毒病;RT-PCR檢測(cè);病原鑒定

中圖分類號(hào)：S432.4+1?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A?文章編號(hào)：1001-4942（2019）12-0073-05

Abstract?Virus diseases are important threats to the yield and quality of grape， restricting the development of grape industry. In the study， the methods such as RT-PCR and field investigation from 2016 to 2018 were used to investigate the distribution and pathogen species of virus disease in Shandong Province. The results showed that five viruses including GLRaV-1，GLRaV-3，GRSPaV，GFLV and GFkV were detected from 186 samples and the corresponding detection rates were 18.82%，9.68%，16.67%，1.61%，33.87%， respectively.The compound infection commonly occurred with the detection rate of 16.67%. In the vineyards with large tree-age grape，GLRaV-1 and GLRaV-3 were the main viruses;and in the newly-built vineyards，GRSPaV and GFkV were the main pathogen species. The results provided a theoretic guide for the early prevention against grape virus disease in Shandong Province.

Keywords?Shandong Province; Grape virus disease; RT-PCR detection; Pathogen identification

葡萄（Vitis vinifera L.）作為一類重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國果樹生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位，種植面積和產(chǎn)量均居世界第二位[1]，同時(shí)也是感染病毒病最多的果樹之一，該類病害的發(fā)生嚴(yán)重影響葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，是制約葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[2]。目前，國內(nèi)外已報(bào)道的葡萄病毒病病原種類達(dá)66種[3]，中國至今僅報(bào)道其中13種，包括葡萄卷葉相關(guān)病毒1～5、7（grapevine leafroll-associated virus，GLRaV-1～5，7）、沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）、葡萄扇葉病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）、葡萄斑點(diǎn)病毒（grapevine fleck virus，GFkV）、葡萄A病毒（grapevine virus A，GVA）、葡萄B病毒（grapevine virus B，GVB）、葡萄E病毒（grapevine virus E，GVE）和灰比諾葡萄病毒（grapevine pinot gris virus，GPGV）等[4-6]。其中，分布較廣、危害較重的有GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-4、GFkV、GFLV和GPGV，而病毒的復(fù)合侵染會(huì)加重對(duì)葡萄的危害[7]。

山東省是葡萄種植大省，常年種植面積在4.32×104 ?hm2左右，居全國第三位。近年來葡萄產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，栽培面積不斷擴(kuò)大，苗木引種日益頻繁，但由于缺乏完善的病毒病檢測(cè)規(guī)范，山東省各地葡萄病毒病發(fā)生普遍，尤其是新建果園，嚴(yán)重地塊病株率高達(dá)60%以上，嚴(yán)重影響了經(jīng)濟(jì)效益。對(duì)于山東省葡萄病毒病的系統(tǒng)研究較少，潘志勇等[8]發(fā)現(xiàn)GFLV和GLRaV是山東省葡萄產(chǎn)區(qū)主要病毒病，尚佑芬[9]、王升吉[10]等對(duì)山東省GRSPaV、GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3病毒進(jìn)行了檢測(cè)，周瑩等[11]對(duì)膠東半島地區(qū)葡萄病毒病進(jìn)行了普查，發(fā)現(xiàn)主要病原為GFkV、GLRaV-1和GLRaV-3。本研究于2016—2018年采集山東省葡萄主產(chǎn)區(qū)病毒病疑似樣品，基于田間調(diào)查與分子生物學(xué)檢測(cè)方法，明確了山東省葡萄病毒病的最新分布、主要的病原種類及復(fù)合侵染類型，為山東省葡萄病毒病的早期預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

2016—2018年于山東省煙臺(tái)市、青島市、日照市、濰坊市、臨沂市、聊城市和德州市7個(gè)葡萄主產(chǎn)區(qū)采集具有花葉、褪綠、黃化、畸形、皺縮等疑似病毒病癥狀的葡萄葉片樣品共186份，將采集的樣品保存于-80℃冰箱，以未感病的健康葡萄葉片作為陰性對(duì)照。

主要試劑：TransZol Plant多糖植物總RNA提取試劑盒、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株（北京全式金生物技術(shù)有限公司）;2 × Es Taq Master Mix（Dye）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）;HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（南京諾唯贊生物科技有限公司）;Plus DNA Extraction Kit（GeneMark公司）;DNA Marker、pMD18-T克隆載體、Solution Ⅰ（TaKaRa公司）;特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其他生化試劑及普通化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

主要儀器：AE224C自動(dòng)內(nèi)標(biāo)電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）;MM400組織研磨儀（德國Retsch公司）;Mastercycler nexus PCR儀、Centrifuge 5430R離心機(jī)（德國Eppendorf公司）;JY300電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）;GelDoc-It 310 Imaging System凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）。

1.2?總RNA的提取及cDNA合成

稱取0.1 g葡萄葉片樣品，置于2 mL離心管中，加入滅菌鋼珠，液氮冷凍后迅速在組織研磨機(jī)上研磨至粉末狀，并按試劑盒說明書提取葉片總RNA，-80℃保存。

以提取的植物總RNA為模板，在0.2 mL的RNase-free離心管中依次加入模板RNA 6 μL，Random hexamers 1 μL，RNase-free ddH2O 2 μL，65℃變性10 min后立即冰上放置2 min，再加入2×RT Mix 10 μL，HiScript Ⅱ Enzyme Mix 2 μL，25℃ 5 min;50℃ 45 min;85℃ 5 min。合成的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3?PCR擴(kuò)增

根據(jù)已報(bào)道的13種葡萄病毒病相關(guān)病毒序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以cDNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：cDNA 1 μL，2×Es Taq Master Mix 15 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足總體積至30 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.4?PCR產(chǎn)物回收、測(cè)序及分析

參照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段，并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，挑取陽性克隆，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，送交生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，分析病毒種類。

2?結(jié)果與分析

2.1?葡萄病毒病發(fā)生情況及癥狀

對(duì)山東省煙臺(tái)市、青島市、日照市、濰坊市、臨沂市、聊城市和德州市7個(gè)葡萄主產(chǎn)區(qū)進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)田間葡萄病毒病發(fā)生普遍，病株率在10%～30%，嚴(yán)重的苗圃田病株率可達(dá)60%以上。感病植株主要表現(xiàn)為花葉、葉片脈間褪綠、斑點(diǎn)黃化、葉緣卷曲、葉片皺縮、畸形（圖1）。

2.2?山東省葡萄病毒病病原檢測(cè)

對(duì)采集的186份病毒病疑似樣品分別進(jìn)行RNA提取和RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，僅GLRaV-1、GLRaV-3、GRSPaV、GFLV、GFkV 5種病毒被檢出（圖2），檢出率分別為18.82%、9.68%、16.67%、1.61%、33.87%（表2）。測(cè)序結(jié)果與GenBank中已報(bào)道的分離物序列一致性均在90%以上。

2.3?山東省葡萄病毒病分布情況

對(duì)山東省葡萄主產(chǎn)區(qū)采集的186份葡萄樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)間病毒病發(fā)生存在差異性，煙臺(tái)、青島平度、萊西、聊城東昌府和德州臨邑等樹齡較大的葡萄園以GLRaV-1、GLRaV-3病毒侵染為主，新建葡萄園以GRSPaV、GFkV病毒侵染為主。復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍，檢出率為16.67%，復(fù)合侵染的組合方式有4種（表2）。

3?討論與結(jié)論

葡萄繁殖方式主要為扦插和嫁接等無性繁殖，樹體一旦感染病毒將終生帶毒，給防治帶來很大的困難[23]。近年來葡萄產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，苗木流通日漸頻繁，但由于引種時(shí)缺乏完善的病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，大大增加了病毒感染幾率，同時(shí)粗放的栽培管理模式，加速了病毒的蔓延[24]。因此，葡萄病毒病的早期檢測(cè)工作不僅是無病毒苗木認(rèn)證中的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作，也是防控葡萄病毒病的根本保障。

山東作為葡萄種植大省，在葡萄病毒病的防控技術(shù)研究上還存在大量空白。本研究對(duì)山東省葡萄主產(chǎn)區(qū)的主要病毒病發(fā)生情況和病原種類展開了系統(tǒng)性的調(diào)查和檢測(cè)。結(jié)果表明，山東省葡萄主要病毒病為GLRaV-1、GLRaV-3、GRSPaV、GFLV和GFkV，以GFkV檢出率最高，GFLV僅在兩個(gè)區(qū)域檢出，檢出率僅為1.61%，各病毒的檢出率無明顯的區(qū)域性差異;煙臺(tái)、青島平度、萊西、聊城東昌府和德州臨邑等樹齡較大的葡萄園以GLRaV-1、GLRaV-3病毒為主，新建葡萄園以GRSPaV、GFkV病毒為主，這與潘志勇等[8]的研究結(jié)果不完全一致，表明近年來隨著頻繁引種，山東省新建葡萄園主要病毒病病原發(fā)生了顯著變化。

復(fù)合侵染是病毒感染植物的一種常見現(xiàn)象，本研究結(jié)果表明山東省葡萄病毒病復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍，檢出率為16.67%，復(fù)合侵染的組合方式有4種，單個(gè)樣品中最多可檢出3種病毒。其中，GFkV參與3個(gè)類型的復(fù)合侵染，GRSPaV和GFkV的復(fù)合侵染比列最高，檢出率為7.53%。結(jié)合前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄病毒病多與葡萄類病毒病混合發(fā)生，加重了對(duì)葡萄的危害，嚴(yán)重影響葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)[24]。

綜上所述，葡萄病毒病已成為制約山東省葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一類重要病害。本研究明確了山東省葡萄主要病毒病的發(fā)生現(xiàn)狀，為山東地區(qū)葡萄的引種、病毒病的早期檢測(cè)及防治提供了技術(shù)支持與理論指導(dǎo)。

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