孫艷雪 王玉華 楊易 張燁

【摘?要】?目的：優(yōu)化乙醇熱回流法提取葛根素的工藝條件并與超聲法進(jìn)行對比。方法：以葛根為原料，葛根素濃度為評價指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的，采取正交L9（34）試驗(yàn)設(shè)計，探討乙醇濃度、提取時間、固液比、提取溫度對葛根素提取的影響，并用UV測定葛根素含量。結(jié)果：葛根素的最優(yōu)乙醇熱回流法提取工藝為在乙醇濃度為75%、提取溫度為90℃、固液比為1∶25的條件下提取75min。結(jié)論：乙醇熱回流法與超聲法相比，乙醇熱回流法的提取率更高，但其溶劑用量大、所需溫度高、操作難度大而超聲法具有效率高、耗時短、溶劑用量少、操作簡單、綠色環(huán)保等特點(diǎn)，因此超聲法手段更加適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【關(guān)鍵詞】?葛根;葛根素;回流法;超聲法;工藝優(yōu)化

【中圖分類號】R284.2?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】?A【文章編號】1007-8517（2019）23-0033-05

Study?on?Extraction?Process?of?Puerarin?from?Radix?Puerariae

SUN?Yanxue?ZHANG?Ye*

School?of?Pharmacy，?Inner?Mongolia?Medical?University，?Hohhot?010110，China

Abstract：Objective?The?process?conditions?of?extracting?puerarin?by?ethanol?hot?reflux?Method?were?optimized?and?compared?with?ultrasonic?method.?Methods??The?puerarin?concentration?was?used?as?the?raw?material，?and?the?concentration?of?puerarin?was?used?as?the?evaluation?index.?The?effects?of?ethanol?concentration，?extraction?time，?solid-liquid?ratio?and?extraction?temperature?on?the?extraction?of?puerarin?were?investigated?by?single?factor?test?and?orthogonal?test.?The?puerarin?content?was?determined?by?UV.??Results?The?optimal?ethanol?thermal?reflux?extraction?method?of?puerarin?was?extracted?for?75?minutes?under?the?conditions?of?ethanol?concentration?of?75%，?extraction?temperature?of?90℃?and?solid-liquid?ratio?of?1∶25.?Conclusion?Compared?with?the?ultrasonic?method，?the?ethanol?hot?reflux?method?has?a?higher?extraction?rate?of?the?ethanol?hot?reflux?method，?but?the?solvent?amount?is?large，?the?required?temperature?is?high，?the?operation?is?difficult，?and?the?ultrasonic?method?has?high?efficiency，?short?time?consumption，?and?low?solvent?dosage.?The?operation?is?simple，?green?and?environmentally?friendly，?so?the?ultrasonic?method?is?more?suitable?for?industrial?production.

Keywords：Pueraria;?Puerarin;?Reflux?Method;?Ultrasonic?method;?Process?optimization

葛根[1]是豆科植物甘葛藤（粉葛）Pueraria?thomsonii?Benth.或野葛Pueraria?lobata（Willd.）Ohwi.的根。味甘、辛，性涼。?歸脾、胃、肺經(jīng)。有[2-4]解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒之功效。常用于外感頭痛發(fā)熱、項背強(qiáng)痛、麻疹不透、口渴、消渴、熱痢、泄瀉、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱、胸痹心痛、酒毒傷中。葛根中含有多種有效成分，主要為葛根素。近代有關(guān)研究表明，葛根素對突發(fā)性耳聾以及心腦血管疾病等有較好的療效[5-6]。隨著人們對葛根的藥理作用進(jìn)行深入研究，將其當(dāng)作原料加工制作的各類食品藥品廣受國內(nèi)外民眾好評。目前常用于葛根素提取的方法有醇提法、水提法、微波輔助萃取法、超聲波輔助法等。

1?材料與方法

1.1?儀器?TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;電子天平TA1003（上海菁海儀器有限公司）;HH-2恒溫水浴鍋（常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠）;N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYEL4）。

1.2?試藥?葛根飲片購于國藥控股國大藥房內(nèi)蒙古有限公司，用粉碎機(jī)超微粉化后，用密封袋分兩次包裝備用;葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（來源于中國食品藥品檢定研究院）。95%乙醇、實(shí)驗(yàn)過程中所用蒸餾水、無水乙醇。

2?方法與結(jié)果

2.1?葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制?精密稱量葛根素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于50mL的容量瓶中，加30%乙醇定容，即配制成質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置于25mL容量瓶中，加30%乙醇定容。以30%乙醇作空白對照，在波長為250nm處測定吸光度，并繪制吸光度和質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2?單因素試驗(yàn)

2.2.1?乙醇濃度對葛根素提取率的影響?精密稱取3份10.000g的葛根粉，分別加入相95%乙醇、75%乙醇和50%乙醇（固液比1∶20g/mL），在90?℃恒溫水浴下用索氏提取器回流提取60min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.2?提取時間對葛根素提取率的影響?稱取3份10.000g的葛根粉，按照固液比1∶20（g/mL）加入相應(yīng)量的95%乙醇，在90℃恒溫水浴下分別用索氏提取器回流提取90min、75min、60min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.3?提取溫度對葛根素提取率的影響?稱取3份10.000g的葛根粉，按照固液比1∶20（g/mL）加入相應(yīng)量的95%乙醇，分別在90℃、85℃、80℃恒溫水浴下用索氏提取器回流提取60min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.4?乙醇濃度對葛根素提取率的影響?稱取3份10.000g的葛根粉，分別按照固液比1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）加入相應(yīng)量的95%乙醇，在90℃恒溫水浴下用索氏提取器回流提取60min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.3?正交試驗(yàn)?葛根素提取的因素很多，通過單因素試驗(yàn)確定了各因素的最優(yōu)水平。但考慮到各因素之間的相互影響，以紫外分光光度法測得的葛根素含量為參考指標(biāo)，采用正交L9（34）試驗(yàn)設(shè)計，研究葛根素的最佳提取條件。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

2.4?葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線?以葛根素質(zhì)量吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，可獲得線性回歸方程：y=0.1313x-0.101（R2=0.9982）??式中：y為吸光度;x為質(zhì)量濃度（μg/mL）。結(jié)果表明，葛根素質(zhì)量濃度在1.6～9.6μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。如圖1所示。

2.5?單因素試驗(yàn)

2.5.1?乙醇濃度對葛根素提取率的影響?選擇最合適的溶劑從樣品基質(zhì)中提取目標(biāo)分析物是開發(fā)提取方法的基礎(chǔ)步驟。離子液體作為一種環(huán)境友好的綠色溶劑，在過去的幾十年中得到了越來越多的關(guān)注。然而，離子液體也有一些缺點(diǎn)，包括太昂貴而不能大規(guī)模用于商業(yè)生產(chǎn)，難以再生和有一些毒性等。為此，對不同濃度乙醇對葛根素提取率的影響進(jìn)行研究。前人對不同乙醇濃度下超聲法提取葛根素的提取率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)50%乙醇才是最佳選擇。而從表1、圖2可以看出當(dāng)乙醇濃度為75%時提取出的葛根素濃度最高，由此可知，增加乙醇濃度可以提高提取效率。

2.5.2?提取時間對葛根素提取率的影響?如表2、圖3所示，隨著提取時間的延長，葛根素的提取率75min達(dá)到最大值，隨后提取時間越長，提取率越低，這可能是由于在較長時間的加熱過程中部分葛根素被破壞所致。而前人同樣對不同提取時間下超聲法提取葛根素的提取率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)75min是最優(yōu)選擇。

2.5.3?提取溫度對葛根素提取率的影響?圖4表明，在?85?℃溫度時，葛根素的產(chǎn)率達(dá)到頂峰，這可能是由于升高溫度導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)的打開，從而提高葛根素的提取效率，也可能是在高溫下，溶劑粘度降低，擴(kuò)散系數(shù)增大，從而提高了提取效率。而在?90?℃時，葛根素的產(chǎn)率反而下降，這可能是高溫下葛根素的分解和燒焦所致。而前人同樣對不同溫度下超聲法提取葛根素的提取率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)?85?℃是最優(yōu)工藝條件。

2.5.4?固液比對葛根素提取率的影響?固液比是提高葛根素提取率的一個重要因素。一般來說，溶劑體積越大，提取率越高，然而較高的溶劑體積會使操作困難，導(dǎo)致不必要的浪費(fèi)。采用不同的固液比進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，以評價固液比的影響。從表4、圖5可以看出葛根素提取率在固液比1∶25時達(dá)到頂峰。

2.6?正交試驗(yàn)?對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析可得，極差最大的因素是乙醇濃度，葛根素濃度提取率最高的乙醇濃度為75%，這與單因素試驗(yàn)的結(jié)果一致，說明乙醇濃度的最佳選擇為75%;其次是提取溫度，根據(jù)上述結(jié)果，單因素試驗(yàn)確定在?85?℃時葛根素提取率最高，而由于各因素間的相互作用，正交試驗(yàn)最終決定采用?90?℃作為最佳提取溫度;再次是固液比，從單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出，葛根素提取率在固液比1∶20時達(dá)到頂峰，但同樣由于各因素間的相互作用，同時考慮到試驗(yàn)誤差的影響，最終選用1∶25為最佳固液比;極差最小的因素是提取時間，單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)一致得出了提取時間為?75min時提取效果最佳。綜上所述，在乙醇濃度為75%、提取溫度為?90?℃、固液比為?1∶25的條件下提取75min所得葛根素濃度最高，提取率最高。

2.7?驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?在最佳提取條件（即乙醇濃度為75%、提取溫度為?90?℃、固液比為1∶25、提取時間為75min）下，重復(fù)3次，所得結(jié)果見表6。

3?討論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法并計算K值與R值，結(jié)果表明影響葛根素提取效率的因素按值依次遞減為A>D>C>B，因此，當(dāng)乙醇濃度、提取時間、固液比、提取溫度分別為A2、B2、C3、D1（即75%、75min、1∶25、90℃）時，可獲得最高的葛根素濃度。

本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與前人超聲波輔助提取葛根黃酮的工藝進(jìn)行對比，研究發(fā)現(xiàn)，乙醇熱回流法提取葛根素的提取率比超聲法略高，但二者相比，乙醇熱回流法溶劑用量大，耗時長、能耗高、且由于經(jīng)常需要加熱處理，可能會造成原料的浪費(fèi)，操作難度大;而超聲法具有效率高、耗時短、雜質(zhì)少、溶劑用量少、成本低、綠色環(huán)保等特點(diǎn)，所以其在葛根等藥材提取的工業(yè)化生產(chǎn)上更加具有良好的應(yīng)用前景。

葛根藥理活性良好，毒副作用較少，其化學(xué)成分葛根素除了具有心肌保護(hù)作用和缺血再灌注損傷的保護(hù)作用外，還具有抗氧化、降血糖，降血壓及降血脂等作用[7-12]。因此葛根是一種發(fā)展?jié)摿薮蟮乃幬?，如何高效綠色，工業(yè)化的對葛根有效成分進(jìn)行提取成為當(dāng)今人們的熱門話題。本實(shí)驗(yàn)通過對乙醇熱回流法提取葛根素的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，同時與超聲法進(jìn)行對比，以期為其他葛根素提取研究提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2019-09-20?編輯：陶希睿）

基金項目：正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化葛根提取工藝研究（編號：201910132038）。

作者簡介：孫艷雪（1997-），女，漢族，碩士研究生，研究方向?yàn)榘邢蚣{米給藥系統(tǒng)及藥動學(xué)。E-mail：15147151825@163.com

通信作者：張燁（1986-），女，漢族，碩士，講師，研究方向?yàn)樗幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail：413173616@qq.com