消氨菌的分離、鑒定及其急性經(jīng)口毒性

劉雪蘭 魏祥法 董以雷 石天虹 閻佩佩 邱聰 張燕 伏春燕

摘要：為篩選出安全且能降低畜禽舍內(nèi)氨氣濃度的菌株，本研究從雞糞、活性淤泥等6個樣本中分離單一菌株，檢測菌株的除氨效果，并對較優(yōu)除氨功能的菌株進行鑒定和急性經(jīng)口毒性試驗。結(jié)果表明，分離到兩株單一菌株，經(jīng)檢測其中一株具有較強除氨能力，初步鑒定該菌株屬于金黃桿菌屬（Chryseobacterium）;經(jīng)急性經(jīng)口毒性試驗發(fā)現(xiàn)，菌液對小鼠半數(shù)致死量（LD50）大于20 g/kg BW，屬實際無毒級;處理14 d后，小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、尿素（BUN）、肌酐（Cre）、血糖（GLU）、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量與對照組均無顯著性差異（P>0.05）。因此，該菌安全無毒副作用，可應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)有害氣體的消除。

關(guān)鍵詞：消氨菌;分離;鑒定;急性毒性

中圖分類號：S432.4+2?文獻標識號：A?文章編號：1001-4942（2019）12-0082-05

Abstract?The study was aimed to screen out bacteria strains which were safe and could reduce ammonia concentration in livestock and poultry houses. We isolated single strain from six samples including chicken manure， active sludge and so on， and tested their ammonia-removal effects. Then we selected the strain with better ammonia-removal effect and conducted the acute oral toxicity experiment. The results showed that two strains were isolated， and one of them had stronger ammonia-removal ability. It was preliminarily identified belonging to Chryseobacterium. The lethal dose （LD50） of the bacterial solution to mice was more than 20 g/kg BW， so it belonged to the actual non-toxic level. After 14 days of treatment， there were no significant differences in serum alanine aminotransferase （AST）， glutamic oxaloacetic aminotransferase （ALT）， urea （BUN）， creatinine （Cre）， blood glucose（GLU）， total cholesterol （TC） and triglyceride （TG） contents between experimental group and control group（P>0.05）. Hence， the bacterium was safe and non-toxic， which could be used to eliminate harmful gases in livestock and poultry industry.

Keywords?Ammonia-removal bacteria; Isolation; Identification; Acute toxicity

在畜禽養(yǎng)殖過程中，糞尿中的尿酸、未被消化的蛋白質(zhì)等在微生物的作用下會產(chǎn)生大量氨氣，一方面對畜禽健康產(chǎn)生極大危害，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降，養(yǎng)殖效益降低;另一方面，也是大氣PM 2.5指數(shù)持續(xù)升高的推手和引起霧霾天氣的重要元兇，嚴重危害人類健康。如何消減畜禽養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的氨氣是現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)的重要研究課題。飼料添加劑（酶制劑、脲酶抑制劑、酸化劑、微生態(tài)制劑等）能在一定程度上減少氨氣的排放，但飼糧中的氮不可能完全被吸收，總有一部分排放出來，在微生物的作用下產(chǎn)生大量的氨氣，因此末端治理技術(shù)研發(fā)成為必然。目前主要的方法有安裝微電流抑菌抑氨系統(tǒng)、硫酸銨回收系統(tǒng)等，其缺點是投資過大，能量消耗過多，一般用于高附加值的祖父代種畜禽，不適合應(yīng)用于商品代畜禽舍。生物除氨技術(shù)具有經(jīng)濟、高效的特點，已在污水處理等領(lǐng)域應(yīng)用，在養(yǎng)殖業(yè)也取得了初步的進展，如單奇華[1]、張遠瓊[2]等分別篩選出的酵母菌和放線菌，用來處理畜禽糞便時均取得了很好的效果，適合應(yīng)用于養(yǎng)殖廢棄物處理環(huán)節(jié)。目前多采用吸附法和掩蓋法，但其研究效果一般。受生物法處理養(yǎng)殖廢棄物的啟示，本試驗擬從自然界中篩選出消氨菌，用于消除畜禽舍中的氨氣，旨在改善畜禽舍環(huán)境、增進畜禽健康。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?樣品來源?A樣品來自淄博馬踏湖湖底污泥，B樣品來自聊城污水處理廠的活性污泥，C樣品來自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所雞舍的新鮮雞糞，D樣品來自垃圾中轉(zhuǎn)站污水，E樣品來自使用后的發(fā)酵床墊料，F(xiàn)樣品來自市售有機肥。

1.1.2?主要試劑和儀器

葡萄糖、（NH4）2SO4、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、瓊脂粉、瓊脂糖、LB培養(yǎng)基、納氏試劑、酒石酸鉀鈉、NaCl、氫氧化鈉（片狀）、丙三醇、二甲基亞砜、無水乙醇、磷酸氫二鉀等，均為國產(chǎn)分析純試劑。電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自山東致遠試驗設(shè)備有限公司;萬分之一電子天平，購自上海力辰儀器科技有限公司;電熱恒溫振蕩培養(yǎng)箱，購自常州市中貝儀器有限公司。

1.1.3?培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，（NH4）2SO4 2.0 g，NaCl 2.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，去離子水1 000 mL，pH值7.2～7.4，121℃高壓滅菌30 min。

分離培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基加2%瓊脂。

篩選培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g，（NH4）2SO4 ?0.6 g，NaCl 1.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，K2HPO4 ?0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，去離子水定容至 1 000 mL，分裝于 250 mL三角瓶中，每瓶 100 mL，121℃滅菌30 min。

1.2?菌株的分離、純化

樣品預(yù)處理：取上述樣品各5 g分別溶解于100 mL無菌水中，于30℃、110 r/min 的恒溫搖床中振蕩混勻。

富集培養(yǎng)：將經(jīng)過預(yù)處理的6個樣品接種于裝有100 mL滅菌的富集培養(yǎng)基中，充分搖勻，30℃、180 r/min富集培養(yǎng)，每隔1 d補充5%硫酸銨，富集7 d，以淘汰不能利用NH+4-N的微生物。

菌株的分離純化：從培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液中吸取1 mL能利用NH+4-N的富集樣品，經(jīng)梯度稀釋（10-1 ～ 10-6）后，取0.1 mL的接種量涂布在倒置的分離培養(yǎng)基平板上，于30℃進行培養(yǎng)，挑取平板上長出的單菌落進行重復(fù)分離純化，直到得到單一菌株。

1.3?消氨菌的篩選

將純化得到的菌株接種到篩選培養(yǎng)基中，測試各菌株在30℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24、48 h后的NH+4-N去除率，從而篩選出消氨能力較強的菌株。

NH+4-N去除率（%）=（初始NH+4-N量-培養(yǎng)后NH+4-N量）/初始NH+4-N量×100。

1.4?菌株的鑒定

1.4.1?形態(tài)學(xué)鑒定

觀察平板上生長的菌落形態(tài)特征，參照微生物學(xué)實驗技術(shù)對分離出的菌株進行革蘭氏染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)。

1.4.2?分子生物學(xué)鑒定

提取消氨菌基因組DNA，以27F、1541R（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′） 為引物進行16S rRNA的擴增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR mix 12.5 μL，ddH2O 8 μL，27F 1 μL，1541R 1 μL，DMSO 1.5 μL，離心混勻后加入 DNA 模板1 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 90 s，共35個循環(huán);72℃ 10 min。取4 μL PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳（25 mL 1×TAE緩沖液，1%的凝膠，90 V，35 min）進行檢測。DNA測序由山東力戈科技有限公司完成。DNA序列同源性采用NCBI（National Centre for Biotechnology）網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Blast軟件進行檢索，將搜索到的同源序列用Clustal X軟件進行排序，然后用MEGA 6軟件進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.4.3?生理生化鑒定

用法國梅里埃微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定，方法按照腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒說明書進行。

1.5?急性經(jīng)口毒性試驗

1.5.1?預(yù)試驗?Horn氏法[3]：將生長期雄性昆明小鼠分為3組，每組6只，對各組小鼠采用相應(yīng)劑量進行一次灌胃，灌胃劑量分別為0.1、1.0、10.0 g/kg BW，灌胃后密切觀察24 h，看是否有毒性反應(yīng)和死亡現(xiàn)象。

1.5.2?最大耐受量試驗

取體重相近的生長期雄性昆明小鼠20只，試驗組和對照組各10只，單籠飼養(yǎng)，逐只稱重，試驗期2周。具體方法：禁食4 h 后（禁食期間自由飲水），一次性給予小鼠20 g/kg BW的受試物，對照組一次性灌胃20 g/kg BW的無菌水，灌胃后禁食1 h，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠體征表現(xiàn)[4]、行為狀況、中毒癥狀[5， 6]及死亡時間。灌胃14 d后分別取各處理小鼠，乙醚麻醉后斷頸取血，分離血清，測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、尿素（BUN）、肌酐（Cre）、血糖（GLU）、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）[7-9]含量;解剖小鼠，檢查小鼠胸、腹部各器官變化情況[10]。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌株的分離純化

對6個樣品進行富集培養(yǎng)、梯度稀釋（10-1 ～ 10-6）后涂布在倒置的分離培養(yǎng)基平板上，并反復(fù)分離純化，分別從B樣品和C樣品中分離到單一菌株（圖1）。

2.2?消氨菌的篩選

對B、C菌株進行氨氮去除率的測定，結(jié)果見表1。菌株B的氨氮去除率為負值，為產(chǎn)氨菌，不符合要求;菌株C具有較高的脫氨效率，為目標菌株。

2.3?菌株的鑒定

2.3.1?細菌形態(tài)學(xué)特征

菌落圓形，乳白色，易挑取，表面光滑，不透明，邊緣整齊;顯微鏡下觀察為桿狀，無芽孢，無鞭毛。

2.3.2?菌株的分子生物學(xué)鑒定

菌株C的16S rRNA擴增片段大小約1 636 bp（圖2）;將測序結(jié)果與GenBank上已登錄的基因序列作比對，發(fā)現(xiàn)與金黃桿菌同源性最高，為99%;利用MEGA 6軟件，將分離菌株與部分參考菌株基于16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3。

2.3.3?生理生化特征

如表2所示，C菌為革蘭氏陰性桿菌，不具運動性，氧化酶陽性，硝酸鹽還原試驗陰性，明膠液化試驗陽性。根據(jù)形態(tài)學(xué)及生理生化等指標，確定菌株C屬于金黃桿菌屬（Chryseobacterium）。

2.4?菌株C急性經(jīng)口毒性

2.4.1?預(yù)試驗結(jié)果

經(jīng)觀察，灌胃后未見任何毒性反應(yīng)，也無一例死亡，小鼠生長和精神狀況良好，進食、飲水、呼吸、排泄及各種生命活動均正常。

2.4.2?最大耐受量試驗

喂養(yǎng)14 d后進行解剖，小鼠心、肝、脾、肺、腎、腸等臟器與對照組相比均無明顯病變和差異。結(jié)果顯示，試驗小鼠對菌體最大耐受劑量大于20 g/kg BW，在現(xiàn)行急性經(jīng)口毒性試驗劑量分級中[11]，將小鼠口服LD50大于10 g/kg BW的受試物劃分為實際無毒物質(zhì)，故菌體屬實際無毒物質(zhì)。

灌胃后小鼠生理生化指標的變化情況也可反映菌液對小鼠臟器功能的影響[12]。由表3可知，經(jīng)菌液灌胃處理14 d后，處理組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、尿素（BUN）、肌酐（Cre）、血糖（GLU）、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量與對照組無顯著性差異（P>0.05）。

3?討論

3.1?不同微生物的抑氨效果

Kim等[13]分離到一株除臭乳酸桿菌，厭氧條件下，作用于新鮮豬糞漿50 h后可使其中的NH3濃度降低98.5%以上。陳麗園等[14]分離到的菌株10MG可使新鮮豬糞中氨氣排放量降低76.14%。陳國營等[15]從蛋雞糞便中分離到一株乳酸片球菌屬抑氨菌，其菌液96 h抑氨效果為40.0%。甘曉等[16]篩選到兩株細菌YF1和YS2，分別為假單胞菌屬 （Pseudomonas sp.）和中華根瘤菌屬 （Sinorhizobium sp.），兩菌1∶1混合接種到雞糞中可使NH3釋放量降低75.6%。本研究從新鮮雞糞中分離到1株能夠除NH+4-N的金黃桿菌屬菌株，48 h對篩選培養(yǎng)基中的NH+4-N（229 mg/L）去除率為27.53%，與上述菌株有一定差距，這與菌株的種類、NH+4-N濃度、作用時間、其它基質(zhì)的含量等不同有關(guān)，下一步將采用誘變方法或基因工程方法提高其NH+4-N去除效果。

3.2?抑氨微生物的安全性

畜禽養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的惡臭已成為一大公害，除臭微生物的篩選工作開始于二十世紀四五十年代，人們先后從不同的基質(zhì)中分離到不同種類但具有相同功能的抑氨微生物，由于這些微生物最終應(yīng)用于畜禽舍或畜禽糞污處理場，因此有必要對其進行安全性評價，特別是對一些條件致病菌。本研究篩選到的菌株C經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化反應(yīng)和分子鑒定發(fā)現(xiàn)與金黃桿菌同源性高達99%。金黃桿菌為條件致病菌，但同時又具有去除NH+4-N的功能，因此在養(yǎng)殖業(yè)中具有應(yīng)用潛能。通過小鼠急性經(jīng)口毒性試驗證明其不具有毒性，采用最大劑量耐受法對小鼠一次性灌胃20 g/kg BW后，小鼠進食、飲水、呼吸、排泄及各種生命活動均正常，未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)，也無一例死亡，表明該菌屬于“實際無毒”級。灌胃處理14 d后測定小鼠血清中各項生理生化指標，均與對照組無顯著性差異，說明處理組小鼠臟器功能未受影響。

4?結(jié)論

本研究分離出具有較強除氨能力的菌株C，并初步鑒定該菌株屬于金黃桿菌屬（Chryseobacterium）;通過急性經(jīng)口毒性試驗發(fā)現(xiàn)，菌株C不具有毒性，屬于安全菌株，經(jīng)過誘變育種、分子育種改良后，具有應(yīng)用在養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中的潛力，也可以與現(xiàn)有的抑氨菌進行復(fù)配，應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖環(huán)境的調(diào)控中。

參?考?文?獻：

[1]?單奇華， 俞元春， 傅利劍， 等. 除臭酵母的篩選及其除臭機理[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2005， 29（4）： 101-104.

[2]?張遠瓊. 利用微生物去除禽糞臭味的初步研究[J]. 微生物學(xué)雜志， 1994， 14（2）： 53-54.

[3] McKean C， Tang L， Tang M， et al. Comparative acute and combinative toxicity of aflatoxin B1 and fumonisin B1 in animals and human cells[J]. Food Chem. Toxicol.， 2006， 44 （6）： 868-876.

[4] Owaga E E， Chen M J， Chen W Y， et al. Oral toxicity evaluation of kefir-isolated Lactobacillus kefiranofaciens M1 in Sprague-Dawley rats[J]. Food Chem. Toxicol.， 2014， 70： 157-162.

[5] Sosa S，F(xiàn)avero G D， Bortoli M D， et al. Palytoxin toxicity after acute oral administration in mice[J]. Toxicol. Lett.， 2009， 191 （2/3）： 253-259.

[6] Lorke D.A new approach to practical acute toxicity testing[J].Archives of Toxicology， 1983， 54（4）： 275-287.

[7] Sanjay K R，Kumaresan N， Naidu A K， et al. Safety evaluation of pigment containing Aspergillus carbonarius biomass in albino rats[J]. Food Chem. Toxicol.， 2007， 45（3）：431-439.

[8] Patel C，Dadhaniya P， Hingorani L， et al. Safety assessment of pomegranate fruit extract： acute and subchronic toxicity studies[J]. Food Chem. Toxicol.， 2008， 46（8）：2728-2735.

[9] Alnajar Z A， Abdulla M A， Ali H M， et al. Acute toxicity evaluation， antibacterial， antioxidant and immunomodulatory effects of Melastoma malabathricum[J]. Molecules， 2012， 17 （3）： 3547-3559.

[10]Tan Q，Xu H， Aguilar Z P， et al. Safety assessment and probiotic evaluation of Enterococcus faecium YF5 isolated from sourdough[J]. J. Food Sci.， 2013， 78（4）： 587-593.

[11]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB 15193.3—2014食品安全國家標準 急性經(jīng)口毒性試驗[S]. 北京： 中國標準出版社， 2014.

[12]梁春梅， 高鵬飛， 陳震， 等. 益生菌B. animalis V9凍干粉安全性毒理學(xué)研究[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志， 2010， 22（6）： 481-484， 488.

[13]Kim J D， Kang K H. Isolation of Lactobacillus sakei strain KJ-2008 and its removal of characteristic malodorous gases under anaerobic culture conditions[J]. Bioscience， Biotechnology and Biochemistry， 2004， 68（12）： 2427-2435.

[14]陳麗園， 吳東， 夏倫志， 等. 畜禽糞便除臭微生物的分離與篩選[J]. 畜牧與獸醫(yī)， 2008， 40（12）： 59-61.

[15]陳國營， 李呂木， 詹凱， 等. 一株抑氨菌的篩選、鑒定及應(yīng)用研究[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志， 2012， 24（2）： 97-101， 108.

[16]甘曉， 李呂木， 錢坤， 等. 抑氨菌篩選鑒定、培養(yǎng)條件優(yōu)化及在雞糞除臭中的應(yīng)用[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志， 2014， 26（6）： 621-626.