張敏 陳晶晶 陳玉琳 楊帆 張澤林 門磊

【摘?要】?目的：建立反相高效液相色潽-雙波長法同時測定復(fù)方木雞顆粒中沒食子酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸和對香豆酸6種酚酸類成分的含量。方法：采用WondaSil?C18色譜柱?（4.6mm?×?250mm，5μm），以0.2%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）為流動相進行梯度洗脫，流速1.0mL·min-1，檢測波長為?254nm和?325nm，柱溫30?℃，進樣量10μL。結(jié)果：復(fù)方木雞顆粒6種酚酸類成分在各自的線性范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系（r≥?0.9990），平均加樣回收率、精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均符合有關(guān)規(guī)定。樣品中6種成分的平均含量在2.575～0.7668mg·g-1范圍內(nèi)。結(jié)論：試驗建立的含量測定方法符合方法學(xué)驗證要求，可用于復(fù)方木雞顆粒中6種酚酸類成分的同時測定，為復(fù)方木雞顆粒質(zhì)量評價提供新的參考。

【關(guān)鍵詞】?復(fù)方木雞顆粒;酚酸;含量測定

【中圖分類號】R284.1?【文獻標志碼】?A【文章編號】1007-8517（2019）23-0028-05

Simultaneous?Determination?of?Six?Phenolic?Acid?Constituents?in?Compound?Muji?Granules?by?HPLC

ZHANG?Min1?CHEN?Jingjing1?CHEN?Yulin1?YANG?Fan1?ZHANG?Zelin1?MEN?Lei1，?2*

1.?College?of?life?science，?Dalian?Minzu?University，?Dalian?100050，?China;2.?Key?Laboratory?of?Biotechnology?and?Bioresources?Utilization，?Ministry?of?Education，?（Dalian?Minzu?University），?Ministry?of?Education，?Dalian?116600，?China

Abstract：Objective?To?establish?and?validate?the?HPLC?method?for?simultaneous?determination?of?galic?acid，?vanilic?acid，?syringic?acid，?chlorogenic?acid，?coffeic?acid?and?p-coumaric?acid?in?compound?muji?granules.?Method?WondaSil?C18（250?mm×4.6?mm，5?μm）column?was?adopted?with?mobile?phase?consisting?of?0.2%?phosphoric?acid?（A）?and?methanol?（B）?in?gradient?elution.?The?flow?rate?was?1mL·min-1，?the?column?was?kept?at?30?℃，?and?the?detection?wavelength?was?260nm?and325?nm.?The?injection?volume?was?10μL.?Result?The?six?chemical?components?were?well?separated?and?with?good?linear?relationship?over?the?respective?range.?The?recoveries?were?between?95.3%～99.8%，?and?the?RSD?was?less?than?5.0%.?The?average?content?of?six?component?in?6?batches?compound?muji?granules?were?between?2.575μg·g-1?and?0.7668mg·g-1.?Conclusion?The?method?can?be?used?for?quality?control?of?compound?muji?granules.

Keywords：?Compound?Muji?Granules;?Phenolic?Acid;?HPLC

復(fù)方木雞顆粒是在民間藥方“木雞湯”的基礎(chǔ)上開發(fā)研制而成的顆粒劑，由云芝提取物、山豆根、菟絲子、核桃楸皮等藥材制成，具有治療肝炎、肝纖維化、肝癌的作用[1-3]。作為最具有代表性的滿族藥，復(fù)方木雞顆粒對肝病治療機制獨特，具有較大的研究價值。

復(fù)方木雞顆粒自上市以來，由于其能特異性地抑制甲胎蛋白（AFP）升高，為治療肝病開辟了一條新途徑，因而吸引了越來越多的的關(guān)注。動物實驗證明，復(fù)方木雞顆粒對化療藥物有明顯的減毒作用，且具有較強的抗癌活性，在臨床上可作為一種化療藥物的減毒手段和抗癌免疫增強劑，可明顯提高癌癥患者的治療效果[4-11]。復(fù)方木雞顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標準無含量測定項，有文獻分別對該制劑中苦參堿和金絲桃苷的含量進行檢測，但多成分含量測定方面未見有研究報道[4，6]。課題組在前期研究中已鑒定或推斷了復(fù)方木雞顆粒甲醇提取物中36種主要化學(xué)成分，且對其制劑中的多糖和生物堿成分進行了含量測定，本研究建立HPLC法?同時測定復(fù)方木雞顆粒中沒食子酸、香草酸、綠原酸、咖啡酸、丁香酸和對香豆酸6種成分含量的分析方法，并對不同批次復(fù)方木雞顆粒的質(zhì)量進行分析與評價，為復(fù)方木雞顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1?儀器與材料

1.1?儀器?島津LC2010A液相色譜儀（配有Class-VP工作站、在線脫氣機、輸液泵、自動進樣器、柱溫箱和紫外檢測器，日本島津公司）;KQ?2200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;ME104?萬分之一[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2?試藥?對照品香草酸（802B021）、咖啡酸（110B022）、對香豆酸（112B023）、丁香酸（C100-79561）、綠原酸（1211D022）購自北京索來寶科技有限公司，對照品沒食子酸（110780-201508）購于中國食品藥品檢定所，各對照品質(zhì)量分數(shù)均大于?98%。乙腈、甲醇和磷酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）;純凈水（杭州娃哈哈集團）。復(fù)方木雞顆粒由丹東藥業(yè)集團提供（批號170-101，170201，170202，170203，170303，170304）。

2?方法與結(jié)果

2.1?對照品儲備液的制備?精密稱取對照品沒食子酸、香草酸、綠原酸、丁香酸、咖啡酸和對香豆酸適量，精密稱定，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為2.001、1.030、1.080、1.050、0.204、0.025?g·L-1的混合對照品溶液。

2.2?供試品溶液的制備?取本品適量，研細，取粉末（過60目篩）約2.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，超聲30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，殘渣再次置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，超聲30min，放冷，濾過，合并兩次濾液置蒸發(fā)皿中，水浴揮干，殘渣加入甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3?色譜條件?采用WondaSil?C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以0.2%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）為流動相，洗脫梯度：0～15min，5%～20%?B;15～20min，20%～30%?B;20～40min，30%～40%?B;40～45min，40%～5%?B;45～50min，5%?B。流速1.0mL·min-1，檢測波長?254?nm和?325nm，柱溫?30?℃，進樣量?10μL。

2.4?系統(tǒng)適用性試驗?精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液0.5mL，甲醇稀釋定容至10mL，得沒食子酸100.0mg·L-1、香草酸52.50mg·L-1、咖啡酸10.2mg·L-1、丁香酸54.00g·L-1、綠原酸51.50mg·L-1、對香豆酸1.25mg·L-1的混合對照品溶液。分別精密吸取該對照品溶液和“2.2”項下供試品溶液10μL，按照“2.3”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。本實驗條件下所測得的6個成分與相鄰色譜峰的分離度良好，與其他組分分離完全，沒食子酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸和對香豆酸保留時間分別為11.3min、25.5min、27.0min、27.6min、28.8min和34.9min，色譜系統(tǒng)適用性實驗符合含量測定要求，色譜圖如圖1所示。

2.5?線性關(guān)系考察?精密吸取“2.1”項下對照品儲備液各?0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0mL，分別置10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成一系列濃度（1）的混合對照品溶液。按照“2.3”項下色譜條件進行測定，以各對照品質(zhì)量濃度（X，mg·L-1）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸，各成分回歸方程和線性范圍見表1。結(jié)果表明，6個成分在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。?將混合對照品溶液逐步稀釋，?分別以?S?/N?=?3?和?S?/N?=?10時各對照品的質(zhì)量濃度作為檢出限（?LOD）?和定量限（?LOQ），結(jié)果見表?1。

2.6?儀器精密度試驗?精密吸取供試品溶液（批號：170101）5μL，依“2.3”項下色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算沒食子酸、香草酸、丁香酸、綠原酸、咖啡酸和對香豆酸峰面積的RSD（n=6）分別為1.1%、0.46%、1.4%、1.5%、1.9%、0.74%、0.58%、1.1%、0.61%，表明儀器精密度良好。

2.7?重復(fù)性考察?取批號170101樣品粉末6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果沒食子酸、香草酸、丁香酸、綠原酸、咖啡酸和對香豆酸含量（n=6）分別為371.8、210.0、272.5、437.7、1.970、3.970mg·L-1，其RSD分別為0.84%、4.8%、4.5%、4.0%、4.9%、4.2%、2.1%，表明重復(fù)性良好。

2.8?供試品溶液穩(wěn)定性試驗?取同一份供試品溶液（批號：170101），分別于配制后0、6、12、24h進樣測定，結(jié)果沒食子酸、香草酸、丁香酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸峰面積的RSD（n=6）分別為1.8%、3.1%、2.7%、4.9%、4.2%、4.4%和3.1%，表明供試品溶液在?24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9?加樣回收率試驗?精密稱取已知含量的同一批次的復(fù)方木雞顆粒樣品（170101）?9份，每份1.0g。精密稱取沒食子酸、香草酸、丁香酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸對照品適量，加甲醇分別制成沒食子酸（0.8g·L-1）、香草酸（0.4g·L-1）、丁香酸（0.4g·L-1）、綠原酸（0.4g·L-1）、咖啡酸（0.008g·L-1）、對香豆酸（0.005g·L-1）的混合對照樣品。取0.8、1.0、1.2mL各3份，加入9份樣品中。按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3”項下的色譜條件進行含量測定，計算?6種成分的平均回收率及RSD，結(jié)果見表2。6種待測成分的平均回收率在95.3%～?99.8%，RSD?均小于5.0%，表明方法的準確度良好。

2.10?樣品含量測定?分別取不同批號的復(fù)方木雞顆粒按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，以外標法計算6個酚酸類成分的含量，結(jié)果見表3。

3?討論

復(fù)方木雞顆粒提取物中成分復(fù)雜，本實驗首先考察不同比例的甲醇和乙醇為提取溶劑，以及超聲和回流提取方法對方劑的提取效率，結(jié)果表明甲醇超聲提取兩次的各被測成分色譜峰峰面積最大，故采用甲醇溶液作為提取溶劑。

流動相的選擇：由于復(fù)方中藥材的化學(xué)成分復(fù)雜，故選擇梯度洗脫系統(tǒng)。被測成分均為有機酸類物質(zhì)，為了防止色譜峰拖尾，故在流動相中加入酸?？疾旒状?水、乙腈-水2種溶劑系統(tǒng)，以及流動相中加入不同比例的甲酸、乙酸、磷酸、醋酸銨的分離效果，結(jié)果顯示甲醇-0.2%磷酸水溶液系統(tǒng)基線平穩(wěn)，峰型較好，分離效果最佳。

波長的選擇：采用?DAD二極管陣列檢測器在200?～?400nm范圍內(nèi)掃描各對照品溶液的紫外吸收，沒食子酸、丁香酸和咖啡酸的最大吸收波長為270nm，香草酸為260nm，綠原酸為247nm和325nm，對香豆酸為313nm。為保證各待測成分能得到較好的響應(yīng)且分離效果最佳、干擾最少，最終選擇254nm為沒食子酸、香草酸和丁香酸的檢測波長;325nm為綠原酸、咖啡酸和對香豆酸的檢測波長。

復(fù)方木雞顆粒各味藥材化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有多糖、生物堿、酚酸類和黃酮類等成分。其中酚酸類成分藥理作用廣泛，如抗炎癥反應(yīng)、抑制血小板聚集、抗血栓、抗氧化、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等。前期研究中從復(fù)方木雞顆粒提取物中檢測到生理活性較強、含量較高的綠原酸、沒食子酸、丁香酸、對香豆酸和咖啡酸。為彌補現(xiàn)行方劑質(zhì)量標準的不足，本實驗篩選該6種酚酸類成分作為檢測指標，供試品含量測定的結(jié)果表明，10批復(fù)方中沒食子酸和綠原酸的含量質(zhì)量分數(shù)均值為0.08%，香草酸和丁香酸的含量質(zhì)量分數(shù)小于0.06%，咖啡酸和對香豆酸的含量質(zhì)量分數(shù)均不足0.001%。復(fù)方木雞顆粒中的酚酸類成分多來自核桃楸皮和菟絲子，咖啡酸和對香豆酸的含量不足0.001%，因此并不適用于復(fù)方木雞顆粒質(zhì)量的評價指標，而沒食子酸、綠原酸、香草酸和丁香酸的含量可用于該方劑的質(zhì)量控制。本研究基于雙波長法對復(fù)方木雞顆粒中6個酚酸類成分含量的同時測定，為復(fù)方木雞顆粒質(zhì)量評價提供新的參考。

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（收稿日期：2019-09-20?編輯：陶希睿）

基金項目：大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（?No.201812026201）。

作者簡介：張敏（1997-），女，本科在讀，研究方向為制藥工程。E-mail：838951104@qq.com

通信作者：門磊（1986-），女，博士，講師，研究方向為中西藥質(zhì)量控制和藥代動力學(xué)。E-mail：menlei@dlnu.edu.cn